Name: Estrazione su piccola scala di Caenorhabditis elegans DNA genomico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Scopri un metodo rapido ed economico per estrarre DNA genomico da Caenorhabditis elegans utilizzando kit commerciali e termociclatore. Questo protocollo è ideale per applicazioni PCR in ambito didattico e di ricerca.

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Il ceppo N2 e i batteri E. coli OP50 sono stati ottenuti dal Caenorhabditis Genetics Center (CGC), finanziato dal NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Il ceppo blmp-1(tm548) è stato ottenuto dal National Bioresource Project, Giappone. Gli autori ringraziano WormBase. Questo lavoro è stato supportato da NIH R01GM097591 a T.L.G., finanziamenti interni dalla Texas Woman's University a T.L.G e dal Center for Student Research di TWU a M.F.L.

1. Manutenzione di C. elegans
NOTA: I ceppi N2 (wild type) e blmp-1(tm548) C. elegans sono stati mantenuti su piastre standard di nematodi (NGM) a 20 °C.
<ol><li>Preparare le piastre NGM sciogliendo 23,005 g di polvere NGM in 973 ml di acqua in un pallone da 2 L. Coprire l'apertura del pallone con un foglio di alluminio (o tappo autoclavabile che consente lo sfiato) e fissare il rivestimento con nastro adesivo. Autoclave per sciogliere la polvere e sterilizzare il contenuto con un ciclo di sterilizzazione di almeno 30 min.</li>
	<li>Raffreddare il mezzo a 60 °C a bagnomaria.</li>
	<li>Al mezzo raffreddato, aggiungere 25 mL di tampone sterile fosfato 1 M (KH2PO4), pH 6,0; 1 mL di soluzione di cloruro di calcio 1 M; e 1 mL di 1 M di soluzione di solfato di magnesio.</li>
	<li>Mescolare il mezzo su una piastra magnetica per ottenere una miscela omogenea e per evitare raffreddamenti e solidificazioni irregolari (~ 5 min). Assicurarsi che la barra di agitazione giri abbastanza velocemente da creare un vortice ma non così velocemente da introdurre bolle (~ 250-300 giri / min).</li>
	<li>Versare ~ 25 ml del mezzo in ogni piastra di Petri da 10 cm (~ 40 piastre in totale). Asciugare le piastre a temperatura ambiente durante la notte (tipicamente 16-25 °C).</li>
	<li>Coltivare una colonia di Escherichia coli OP50 in 30-50 ml di brodo LB durante la notte a 37 °C.</li>
	<li>Seminare ogni piastra con 500 μL di coltura di E. coli OP50 e lasciarli asciugare a temperatura ambiente prima dell'uso (tipicamente 16-25 °C)8. Conservare i piatti a 4 °C per un massimo di 3 settimane.</li>
	<li>Trasferire C. elegans in piastre seminate utilizzando un raccoglitore di filo o un altro metodo e lasciarli crescere fino allo stadio L4 o adulto alla temperatura richiesta per il ceppo (in genere 16-25 °C, 1-2 giorni se gli animali sono stati placcati affamati come dauers, 3-4 giorni se gli animali sono stati placcati come embrioni)8.</li>
</ol>2. Estrazione del DNA a verme singolo
NOTA: Questo metodo è utile per estrarre il DNA da un singolo verme (un verme in 1,8 μL di volume totale). Un master mix può essere fatto se più worm saranno lisati contemporaneamente.
<ol><li>Programmare un termociclatore per un ciclo a 55 °C per 10 minuti seguito da 95 °C per 3 minuti (programma di lisi).</li>
	<li>Aliquota 0,8 μL della soluzione di estrazione dal kit sulla parete interna di un tubo PCR da 0,2 mL su ghiaccio. Aggiungere 0,2 μL della soluzione di preparazione del tessuto dal kit alla goccia della soluzione di estrazione. Mescolare per pipettaggio.</li>
	<li>Identificare un animale L4 o adulto sotto un microscopio di dissezione9. Per identificare gli ermafroditi L4, cerca una vulva caratteristica che è visibile come un semicerchio pallido nel mezzo dell'animale. Identifica gli ermafroditi adulti cercando gli animali più grandi sulla piastra che possono avere embrioni ovali visibili nel loro utero.</li>
