Name: Visualizzazione della motilità batterica basata su una reazione cromatica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 44 s
Description: Impara il metodo TTC su agar semi-solido per rilevare la motilità batterica in Staphylococcus aureus ed Escherichia coli. Questo protocollo semplice e accessibile aiuta microbiologi clinici e ricercatori a studiare la patogenicità.

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Questo studio è stato supportato dal Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD) e dal Teaching Reform Research Project della China Pharmaceutical University (2019XJYB18).

1. Preparazione del mezzo semisolido
<ol><li>Agar semisolido tradizionale
	<ol><li>Preparare l'agar semisolido tradizionale secondo la ricetta del mezzo di prova della motilità batterica utilizzando gli ingredienti di base11. Sciogliere 10 g di triptosio, 15 g di NaCl, 4 g di agar in acqua distillata a sufficienza, regolare il pH a 7,2 ± 0,2 e portare il volume finale a 1.000 ml.</li>
		<li>Autoclavare l'agar a 121 °C per 20 minuti ed erogarlo in provette da 10 mL come mezzo semisolido alto 3 cm.</li>
	</ol></li>
	<li>Agar semisolido tradizionale con TTC
	<ol><li>Dopo aver sterilizzato in autoclave il mezzo semisolido convenzionale, raffreddarlo a 50 °C, aggiungere 5 ml di soluzione sterile di TTC all'1% a 100 ml di terreno, mescolare ed erogarlo in provette da 10 ml per formare un mezzo semisolido alto 3 cm.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Ceppi batterici
NOTA: Ottanta ceppi sono stati isolati dall'ambiente acquatico e identificati utilizzando uno strumento automatizzato di identificazione dei batteri (vedere la tabella dei materiali), tra cui Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp., Vibrio spp., Klebsiella pneumoniae e Aeromonas hydrophila (Tabella 1). Lo Staphylococcus aureus (vedi la tabella dei materiali) è stato usato come controllo non mobile negativo; Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Salmonella typhimurium (vedere la tabella dei materiali) sono stati utilizzati come ceppi di controllo positivo.
<ol><li>Identificare i ceppi batterici da utilizzare per l'analisi della motilità.</li>
	<li>Includere controlli non mobili negativi e ceppi di controllo positivi mobili.</li>
</ol>3. Osservazione della motilità batterica potenziata da TTC
<ol><li>Prelevare singole colonie di batteri in esame dalle piastre di agar e inocularle nei due mezzi semisolidi di cui sopra (fasi 1.1.2 e 1.2.1) mediante puntura con aghi inoculanti.</li>
	<li>Coltivare i tubi a 37 °C nell'incubatore per 24-48 ore per osservare i risultati.</li>
	<li>Osservare lo stato di crescita: caratterizzare i batteri come non mobili (-) se solo la linea di puntura è rossa. Caratterizzare i batteri come mobili (+) se il colore rosso si diffonde leggermente verso l'esterno lungo la linea di puntura12.</li>
</ol>4. Effetto di diverse concentrazioni di agar sulla motilità batterica
<ol><li>Preparare mezzi semisolidi contenenti 0,3%, 0,5% e 0,8% di agar e inocularli mediante foratura, come descritto sopra. Osservare i risultati dopo 24-48 ore di incubazione.</li>
</ol>

