Purificazione e identificazione di proteine specifiche per tipo cellulare da tessuti complessi utilizzando una linea murina di topo di metionina tRNA sintetasi mutante
13 aprile 2022
Questo protocollo descrive come eseguire la marcatura proteica specifica del tipo di cellula con azidonorleucina (ANL) utilizzando una linea murina che esprime una sintetasi tRNA mutante L274G-Metionina (MetRS*) e i passaggi necessari per l'isolamento delle proteine marcate specifiche del tipo di cellula. Descriviamo due possibili vie di somministrazione di ANL in topi vivi mediante (1) acqua potabile e (2) iniezioni intraperitoneali.
Questo protocollo consente di marcare le proteine in modo specifico per un tipo di cellula. Questa è la prima tecnica che offre tale possibilità e può essere eseguita in vitro o in vivo. Il vantaggio principale della tecnica è che le proteine specifiche del tipo di cellula marcate possono essere purificate non identificate o visualizzate in situ mediante immunofluorescente.
Per iniziare preparare il lisato tissutale aggiungendo tampone di lisi ad un volume da 12 a 15 volte il peso umido del tessuto e triturare il tessuto fino a quando non è omogeneizzato. Riscaldare questo omogenato per 15 minuti a 75 gradi Celsius per denaturare la proteina, quindi centrifugare il campione e trasferire il surnatante in una nuova provetta. Questo campione può essere memorizzato a meno 80 gradi Celsius.
Successivamente, per l'alchilazione, diluire il campione omogeneizzato due o tre volte in tampone salino fosfato contenente un inibitore della proteasi privo di EDTA. Quindi aggiungere iodoacetamide appena preparato a una concentrazione finale di 20 millimoli. Lasciare il campione per una o due ore a 20 gradi Celsius al buio.
Ripetere l'aggiunta di iodoacetamide e le fasi di incubazione due volte. Preparare la colonna secondo le istruzioni del produttore facendo prima vortice le colonne. Quindi rimuovendo il coperchio tagliando la parte inferiore e centrifugandoli.
Quindi, eseguire uno scambio di buffer bilanciando prima le colonne di scambio del buffer utilizzando il buffer di scambio della chimica dei clic e quindi scambiando tutti i campioni alchilati. Per valutare l'incorporazione di azidonorleucina prendere 40 microlitri del campione alluso e aggiungere tampone salino fosfato ad un volume finale di 120 microlitri. Quindi impostare la reazione chimica del clic facendo vortice la reazione per 20 secondi.
Dopo aver aggiunto ciascun reagente nell'ordine indicato il più velocemente possibile, incubare i campioni al buio a quattro gradi Celsius durante la notte con rotazione continua. Il giorno seguente centrifugare i campioni per cinque minuti a 17.000 volte G dopo la centrifugazione sarà visibile un pellet leggermente turchese. Trasferire il surnatante in una nuova provetta e conservare il campione a meno 80 gradi Celsius.
Per la purificazione delle proteine marcate. Sottoporre tutti i campioni ad una procedura di scambio tampone come dimostrato per pulire gli avanzi di alchine libero usando tampone legante la neutravidina come tampone di equilibrio. Quindi lavare le sfere ad alta capacità di neutravidina tre volte mescolando le perle con il tampone legante.
Centrifugare la miscela, scartare il surnatante e ripetere questa operazione tre volte. Quindi preparare un impasto one-to-one aggiungendo lo stesso volume di sfere secche di neutravidina e tampone legante la neutravidina. Mettere da parte da 20 a 40 microlitri di ciascun campione come lisato prepurificato e conservarlo a meno 20 gradi Celsius.
Dopo aver misurato la concentrazione proteica del campione, mescolare un milligrammo di proteine con 40 microlitri di liquame di perline. Incubare la miscela durante la notte a quattro gradi Celsius con rotazione continua che consente alle proteine marcate di legarsi alle perle. Il giorno seguente raccogliere il surnatante mediante centrifugazione.
Mettere da parte un'aliquota da 20 a 40 microlitri del surnatante per un'analisi successiva e congelare il resto a meno 80 gradi Celsius. Quindi, lavare le perle tre volte aggiungendo il tampone di lavaggio per neutravidina raffreddato. Sedimentare le perle e scartare il surnatante.
Quindi aggiungere lo stesso tampone e incubare le perle per 10 minuti sotto rotazione continua a quattro gradi Celsius prima di scartare il surnatante. Ripetere il lavaggio con tamponi di lavaggio della neutravidina due e tre ed eluire le proteine cliccate incubando le perle per 30 minuti a 20 gradi Celsius con un volume di tampone di eluizione della neutravidina, corrispondente a un volume delle sfere secche utilizzate. Durante l'eluizione, mantenere le perle in sospensione a 1000 giri al minuto in uno shaker termoblocco eludere due volte e unire entrambe le eluizioni.
Le reazioni di clic sono state analizzate dalla pagina SDS e dall'immunoblot occidentale. Immagini rappresentative degli esperimenti sono mostrate per la somministrazione di azidonorleucina mediante iniezione intraperitoneale e per la somministrazione di azidonorleucina tramite acqua potabile. Un ulteriore esperimento fornisce un esempio per la determinazione della concentrazione ottimale di alchine disolfuro biotina.
In questo esempio, la variazione di piega tra il campione marcato e il controllo è più alta a 14 concentrazioni di alchine micromolari. Un esempio di risultato della spettrometria di massa con un chiaro arricchimento nel campione marcato con azidonorleucina rispetto al controllo è mostrato qui. Questa differenza era già visibile nella colorazione proteica totale.