	<li>Utilizzando un plettro in filo di platino, trasferire l'animale selezionato nella soluzione10.</li>
	<li>Centrifugare brevemente il tubo (2-3 s, ≤6.000 giri/min/2.000 × g) a temperatura ambiente per raccogliere il contenuto sul fondo del tubo.</li>
	<li>Posizionare il tubo nel termociclatore ed eseguire il programma di lisi impostato al punto 2.1.</li>
	<li>Quando il programma è completo, centrifugare brevemente il tubo e metterlo sul ghiaccio. Aggiungere 0,8 μL della soluzione di neutralizzazione dal kit alla miscela. Mescolare per pipettaggio.</li>
	<li>Centrifugare brevemente il tubo a temperatura ambiente (2-3 s, ≤6.000 giri/min/2.000 × g).</li>
	<li>Utilizzare direttamente il lisato per la PCR o conservarlo a 4 °C o -20 °C per un uso futuro. NOTA: Il DNA estratto è stabile a 4 °C o -20 °C per almeno 6 mesi7.</li>
</ol>3. Estrazione del DNA di alcuni individui
NOTA: Questo metodo è utile per estrarre il DNA da alcuni vermi. Un mix master può essere preparato se più ceppi verranno lisati contemporaneamente.
<ol><li>Programmare il termociclatore per un ciclo a 55 °C per 10 min seguito da 95 °C per 3 min (programma di lisi).</li>
	<li>Aliquota 2,0 μL della soluzione di estrazione dal kit sulla parete interna di un tubo PCR da 0,2 mL su ghiaccio. Aggiungere 0,5 μL della soluzione di preparazione del tessuto dal kit alla goccia di soluzione di estrazione. Mescolare per pipettaggio.</li>
	<li>Identificare L4 o animali adulti sotto un microscopio di dissezione9. Gli ermafroditi L4 hanno una caratteristica vulva che è visibile come un semicerchio pallido nel mezzo dell'animale. Gli ermafroditi adulti sono gli animali più grandi sul piatto e possono avere embrioni ovali visibili nel loro utero.</li>
	<li>Usando un plettro di platino, trasferisci alcuni animali nella soluzione: 9 animali producono 1 equivalente animale di DNA genomico per 0,5 μL di lisato e 16 animali producono ~ 1 equivalente animale di DNA genomico in 0,25 μL (3,5 nematodi / μL) 10. NOTA: è difficile trasferire più di 16 animali in questo volume.</li>
	<li>Centrifugare brevemente il tubo a temperatura ambiente (2-3 s, ≤6.000 giri/min/2.000 × g).</li>
	<li>Posizionare il tubo nel termociclatore ed eseguire il programma di lisi impostato al punto 3.1.</li>
	<li>Quando il programma è completo, centrifugare brevemente il tubo e metterlo sul ghiaccio. Aggiungere 2 μL della soluzione di neutralizzazione dal kit alla miscela. Mescolare per pipettaggio.</li>
	<li>Centrifugare brevemente il tubo a temperatura ambiente (2-3 s, ≤6.000 giri/min/2.000 × g).</li>
	<li>Utilizzare direttamente la lisi per la PCR o conservarla a 4 °C o -20 °C per un uso futuro. NOTA: Il DNA estratto è stabile a 4 °C o -20 °C per almeno 6 mesi7.</li>
</ol>4. Reazione PCR
NOTA: viene descritta un'applicazione a valle di questa tecnica di lisi del verme, che rileva una mutazione di delezione utilizzando una polimerasi veloce. Viene anche dimostrata l'efficacia dei due protocolli di lisi dei vermi nella produzione di DNA modello genomico per una PCR di successo a diluizioni a 1/50 di un verme per reazione.
<ol><li>Estrarre il DNA da un singolo verme e 16 vermi utilizzando N2 wild-type e ceppi mutanti, come descritto sopra nella fase 2 e nella fase 3.</li>
	<li>Preparare diluizioni di 2, 10, 20 e 50 volte del DNA di un singolo verme da animali N2 selvatici.</li>
	<li>Impostare le reazioni PCR seguendo il protocollo del produttore utilizzando primer specifici per la sequenza di interesse e la miscela master PCR a caldo (Tabella 1 e Tabella 2). Utilizzare 1 μL di DNA non diluito o 2 μL di DNA diluito come modello in ogni reazione.</li>
	<li>Confermare i prodotti PCR mediante elettroforesi su gel e imaging11.</li>
</ol>