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<li>Lai, S. L., Hou, H., Jiang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+motility+and+its+role+during+initial+stage+of+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial motility and its role during initial stage of pathogenesis.</a> Journal of Microbiology. 26 (5), in Chinese 68-70 (2006).</li>
<li>Ding, S. S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+flagella-dependent+motility+and+biofilm+in+bacteria+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Microbiologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Relationship between flagella-dependent motility and biofilm in bacteria - A review.</a> Acta Microbiologica Sinica. 49 (4), in Chinese 417-422 (2009).</li>
<li>Zeng, J., Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+mechanism+of+bacterial+resistance+and+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the mechanism of bacterial resistance and tolerance.</a> Chinese Journal of Antibiotics. 45 (2), 113-121 (2020).</li>
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<li>Kühn, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+arrangement+of+several+flagellins+within+bacterial+flagella+improves+motility+in+different+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Spatial arrangement of several flagellins within bacterial flagella improves motility in different environments.</a> Nature Communication. 9 (1), 5369(2018).</li>
<li>Mitchell, A. J., Wimpenny, J. W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+agar+concentration+on+the+growth+and+morphology+of+submerged+colonies+of+motile+and+non-motile+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The effects of agar concentration on the growth and morphology of submerged colonies of motile and non-motile bacteria.</a> Journal of Applied Microbiology. 83 (1), 76-84 (2010).</li>
<li>Xu, A., Zhang, M., Du, W., Wang, D., Ma, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+mechanism+for+how+sigma+factor+AlgT+and+transcriptional+regulator+AmrZ+inhibit+twitching+motility+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A molecular mechanism for how sigma factor AlgT and transcriptional regulator AmrZ inhibit twitching motility in Pseudomonas aeruginosa.</a> Environmental Microbiology. 23 (2), 572-587 (2021).</li>
<li>Bartley, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+and+invasion+of+Neisseria+meningitidis+to+host+cells+is+related+to+surface+hydrophobicity%2C+bacterial+cell+size+and+capsule%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Attachment and invasion of Neisseria meningitidis to host cells is related to surface hydrophobicity, bacterial cell size and capsule.</a> PLoS One. 8, 55798(2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

La rilevazione della motilità batterica con il metodo del mezzo semisolido è influenzata da molti fattori13,14. Le condizioni di crescita batterica, come l'ossigeno (aerobico sulla superficie dell'agar, non aerobico sul fondo del tubo con il mezzo semisolido), il pH e la temperatura, possono influenzare la vitalità dei flagelli batterici, che possono portare a una ridotta motilità o addirittura alla perdita di motilità15. Inoltre, alcuni b...

La motilità batterica svolge un ruolo critico nella patogenicità batterica, nella formazione di biofilm e nella resistenza ai farmaci1. La motilità batterica è strettamente associata alla patogenicità ed è necessaria per la colonizzazione batterica durante l'infezione precoce delle cellule ospiti2. La formazione di biofilm è strettamente correlata alla motilità batterica, in cui i batteri aderiscono alla superficie dei mezzi solidi attraverso la motilità. La motilità batterica è stata a lungo considerata positivamente correlata con la formazione di biofilm. Un alto grado di resistenza batterica ai farmaci dovuto al biofilm può portare a infezioni persistenti che rappresentano una minaccia per la salute umana 3,4,5. Pertanto, è importante rilevare la motilità batterica. Il test di motilità batterica viene utilizzato principalmente per esaminare la motilità di diverse forme di batteri allo stato vivente, che possono determinare indirettamente la presenza o l'assenza di flagelli e, quindi, ha un ruolo importante nell'identificazione dei batteri.
Esistono metodi diretti e indiretti per rilevare la motilità batterica6. Poiché i batteri con flagelli mostrano motilità, è possibile rilevare se i batteri sono mobili indirettamente rilevando la presenza o l'assenza di flagelli. Ad esempio, è possibile rilevare la motilità indirettamente mediante microscopia elettronica e colorazione flagellare per indicare che i batteri sono mobili. È anche possibile rilevare con metodi diretti, come la caduta della sospensione e i metodi di puntura semisolida. 
Il metodo di puntura semisolida comunemente usato nei laboratori universitari di microbiologia per rilevare la motilità batterica inocula i batteri nella puntura nel mezzo di agar semisolido contenente 0,4-0,8% di agar, secondo la direzione della crescita batterica. Se i batteri crescono lungo la linea di puntura per diffondersi, appaiono tracce di crescita simili a nuvole (simili a pennelli), che indicano la presenza di flagelli e, quindi, di motilità. Se non ci sono tracce di crescita della linea di puntura, il batterio non è né flagellato né mobile. 
Tuttavia, questo metodo ha i suoi svantaggi: i batteri sono incolori e trasparenti, l'attività flagellare è influenzata dalle caratteristiche fisiologiche dei batteri viventi e da altri fattori, dalla concentrazione di agar e dal piccolo diametro della provetta. Inoltre, i batteri aerobici sono adatti solo per la crescita sulla superficie dell'agar, influenzando l'osservazione della motilità batterica. Quindi, per migliorare questo esperimento, il cloruro di 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) (incolore) è stato aggiunto al mezzo per stabilire un metodo più affidabile e intuitivo per determinare la motilità batterica rispetto all'attuale metodo di puntura diretta che utilizza deidrogenasi intracellulari per catalizzare la formazione di un prodotto rosso di TTC 7,8,9,10.

