Imaging chimico multiplex basato sulla microscopia a dispersione Raman stimolata a banda larga

Presentiamo un protocollo per acquisire immagini chimiche con microscopia a diffusione Raman stimolata a banda larga (SRS). Basato su un microscopio SRS che opera con rilevamento differenziale multicanale-lock-in, il protocollo descrive la preparazione del campione, la regolazione dell'apparato SRS e la chemiometria per districare diversi costituenti di campioni chimicamente eterogenei.

Il nostro protocollo descrive come costruire una microscopia a dispersione Raman stimolata, che consente la misurazione dello spettro vibrazionale delle molecole in microsecondi. E quando applicato all'imaging, può fornire microscopia iperspettrale per localizzare e quantificare i costituenti chimici della materia in modo privo di etichette e non invasivo. Ci sono diverse applicazioni di questo protocollo, principalmente nelle scienze biologiche e biomediche.

Ad esempio, per l'immagine di cellule o tessuti. Ci sono due sfide importanti per il nostro approccio, la sorgente ottica a banda larga e la catena di rilevamento. Per affrontare il primo, è possibile acquistare un OPR o costruirne uno da soli.

In alternativa, si può utilizzare il supercontinuo a luce bianca generato in cristalli sfusi o in fibre ottiche non lineari. Quest'ultima sfida può essere affrontata scansionando sequenzialmente ogni componente spettrale con un fotodiodo commerciale e uno scanner galvo Per iniziare, estrarre due microlitri da una sospensione acquosa di polimetilmetacrilato o microsfere di PMMA e versare la sospensione su un coperchio del microscopio. Quindi, estrarre due microlitri da una sospensione acquosa di microsfere di polistirene e combinarla con la sospensione in PMMA sullo slittamento del coperchio.

Mescolare delicatamente la sospensione con una punta a pipetta e lasciarla asciugare per 24 ore. Uno strato bianco di perline apparirà sopra la copertura scivolare quando l'acqua si asciuga. Aggiungere 20 microlitri di dimetilsolfossido e 20 microlitri di olio d'oliva puro sopra lo slip di copertura.

E applicare lo smalto sui bordi del secondo coperchio del microscopio. Posizionare il coperchio scivolare sulla miscela, con lo smalto rivolto verso il basso, e applicare una pressione sufficiente per sigillarlo. Lasciare asciugare.

Ottimizzare l'efficienza di modulazione del fascio stokes a banda stretta. Modificare la distanza tra gli obiettivi F1 e F2 e misurare il fascio modulato con un fotodiodo. Quindi, registra il suo profilo con un oscilloscopio.

Regolare la lunghezza della cavità dell'oscillatore parametrico ottico in modo tale che lo spettro della pompa a banda larga risultante, insieme allo Stokes a banda stretta a 1040 nanometri, possa produrre una disaggregazione della frequenza entro 2.800-3.100 centimetri inversi. Questo intervallo spettrale copre le vibrazioni della regione di allungamento CH. Inviare la pompa a banda larga a un compressore prismatico per compensare gli effetti di dispersione inclusi nell'obiettivo del microscopio di eccitazione.

Immettere la pompa nel prisma A, attraverso il suo apice, e guidare la pompa dispersa verso l'apice del prisma B.Definire la quantità di dispersione negativa necessaria e impostare la distanza tra gli apici dei prismi di conseguenza. Utilizzare prismi tagliati Brewster e assicurarsi che la polarizzazione del fascio della pompa si trovi all'interno dei piani triangolari dei prismi. Per ottimizzare lo schema di rilevamento bilanciato in linea, impostare l'asse veloce di questo cristallo birifrangente verticale e guidare la pompa polarizzata su una piastra YV04 con una lunghezza di 13,3 millimetri.

Quindi, utilizzare una piastra a mezza onda per impostare la polarizzazione del fascio della pompa a 45 gradi. Combina la pompa e le travi Stokes con uno specchio dicroico e allineale con cura con un paio di fori fluorescenti. Assicurarsi che entrambe le travi si propaghino in modo co-lineare.

Attenuare i raggi e guidarli su un fotodiodo veloce per sovrapporli temporaneamente. Successivamente, rimuovere il fotodiodo. Quindi, misurare i profili del fascio con una telecamera calibrata e utilizzare una scheda a infrarossi per stimare i diametri a occhio.

