Name: Identificazione di frammenti di RNA risultanti dalla degradazione enzimatica mediante spettrometria di massa MALDI-TOF (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Scopri la caratterizzazione di frammenti di RNA mediante spettrometria di massa MALDI-TOF per studi biochimici. Questo metodo permette analisi con piccole quantità di campione e formazione minima.

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È importante notare che questo lavoro è stato uno sforzo collaborativo tra tre istituzioni, due gruppi di ricerca e una struttura principale. La distribuzione e il carico di lavoro sono stati effettuati come segue: L'espressione della proteina (Xrn-1) è stata effettuata presso l'Università di Denver (Denver, CO). La sintesi, la quantificazione e la sperimentazione degli oligonucleotidi (principalmente la degradazione enzimatica) sono state condotte presso l'Università del Colorado Denver (Denver, CO). L'ottimizzazione è stata effettuata anche lì. L'individuazione, l'acquisizione e l'analisi di MALDI-TOF sono state effettuate presso l'Analytical Resources Core Facility della Colorado State University. (Fort Collins, CO). SS desidera riconoscere un urop award (CU Denver) e le sovvenzioni Eureca (CU Denver) per il supporto. E. G.C. riconosce il supporto di NIGMS, tramite R00GM115757. MJER riconosce il supporto di NIGMS, tramite 1R15GM132816. K.B. riconosce l'ID risorsa: SCR_021758. Il lavoro è stato anche sostenuto da un Teacher-Scholar Award (MJER), TH-21-028, dalla Henry Dreyfus Foundation.

<ol><li>Tanaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+and+polymer+analyses+up+to+m%2Fz+100+000+by+laser+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2 (8), 151-153 (1988).</li>
<li>Karas, M., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+desorption+ionization+of+proteins+with+molecular+masses+exceeding+10%2C000+daltons%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons.</a> Analytical Chemistry. 60 (20), 2299-2301 (1988).</li>
<li>Zenobi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+nobel+prize+2002+goes+to+analytical+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Chimia%22%5BJournal%5D)">Chemistry nobel prize 2002 goes to analytical chemistry.</a> Chimia. 57, 73(2003).</li>
<li>Aristri, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-based+polyurethane+resins+derived+from+tannin%3A+Source%2C+synthesis%2C+characterization%2C+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22Forests%22%5BJournal%5D)">Bio-based polyurethane resins derived from tannin: Source, synthesis, characterization, and application.</a> Forests. 12 (11), 1516(2021).</li>
<li>Pedrazzani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-n-Alkylresorcinol+profiles+in+different+cultivars+of+einkorn%2C+emmer+spelt%2C+common+wheat%2C+and+tritordeum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">5-n-Alkylresorcinol profiles in different cultivars of einkorn, emmer spelt, common wheat, and tritordeum.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 69 (47), 14092-14102 (2021).</li>
<li>Unger, M. S., Blank, M., Enzlein, T., Hopf, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+cell+assays+to+determine+compound+uptake+or+drug+action+using+MALDI-TOF+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Label-free cell assays to determine compound uptake or drug action using MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 16 (12), 5533-5558 (2021).</li>
<li>Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+MALDI-TOF+mass+spectrometry+in+clinical+diagnostic+microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology.</a> FEMS Microbiology Reviews. 36 (2), 380-407 (2012).</li>
<li>Kaufmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marrix-assisted+laser+desorption+ionization+%28MALDI%29+mass+spectrometry%3A+a+novel+analytical+tool+in+molecular+biology+and+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Marrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) mass spectrometry: a novel analytical tool in molecular biology and biotechnology.</a> Journal of Biotechnology. 41 (2-3), 155-175 (1995).</li>
<li>Kiggins, C., Skinner, A., Resendiz, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((8-Oxo-7%2C8-dihydroguanosine+inhibits+or+changes+the+selectivity+of+the+theophylline+aptamer%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">8-Oxo-7,8-dihydroguanosine inhibits or changes the selectivity of the theophylline aptamer.</a> ChemBioChem. 21 (9), 1347-1355 (2020).</li>
<li>Chapman, E. G., DeRose, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+processing+of+platinated+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Enzymatic processing of platinated RNAs.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (6), 1946-1952 (2010).</li>
<li>Resendiz, M. J. E., Pottiboyina, V., Sevilla, M. D., Greengerg, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+strand+scission+in+double+stranded+RNA+via+a+C5-pyrimidine+radical%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Direct strand scission in double stranded RNA via a C5-pyrimidine radical.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (8), 3917-3924 (2012).</li>
<li>Joyner, J. C., Keuper, K. D., Cowan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+RNA+cleavage+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Analysis of RNA cleavage by MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Nucleic Acids Research. 41 (1), 2(2013).</li>
<li>Ghodke, P. P., Guengerich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerases+%CE%B7+and+%CE%BA+bypass+N2-guanine-O6-alkylguanine+DNA+alkyltransferase+cross-linked+DNA+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">DNA polymerases η and κ bypass N2-guanine-O6-alkylguanine DNA alkyltransferase cross-linked DNA peptides.</a> Journal of Biological Chemistry. 297 (4), 101124(2021).</li>
<li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Biochemistry.+MALDI-TOF+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Biochemistry. MALDI-TOF Mass Spectrometry.</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2021).</li>