<ol><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transparent+window+into+biology%3A+A+on+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">A transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans.</a> WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook 1-31 (2015).</li>
<li>Page, A. P., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cuticle%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">The cuticle.</a> WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook (2007).</li>
<li>Williams, B. D., Schrank, B., Huynh, C., Shownkeen, R., Waterston, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+mapping+system+in+Caenorhabditis+elegans+based+on+polymorphic+sequence-tagged+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A genetic mapping system in Caenorhabditis elegans based on polymorphic sequence-tagged sites.</a> Genetics. 131, 609-624 (1992).</li>
<li>Lissemore, J. L., Lackner, L. L., Fedoriw, G. D., De Stasio, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Caenorhabditis+elegans+genomic+DNA+and+detection+of+deletions+in+the+unc-93+gene+using+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">Isolation of Caenorhabditis elegans genomic DNA and detection of deletions in the unc-93 gene using PCR.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 33, 219-226 (2005).</li>
<li>Fay, D., Bender, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNPs%3A+introduction+and+two-point+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">SNPs: introduction and two-point mapping.</a> WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook 1-10 (2008).</li>
<li>Biron, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBiron%2C+D+%22C.+elegans%3A+Methods+and+Applications%22">C. elegans: Methods and Applications</a>. Haspel, G. , Humana Press. Totowa, NJ. (2015).</li>
<li>Sigma-Aldrich. Extract-N-Amp Tissue PCR Kit technical bulletin. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/249/244/xnat2bul.pdf">https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/249/244/xnat2bul.pdf</a> (2013).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , ed. The C. Elegans Research Community, Wormbook (2006).</li>
<li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1152(2009).</li>
<li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+worm+lab%3A+from+culturing+worms+to+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2293(2011).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3923(2012).</li>
<li>Gumienny, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+SMA-10%2FLRIG+is+a+conserved+transmembrane+protein+that+enhances+bone+morphogenetic+protein+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans SMA-10/LRIG is a conserved transmembrane protein that enhances bone morphogenetic protein signaling.</a> PLoS Genetics. 6, 1000963(2010).</li>
<li>Nelson, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bow-tie+genetic+architecture+for+morphogenesis+suggested+by+a+genome-wide+RNAi+screen+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A bow-tie genetic architecture for morphogenesis suggested by a genome-wide RNAi screen in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 7, 1002010(2011).</li>
<li>Zhang, L., Zhou, D., Li, S., Jin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLMP-1+contributes+to+collagen-related+morphogenesis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science+Journal%22%5BJournal%5D)">BLMP-1 contributes to collagen-related morphogenesis in C. elegans.</a> Life Science Journal. 9, 1080-1088 (2012).</li>
<li>Horn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DRE-1%2FFBXO11-dependent+degradation+of+BLMP-1%2FBLIMP-1+governs+C.+elegans+developmental+timing+and+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">DRE-1/FBXO11-dependent degradation of BLMP-1/BLIMP-1 governs C. elegans developmental timing and maturation.</a> Developmental Cell. 28, 697-710 (2014).</li>
<li>Huang, T. -F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLMP-1%2FBlimp-1+regulates+the+spatiotemporal+cell+migration+pattern+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">BLMP-1/Blimp-1 regulates the spatiotemporal cell migration pattern in C. elegans.</a> PLoS Genetics. 10, 1004428(2014).</li>
<li>Lakdawala, M. F., Madhu, B., Faure, L., Vora, M., Padgett, R. W., Gumienny, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+interactions+between+the+DBL-1%2FBMP-like+pathway+and+dpy+body+size-associated+genes+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic interactions between the DBL-1/BMP-like pathway and dpy body size-associated genes in Caenorhabditis elegans.</a> Molecular Biology of the Cell. 30, 3151-3160 (2019).</li>
<li>Madeira, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+EMBL-EBI+search+and+sequence+analysis+tools+APIs+in+2019%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019.</a> Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Determinare i genotipi di C. elegans è un passo importante durante l'esecuzione di incroci genetici per creare nuovi ceppi di C. elegans . L'estrazione del DNA genomico utilizzando una o poche C. elegans è un passo cruciale nella genotipizzazione di C. elegans. Questo protocollo descrive l'estrazione del DNA genomico da C. elegans utilizzando un kit commerciale. Questo metodo è veloce e funziona in modo robusto. Il DNA genomico estratto con questo metodo può essere utilizzato ...