Usa due telescopi. Uno per la pompa e un altro per il raggio di Stokes, e cercare di abbinare i diametri del fascio all'apertura posteriore dell'obiettivo di eccitazione. Una volta ottenuto lo scattering Raman stimolato, o segnale SRS, utilizzare il telescopio sul fascio della pompa per modificarne il diametro, variando la gamma di Rayleigh e, di conseguenza, il volume di interazione al fuoco del microscopio.

Fermarsi quando viene raggiunto il massimo SRS. Utilizzare un fotodiodo per misurare l'intensità del fascio della pompa e, con la responsività del fotodiodo, calcolare la potenza media che influisce sull'area attiva del rilevatore. Per misurare il rumore di intensità relativa del laser, scollegare il filtro passa-basso e collegare l'uscita di un fotodiodo ad alta larghezza di banda all'ingresso di un amplificatore lock-in.

Memorizza l'uscita lock-in in volt sulla radice quadrata di Hertz a diverse frequenze di demodulazione e usa la responsività dei fotodiodi per convertire i volt in Watt. Guidare la pompa e i fasci di Stokes al microscopio. Posiziona il campione e trova una regione senza perline per aiutare ad allineare il raggio della pompa.

Quindi, rendi confocali gli obiettivi di eccitazione e raccolta. Mettere un filtro shortpass per rimuovere lo Stokes modulato e guidare il fascio della pompa verso la classificazione. Posizionare una lente dopo la classificazione per focalizzare il raggio disperso sui rilevatori.

Per un rilevamento bilanciato, misurare lo spettro del riferimento e le repliche del segnale che si propagano lungo il fascio della pompa. Posizionare una piccola fessura, o un diaframma, tra il grading e uno splitter a fascio polarizzatore, per garantire la corrispondenza spettrale tra i due array di fotodiodi e per filtrare spazialmente la pompa dispersa. Ritaglia tutti i componenti spettrali tranne uno delle repliche della pompa per centrare i raggi trasmessi sul rivelatore Nth degli array di fotodiodi di riferimento e di segnale.

Utilizzare gli specchietti retrovisori per regolare la correlazione dei diversi canali di rilevamento. Per avviare la microscopia SRS: modulare lo Stokes, la scansione raster del campione e acquisire il trasferimento di modulazione sullo spettro della pompa con il corrispondente spettro DC per ottenere lo spettro SRS normalizzato da ciascun pixel. Produrre matrici tridimensionali, le cui righe e colonne contengono le posizioni scansionate del campione.

Su ogni vettore ortogonale al piano XY, memorizzare uno spettro SRS. Tracciare la concentrazione e i profili spettrali per acquisire le immagini chimiche e gli spettri caratteristici dei costituenti chimici del campione. L'immagine rappresentativa mostra gli spettri di rumore di intensità relativa delle sorgenti ottiche utilizzate in questo protocollo.

Qui è mostrata la migliore regione spettrale per gli esperimenti SRS. La modulazione del fascio stokes a qualsiasi frequenza all'interno di questa banda garantisce che gli effetti del rumore laser sul segnale SRS saranno i più bassi possibili. Qui vengono mostrati dati esemplari degli spettri sbilanciati e bilanciati.

Gli effetti del rilevamento bilanciato influiscono sui risultati finali degli esperimenti. Vale a dire, le mappe chimiche. Le immagini composite nelle condizioni sbilanciate e bilanciate sono mostrate qui.

Le immagini rappresentative mostrano un'analisi chemiometrica dei dati SRS iperspettrali. Un composito delle mappe di concentrazione dei diversi costituenti chimici del campione e dei loro spettri SRS caratteristici sono mostrati qui. Da questi dati, i diversi costituenti del campione, ad esempio l'olio d'oliva, il polistirene DMSO e il polimetilmetacrilato possono essere facilmente identificati.

Attualmente, la nostra tecnica può sondare solo lo stretching delle vibrazioni CH. Tuttavia, ottimizzando la sorgente ottica, la stessa catena di rilevamento ci consentirà di esplorare la regione di impronte digitali più informativa rilevando diverse modalità contemporaneamente. La nostra catena di rilevamento apre la strada all'integrazione della banda larga SRS nelle cliniche, introducendo una tecnologia che completerà e migliorerà il tradizionale flusso di lavoro istopatologico per la diagnosi dei tessuti.