Oltre ai cambiamenti nell'intensità dei peptidi, ci sono anche proteine uniche trovate in entrambi i campioni. Si tratta di un protocollo tecnicamente complesso ed è un passaggio che deve essere seguito attentamente utilizzando opportuni controlli negativi alchilazione, corretta (indistinta) e adeguata pulizia dell'archivio non click. I nostri passaggi chiave in questo protocollo, le proteine purificate possono essere identificate mediante spettrometria di massa se l'interesse dei ricercatori è studiare le proteine o caricarlo in un gel per studiare le proteine di interesse per western blot.
La capacità di questo metodo di marcare le proteine da una specifica origine cellulare ha molte applicazioni come la tensione delle proteine o lo studio della sintesi proteica in vitro o in vivo.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un approccio innovativo per l'etichettatura proteica specifica per tipo di cellula utilizzando l'azidonorleucina (ANL) con un modello di topo che esprime una sintetasi di tRNA della metionina L274G mutante (MetRS*). La tecnica consente l'etichettatura, la purificazione e la visualizzazione di proteine in vitro e in vivo, facilitando lo studio della sintesi proteica e della funzione cellulare.
Componenti principali dello studio
Area di scienza
- Neuroscienza
- Biologia cellulare
- Chimica delle proteine
Contesto
- Questo protocollo consente l'etichettatura selettiva di proteine specifiche per determinati tipi di cellule.
- Dimostra include applicazioni sia in vitro che in vivo.
- L'uso dell'azidonorleucina rappresenta un progresso nelle tecniche di etichettatura delle proteine.
- L'immunofluorescenza può essere utilizzata per visualizzare le proteine etichettate.
Obiettivo dello studio
- Stabilire un metodo per isolare proteine specifiche per tipo di cellula.
- Fornire passaggi dettagliati per l'etichettatura e la purificazione delle proteine.
- Migliorare l'analisi della sintesi proteica in vari contesti cellulari.
Metodi utilizzati
- Lo studio coinvolge un modello di topo che esprime MetRS* per l'etichettatura delle proteine.
- I passaggi dettagliati includono la preparazione del lisato tissutale, l'alchilazione e le procedure di purificazione utilizzando perle neutravidin.
- Sono impiegate reazioni di click chemistry per valutare l'incorporazione dell'azidonorleucina.
- Vengono descritti i protocolli per entrambe le vie di somministrazione di ANL tramite acqua potabile e intraperitoneale.
Risultati principali
- L'etichettatura proteica di successo è stata dimostrata attraverso varie tecniche di purificazione.
- È stata osservata una chiara distinzione nei campioni etichettati, indicando un'efficace incorporazione dell'azidonorleucina.
- I risultati chiave includono l'identificazione di proteine uniche possibilmente legate ai processi biologici in studio.
- Il protocollo enfatizza controlli rigorosi ed esecuzione attenta per garantire l'affidabilità.
Conclusioni
- Questo studio fornisce un protocollo unico e complesso per studiare proteine specifiche per tipo di cellula.
- La capacità di etichettare le proteine offre preziose informazioni sui meccanismi cellulari e sulla sintesi proteica.
- I risultati possono far progredire la nostra comprensione di varie funzioni biologiche e modelli di malattia.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Cell-type-specific protein labeling and purification using the MetRS* mouse line enables precise interrogation of proteomic changes within complex tissues, supporting mechanistic de-risking and target validation in early discovery. This approach reduces sample complexity, allowing for the identification of subtle proteomic shifts relevant to disease and therapeutic intervention. The method enhances predictive confidence at critical inflection points in the discovery pipeline by enabling direct measurement of newly synthesized proteins in defined cellular populations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct assessment of protein synthesis dynamics in specific cell types within heterogeneous tissues.
- Supports functional target validation by isolating proteomic changes linked to genetic or pharmacological perturbations.
- Facilitates mechanistic de-risking by clarifying cell-type contributions to disease-relevant pathways.
- Improves predictive confidence for target engagement and downstream biological effects.
Screening & Assay Development
- Provides validated, cell-type-specific proteomes for downstream assay development and screening workflows.
- Enables quantitative and reproducible measurement of newly synthesized proteins for assay standardization.
- Supports scalability and platform reuse by allowing both in vitro and in vivo applications.
- Improves reliability of compound evaluation by reducing background from non-target cell types.
Translational & Preclinical Research
- Aligns proteomic outputs with disease-relevant cellular populations for translational biomarker discovery.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by tracking protein synthesis in vivo.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing cell-type-resolved proteomic data.
- Enhances predictive de-risking for translational research by clarifying cellular mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification and preclinical research, providing a reusable platform for cell-type-specific proteomic analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling selective protein labeling in defined cell populations.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative proteomic outputs for assay readiness and compound screening.
- Analytics: Provides mass spectrometry and immunoblot readouts to compare proteomic profiles across experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery-stage findings to preclinical models by enabling in vivo protein synthesis tracking.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable workflow for repeated use across diverse research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable proteomic workflows.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying cell-type-specific effects.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in proteomics, mouse genetics, and click chemistry techniques.
- Demands access to mass spectrometry, immunoblotting, and specialized labeling reagents.
- Necessitates rigorous cross-team standardization and negative controls to ensure data reliability.
- May require adaptation for different tissue types or model systems based on cellular complexity.
- Technical complexity and need for careful execution are critical for reproducible results.