Qui, vengono presentati due protocolli correlati per la lisi di Caenorhabditis elegans per rendere il DNA accessibile per le applicazioni basate sulla PCR. La PCR è una tecnica molecolare comunemente usata per molte applicazioni, tra cui la genotipizzazione e l'amplificazione di frammenti di DNA per la clonazione e il sequenziamento, tra gli altri. Il piccolo (1 mm), nematode a vita libera C. elegans è un sistema animale popolare per la ricerca biologica. Ottenere DNA genomico adeguato da un singolo animale o da pochi animali è sufficiente per amplificare la sequenza mediante PCR. Le larve tardive di L4 e gli adulti contengono solo ~ 1.000 cellule somatiche (comprese alcune cellule poliploidi multi-nucleari), cellule germinali e (se l'animale è un ermafrodita gravido) prole in utero1. Tuttavia, questi animali sono protetti da una cuticola che deve essere interrotta per estrarre il DNA genomico2. I metodi standard per preparare il modello di DNA genomico dei nematodi per la PCR comportano più passaggi e richiedono diverse ore. Gli animali vengono prima congelati in un tampone di lisi worm contenente proteinasi K (-70 °C o inferiore) per almeno 15-45 minuti (più a lungo è raccomandato da alcuni protocolli)3,4,5,6. Questo passaggio apre gli animali.
Dopo il congelamento, gli animali vengono incubati per 1 ora a 60-65 °C affinché la proteinasi K funzioni, quindi l'enzima viene inattivato per 15-30 minuti a 95 °C. La proteinasi K distrugge le nucleasi che degradano il DNA. L'inattivazione della proteinasi K prima della PCR è importante per evitare che la proteinasi K degradi la DNA polimerasi. I due protocolli basati su kit qui descritti sono metodi rapidi, affidabili ed economici per estrarre il DNA genomico da un singolo animale o da alcuni nematodi per la ricerca quotidiana e l'insegnamento delle applicazioni di laboratorio. Il kit utilizzato è stato originariamente ottimizzato dal produttore per estrarre il DNA da tessuti animali, saliva e capelli7. Utilizza una soluzione proprietaria di preparazione dei tessuti e una soluzione di estrazione per lisare le cellule e rendere accessibile il DNA genomico. Una soluzione di neutralizzazione proprietaria neutralizza quindi i componenti che possono inibire la PCR (ad esempio, sali, ioni e molecole leganti Mg2+).
Durante la genotipizzazione, un singolo animale può essere testato. Quando si determina se un ceppo è omozigote, testare sei o più figli di un singolo animale dà un'alta sicurezza che una linea sia omozigote o meno (c'è una probabilità dello 0,02% di scegliere casualmente sei progenie mutanti omozigoti da un genitore eterozigote [(1/4)6 × 100% = 0,02%]). Questo metodo 1) è semplice, con meno passaggi rispetto al metodo della proteinasi K, e 2) riduce il tempo di preparazione del modello a 15 minuti. I risultati di questo lavoro dimostrano che il protocollo sviluppato funziona in modo robusto nell'estrazione del DNA genomico da uno o pochi vermi, che possono essere utilizzati in modo affidabile per applicazioni a valle che non richiedono DNA altamente purificato, inclusa la PCR.