<li>Schrötner, P., Gunzer, F., Schüppel, J., Rudolph, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+rare+bacterial+pathogens+by+16S+rRNA+gene+sequencing+and+MALDI-TOF+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Identification of rare bacterial pathogens by 16S rRNA gene sequencing and MALDI-TOF MS.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e53176(2016).</li>
<li>Su, K. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proofreading+and+DNA+repair+assay+using+single+nucleotide+extension+and+MALDI-TOF+mass+spectrometry+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Proofreading and DNA repair assay using single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry analysis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57862(2018).</li>
<li>Fagerquist, C. K., Rojas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+antibacterial+immunity+proteins+in+Escherichia+coli+using+MALDI-TOF-TOF-MS%2FMS+and+Top-Down+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Identification of antibacterial immunity proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down proteomic analysis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62577(2021).</li>
<li>Phillips, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+RNA+containing+8-Oxo-7%2C8-dihydroguanosine+%288-oxoG%29+by+the+exoribonuclease+Xrn-1%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Processing of RNA containing 8-Oxo-7,8-dihydroguanosine (8-oxoG) by the exoribonuclease Xrn-1.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 780315(2021).</li>
<li>Francis, A. J., Resendiz, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+the+solid-phase+synthesis+of+oligomers+of+RNA+containing+a+2%27-O-thiophenylmethyl+modification+and+characterization+via+circular+dichroism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Protocol for the solid-phase synthesis of oligomers of RNA containing a 2'-O-thiophenylmethyl modification and characterization via circular dichroism.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e56189(2017).</li>
<li>Langeberg, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+yeast+Xrn1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of yeast Xrn1.</a> Biochemistry. 59 (15), 1493-1507 (2020).</li>
<li>Stevens, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+a+Saccharomyces+cerevisiae+exoribonuclease+which+yields+5%27-mononucleotides+by+a+5%27+leads+to+3%27+mode+of+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of a Saccharomyces cerevisiae exoribonuclease which yields 5'-mononucleotides by a 5' leads to 3' mode of hydrolysis.</a> Journal of Biological Chemistry. 255 (7), 3080-3085 (1980).</li>
<li>Yan, L. L., Simms, C. L., McLoughlin, F., Vierstra, R. D., Zaher, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidation+and+alkylation+stresses+activate+ribosome-quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Oxidation and alkylation stresses activate ribosome-quality control.</a> Nature Communications. 10 (1), 5611(2019).</li>
<li>Fasnacht, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+23S+rRNA+modification+ho5C2501+benefits+Escherichia+coli+under+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Dynamic 23S rRNA modification ho5C2501 benefits Escherichia coli under oxidative stress.</a> Nucleic Acids Research. 50 (1), 473-489 (2022).</li>
<li>Estevez, M., Valesyan, S., Jora, M., Limbach, P. A., Addepalli, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+damage+to+RNA+is+altered+by+the+presence+of+interacting+proteins+or+modified+nucleosides%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Oxidative damage to RNA is altered by the presence of interacting proteins or modified nucleosides.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 697149(2021).</li>
<li>Tomar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequence+modulates+the+efficiency+of+NEIL1-catalyzed+excision+of+the+aflatoxin+B1-induced+formamidopyrimidine+guanine+adduct%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">DNA sequence modulates the efficiency of NEIL1-catalyzed excision of the aflatoxin B1-induced formamidopyrimidine guanine adduct.</a> Journal of the American Chemical Society. 34 (3), 901-911 (2021).</li>
<li>Gaffney, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+env-dependent+cell+killing+by+bifunctional+small-molecule%2Fpeptide+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 env-dependent cell killing by bifunctional small-molecule/peptide conjugates.</a> ACS Chemical Biology. 16 (1), 193-204 (2021).</li>
<li>Sikorski, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+display+of+a+chemoattractant+agonist+on+cancer+cells+activates+the+formyl+peptide+receptor+1+on+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Selective display of a chemoattractant agonist on cancer cells activates the formyl peptide receptor 1 on immune cells.</a> ChemBioChem. , 202100521(2022).</li>
<li>Kubo, T., Nishimura, Y., Sato, Y., Yanagihara, K., Seyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sixteen+different+types+of+lipid-conjugated+siRNAs+containing+saturated+and+unsaturated+fatty+Acids+and+exhibiting+enhanced+RNAi+potency%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Sixteen different types of lipid-conjugated siRNAs containing saturated and unsaturated fatty Acids and exhibiting enhanced RNAi potency.</a> ACS Chemical Biology. 16 (1), 150-164 (2021).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La sfida principale in questo flusso di lavoro è sorta tra la finalizzazione degli esperimenti e l'esecuzione delle analisi spettrometriche di massa. Gli esperimenti sono stati condotti e completati presso l'Università del Colorado a Denver e spediti (durante la notte) alle strutture della Colorado State University. L'acquisizione dei dati è stata effettuata al momento del ricevimento, come da convenienza. Diverse circostanze impreviste hanno portato a ritardi nel processo. In un caso, malfunzionamenti imprevisti dello s...