<table><tbody><tr><td>Bacto Agar</td><td>Difco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli</td><td>ATCC</td><td>ATCC25922</td><td>Controllo positivo</td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa</td><td>ATCC</td><td>ATCC27853</td><td>Controllo positivo</td></tr><tr><td>Salmonella typhimurium</td><td>ATCC</td><td>ATCC14028</td><td>Controllo positivo</td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus</td><td>ATCC</td><td>ATCC25923</td><td>Controllo non mobile negativo</td></tr><tr><td>Triptosio</td><td>&nbsp; OXOID</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TTC</td><td>Sigma</td><td>298-96-4</td><td></td></tr><tr><td>VITEK 2 sistema automatizzato di identificazione microbica</td><td>Bio M&eacute; Rieux</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualizzazione della motilità batterica basata su una reazione cromatica

Visualizing Bacterial Motility Based on a Color Reaction

La motilità batterica è cruciale per la patogenicità batterica, la formazione di biofilm e la resistenza ai farmaci. La motilità batterica è cruciale per l'invasione e/o la diffusione di molte specie patogene. Pertanto, è importante rilevare la motilità batterica. Le condizioni di crescita batterica, come ossigeno, pH e temperatura, possono influenzare la crescita batterica e l'espressione dei flagelli batterici. Ciò può portare a una ridotta motilità o addirittura alla perdita di motilità, con conseguente valutazione imprecisa della motilità batterica. Sulla base della reazione cromatica del cloruro di 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) da parte delle deidrogenasi intracellulari di batteri viventi, il TTC è stato aggiunto all'agar semisolido tradizionale per il rilevamento della motilità batterica. I risultati hanno mostrato che questo metodo di agar semisolido TTC per la rilevazione della motilità batterica è semplice, facile da usare e non coinvolge strumenti grandi e costosi. I risultati hanno anche mostrato che la motilità più alta è stata osservata nel mezzo semisolido preparato con agar allo 0,3%. Rispetto al tradizionale mezzo semisolido, i risultati sono più facili da valutare e più accurati.

Sia i ceppi standard che i ceppi isolati sono stati confrontati per il rilevamento della motilità e i risultati sono mostrati nella Tabella 1. A causa dell'assenza di flagelli, Staphylococcus aureus e Klebsiella pneumoniae sono cresciuti solo lungo la linea inoculata su terreni semisolidi tradizionali e TTC. Al contrario, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e Salmonella typhimurium hanno mostrato una crescita in tutte le direzioni attorno alla linea inocu...

Qui, presentiamo un protocollo per rilevare la motilità batterica basata su una reazione di colore. I principali vantaggi di questo metodo sono che è facile da valutare e più accurato e non richiede attrezzature specializzate.

Visualizzazione della motilità batterica basata su una reazione cromatica

Bacterial motility is crucial for bacterial pathogenicity, biofilm formation, and drug resistance. Bacterial motility is crucial for the invasion and/or ...

Il rilevamento della motilità batterica è importante perché la motilità è fondamentale per la patogenicità. Il protocollo qui descritto è un metodo affidabile per la rilevazione della motilità batterica, perché si basa sulla reazione cromatica del TTC con le deidrogenasi intracellulari di batteri viventi. Il metodo di agar semi-solido TTC per rilevare la motilità batterica è semplice, facile da usare e non richiede l'utilizzo di strumenti grandi e costosi.Il metodo può essere utilizzato da microbiologi clinici o ricercatori per studiare i batteri patogeni. A dimostrare la procedura sarà Xiyi Zhuang, uno sperimentatore senior del mio laboratorio. Per iniziare, preparare il tradizionale terreno semisolido aggiungendo 10 grammi di triptosio, 15 grammi di cloruro di sodio e quattro grammi di agar agar in un volume adeguato di acqua distillata.Regolare il pH a 7,2 e portare il volume finale a 1.000 millilitri. Autoclavare il terreno a 121 gradi Celsius per 20 minuti ed erogare il terreno in provette da 10 millilitri a un'altezza di tre centimetri. Per preparare il terreno TTC, raffreddare il terreno tradizionale autoclavato a 50 gradi Celsius, quindi aggiungere cinque millilitri di solu

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