<table><tbody><tr><td>nastro per autoclave</td><td>Defend</td><td>43237-2</td><td></td></tr><tr><td>foglio di alluminio, resistente</td><td>Reynolds Wrap</td><td>2182934</td><td></td></tr><tr><td>cloruro di calcio</td><td>Millipore Sigma</td><td>102382 (CAS 10035-04-8)</td><td></td></tr><tr><td>Kit Extract-N-Amp (include soluzione per la preparazione dei tessuti, soluzione di estrazione e soluzione di neutralizzazione)</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td><td>XNAT2-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Piastra riscaldante/agitatore Isotemp</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-100-495H</td><td></td></tr><tr><td>LB media, Lennox, capsule</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>3002-131</td><td></td></tr><tr><td>solfato di magnesio, puro al 97%, anidro</td><td>Thermo Scientific</td><td>AC413485000 (CAS 7487-88-9)</td><td></td></tr><tr><td>microcentrifuga</td><td>Labnet International, Inc.</td><td>PrismR, C2500-R</td><td></td></tr><tr><td>NEB Q5U Avvio a caldo DNA polimerasi ad alta fedeltà</td><td>New England Biolabs, Inc.</td><td>M0515S</td><td>"Pol E" utilizzato nella Figura Supplementare S1, una polimerasi ad alta velocità e ad alta fedeltà (20&ndash; 30 s/kb)</td></tr><tr><td>NGM media powder</td><td>US Biological Life Sciences</td><td>N1000</td><td></td></tr><tr><td>Phusion PCR ad alta fedeltà Master Mix con tampone HF New</td><td>England Biolabs, Inc.</td><td>M0531S</td><td>"Pol D" nella Figura 1B, una polimerasi ad alta velocità e ad alta fedeltà (15&ndash; 30 s/kb)</td></tr><tr><td>primer Integrated</td><td>DNA Technologies</td> oligo <td>DNA</td><td></td>personalizzati</tr><tr><td>PrimeSTAR GXL polimerasi</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>R050B</td><td>"Pol C" nella Figura 1B, una polimerasi ad alta fedeltà (1 min/kb) per modelli ricchi di GC e modelli fino a 30 kb</td></tr><tr><td>Scala di DNA a 2 log viola a caricamento rapido (0,1&ndash; 10.0 kb)</td><td>New England Biolabs, Inc.</td><td>N0550S</td><td></td></tr><tr><td>SapphireAmp Fast PCR Master Mix</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>RR350A</td><td>"Pol A" nella Figura 1B, polimerasi utilizzata nella Figura 1A, C, D, una polimerasi ad alta velocità (10 s/kb) per bersagli fino a 5 kb</td></tr><tr><td>Sigma ReadyMix Taq PCR miscela di reazione</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td><td>P4600</td><td>"Pol B" nella Figura 1B, una polimerasi (1 min/kb) per bersagli fino a 7 kb</td></tr><tr><td>Termociclatore SimpliAmp</td><td>Applied Biosystems</td><td>A24812</td><td></td></tr><tr><td>ancor</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-512-126</td><td></td></tr><tr><td>miscelatore a vortice</td><td>Fisher Scientific</td><td>2215365</td><td></td></tr><tr><td>piccone a vite senza fine</td><td>Genesee Scientific Corporation</td><td>59-AWP</td><td></td></tr></tbody></table>

estrazione su piccola scala di caenorhabditis elegans dna genomico

Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA

L'estrazione del DNA genomico da una o poche Caenorhabditis elegans ha molte applicazioni a valle, tra cui la PCR per linee di genotipizzazione, clonazione e sequenziamento. I metodi tradizionali a base di proteinasi K per l'estrazione del DNA genomico da C. elegans richiedono diverse ore. I kit di estrazione commerciali che rompono efficacemente la cuticola di C. elegans ed estraggono il DNA genomico sono limitati. Un metodo facile, più veloce (~ 15 minuti) ed economico per estrarre il DNA genomico di C. elegans che funziona bene per le applicazioni in classe e di ricerca è riportato qui. Questo metodo di estrazione del DNA è ottimizzato per utilizzare singoli o pochi nematodi tardo-larvali (L4) o adulti come materiale di partenza per ottenere un modello affidabile per eseguire la PCR. I risultati indicano che la qualità del DNA è adatta per amplificare bersagli genici di diverse dimensioni mediante PCR, consentendo la genotipizzazione di uno o pochi animali anche a diluizioni a un cinquantesimo del DNA genomico da un singolo adulto per reazione. I protocolli riportati possono essere utilizzati in modo affidabile per produrre rapidamente un modello di DNA da un singolo o un piccolo campione di C. elegans per applicazioni basate su PCR.

Il DNA genomico di uno o pochi adulti wild-type è stato estratto utilizzando il kit commerciale o il protocollo di lisi tradizionale per confrontare l'efficacia di questi due metodi. Questi lisati sono stati poi utilizzati come modelli per la PCR per amplificare un target più grande di ~ 2.100 bp (codifica blmp-1) o un target più piccolo di ~ 500 bp (codificando una parte di sma-10). Entrambi i metodi hanno prodotto con successo prodotti PCR appropriati (Figura 1A).
<p ...

Qui viene presentata una descrizione dell'isolamento semplice e relativamente rapido del DNA genomico di Caenorhabditis elegans da uno o pochi animali utilizzando un kit di tessuti disponibile in commercio. La preparazione del gDNA risultante è un modello adatto per la PCR.

Estrazione su piccola scala di Caenorhabditis elegans DNA genomico

Genomic DNA extraction from single or a few Caenorhabditis elegans has many downstream applications, including PCR for genotyping lines, cloning, and ...

Abbiamo sviluppato un metodo semplice, veloce ed economico per estrarre il DNA genomico di C.elegans che funziona alla grande per le applicazioni in classe e di ricerca. Questi protocolli possono essere utilizzati in modo affidabile per produrre rapidamente modelli di DNA da un singolo o un piccolo campione di C.elegance per applicazioni basate su PCR. Gli utenti che non hanno esperienza nella raccolta di worm o nell'utilizzo di un micropipetter possono avere difficoltà con passaggi che richiedono queste abilità.Guardare un praticante esperto e praticare può aiutare. A dimostrare la procedura sarà Farhan Lakdawala, uno studente laureato senior del mio laboratorio. Per estrarre il DNA da un singolo verme Caenorhabditis elegans, in primo luogo, impostare il programma di lisi costituito da un ciclo a 55 gradi Celsius per 10 minuti seguito da 95 gradi Celsius per tre minuti in un termociclatore.Per preparare la soluzione di lisi, in primo luogo, aggiungere 0,8 microlitri di soluzione di estrazione dal kit alla parete interna di un tubo PCR da 0,2 millilitri su ghiaccio. Quindi aggiungere 0,2 microlitri di soluzione di preparazione del tessuto dal kit alla goccia di soluzione di estrazione e mescolare accarezzando. Con la selezione di un verme per l'estrazione del DNA, in primo luogo, identificare un animale L4 o adulto sotto un microscopio di dissezione.Un ermafrodito L4 può essere identificato da una caratteristica vulva che è visibile come un semicerchio pallido nel mezzo dell'animale. Per identificare un ermafrodita adulto, selezionare uno degli animali più grandi sul piatto che potrebbe avere embrioni ovali visibili nel suo utero. Quindi, utilizzando un plettro di filo di platino, trasferire l'animale selezionato alla soluzione.Per raccogliere il contenuto nella parte inferiore del tubo, centrifugare il tubo per due o tre secondi a 2000 x g a temperatura ambiente. Quindi posizionare il tubo nel termociclatore ed eseguire il programma di lisi impostato in precedenza. Al termine di questo programma di lisi, centrifugare brevemente il tubo e metterlo sul ghiaccio.Quindi aggiungere 0,8 microlitri di soluzione di neutralizzazione dal kit e mescolare mediante pipettaggio. Ancora una volta, centrifugare il tubo per due o tre secondi a 2000 x g a temperatura ambiente. Se il lisato non viene utilizzato immediatamente, conservare il tubo a quattro gradi Celsius per un uso futuro.Per estrarre il DNA da un singolo verme anche, in primo luogo, impostare il programma di lisi di un ciclo a 55 gradi Celsius per 10 minuti seguito da 95 gradi Celsius per tre minuti in un termociclatore. Quindi preparare la soluzione di lisi aggiungendo prima due microlitri della soluzione di estrazione dal kit sulla parete interna di un tubo PCR da 0,2 millilitri su ghiaccio, quindi aggiungendo 0,5 microlitri della soluzione di preparazione del tessuto dal kit alla goccia di soluzione di estrazione, quindi mescolare il contenuto mediante pipettaggio. Dopo aver identificato L4 o animali adulti, utilizzare un plettro di filo di platino per trasferire un numero adeguato di animali nella soluzione.Quindi, centrifugare il tubo per due o tre secondi a 2000 x g a temperatura ambiente, quindi posizionare il tubo nel termociclatore ed eseguire il programma di lisi precedentemente impostato. Dopo aver completato il programma, centrifugare brevemente il tubo e metterlo sul ghiaccio. Quindi aggiungere due microlitri della soluzione di neutralizzazione dal kit al tubo e miscelati mediante pipettaggio.Ancora una volta, centrifugare il tubo per due o tre secondi a 2000 x g a temperatura ambiente. Se non utilizzato immediatamente, conservare il lisato a quattro gradi Celsius per un uso futuro. Il DNA genomico estratto dal protocollo potrebbe essere utilizzato con successo come modello di PCR, sia il kit commerciale che il tradizionale metodo della proteinasi K hanno prodotto DNA con livelli simili di amplificazione PCR di un prodotto a coppia di basi 2100 e un prodotto a coppia di basi 500.Il metodo kit per la lisi del DNA ha anche fornito modelli PCR efficaci per una varietà di enzimi della DNA polimerasi. Anche a diverse diluizioni, il DNA estratto da un singolo animale dal kit commerciale ha supportato l'amplificazione PCR di un frammento di DNA a coppia di basi 2100 con efficienza equivalente. Tuttavia, l'amplificazione di un frammento di DNA di 500 coppie di basi variava con la concentrazione del modello.L'idoneità del DNA estratto da un singolo animale o da più animali come modello pcr per determinare il genotipo è stata ulteriormente dimostrata dal successo dell'amplificazione di un gene e della sua variante mutata. Poiché questo protocollo prevede il pipettaggio di piccoli volumi di reagenti, per garantire la coerenza, utilizzare una miscela principale per reazioni multiple, una buona tecnica di tubazione e pipette ben calibrate. Inoltre, la rotazione del contenuto del tubo garantisce una corretta lisi.Questo metodo potrebbe essere scalato, adattato per estrarre il DNA genomico di C.elegans per altre applicazioni a valle e potrebbe essere utilizzato per estrarre il DNA da altre specie di nematodi. Data la semplicità, la velocità, la robustezza e il basso costo del protocollo, è adatto sia per la ricerca che per le applicazioni in classe in cui il tempo e le risorse sono limitati.

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Questo protocollo può essere utilizzato per eseguire indagini ecologiche su larga scala dei nematodi Caenorhabditis selfing. Il vantaggio principale di questo metodo è l'organizzazione efficiente e l'analisi dei dati ecologici e molecolari associati ai nematodi raccolti dalla natura.

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Viene descritto un protocollo che utilizza la microdissezione laser per isolare i singoli tessuti nematodi per il sequenziamento dell'RNA. Il protocollo non richiede toolkit genetici specie-specifici, consentendo di confrontare i profili di espressione genica tra diverse specie a livello di campioni di tessuto singolo.

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Caenorhabditis elegans è una delle principali specie modello in biologia, ma quasi tutte le ricerche vengono eseguite in assenza dei suoi microbi naturalmente associati. I metodi qui descritti aiuteranno a migliorare la nostra comprensione della diversità dei microbi associati come base per la futura ricerca funzionale di C. elegans.

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I microcosmi di compost portano la diversità microbica presente in natura in laboratorio per facilitare la ricerca sul microbioma in Caenorhabditis elegans. Qui sono forniti protocolli per la creazione di esperimenti di microcosmo, con gli esperimenti che dimostrano la capacità di modulare la diversità microbica ambientale per esplorare le relazioni tra diversità microbica ambientale e composizione del microbioma intestinale del verme.

Microcosmi di compost come ambienti microbicamente diversi e simili a quelli naturali per la ricerca sul microbioma in Caenorhabditis elegans

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Profilazione dell'accessibilità della cromatina in larve intere di Caenorhabditis elegans L4

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Estrazione su piccola scala di Caenorhabditis elegans DNA genomico

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