MALDI-TOF 1,2,3 è una tecnica ampiamente utilizzata per la caratterizzazione e/o la rilevazione di molecole di varie dimensioni e caratteristiche. Alcuni dei suoi usi includono diverse applicazioni come il rilevamento di tannini dalle risorse naturali4, l'imaging di metaboliti negli alimenti5, la scoperta o il monitoraggio di bersagli o marcatori di farmaci cellulari6 e la diagnostica clinica7, per citarne alcuni. Di rilevanza per il presente lavoro è l'uso di MALDI-TOF con DNA o RNA, con il suo uso su oligonucleotidi risalenti a oltre tre decenni8, dove sono state notate diverse limitazioni. Questa tecnica si è ora evoluta in un mezzo affidabile e comunemente usato per caratterizzare entrambi i biopolimeri9 e identificare / comprendere reazioni chimiche e biochimiche, ad esempio, caratterizzazione di siti platinati in RNA10, identificazione di frammenti di RNA a seguito di scissione del filamento 11,12 o formazione di legami incrociati proteina-DNA13 . Pertanto, è utile illustrare ed evidenziare aspetti importanti dell'utilizzo di questa tecnica. Le basi di MALDI-TOF sono state descritte anche in formato video14 e non saranno ulteriormente elaborate nel presente documento. Inoltre, la sua applicazione in un contesto di DNA o proteine è stata precedentemente descritta e illustrata nel suddetto formato 15,16,17.
Il protocollo per la rilevazione di frammenti di RNA formatisi dopo idrolisi enzimatica è riportato qui. Il modello sperimentale è stato scelto sulla base di una recente scoperta pubblicata dal nostro gruppo18, in cui MALDI-TOF è stato utilizzato per determinare la reattività unica tra l'esoribonucleasi Xrn-1 e gli oligonucleotidi dell'RNA contenenti la lesione ossidativa 8-oxoG. I filamenti lunghi a 20 nucleotidi sono stati ottenuti tramite sintesi in fase solida19, [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] e [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], mentre Xrn-1 è stato espresso e purificato seguendo il rapporto20 precedentemente descritto. In breve, Xrn-121 è un'esoribonucleasi 5'-3' con vari ruoli biologici chiave che degradano più tipi di RNA, incluso l'RNAossidato 22. Si è scoperto che la processività dell'enzima si blocca incontrando 8-oxoG, che ha portato a frammenti di RNA contenenti estremità 5'-fosforilate [5'-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] e [5'-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]18.
Infine, è importante notare che la spettrometria di massa è un metodo potente che, attraverso varie metodologie, può essere adattato ad altri scopi23,24; pertanto, la scelta del giusto metodo di ionizzazione e di altre impostazioni sperimentali è della massima importanza.

<table><tbody><tr><td>0,6 mL MCT Graduato Violet</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-127</td><td></td></tr><tr><td>6'-Triidrossiacetofenone monoidrato 98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>480-66-0</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile 99,9%, grado HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-05-8</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina trifosfato, 10 mM</td><td>New Englang Bioscience</td><td>P0756S</td><td></td></tr><tr><td>Citrato di ammonio, bibasico 98% </td><td>Sigma Aldrich</td><td>3012-65-5</td><td></td></tr><tr><td>Fluoruro di ammonio 98,0%, grado ACS Alfa</td><td>Aesar</td><td>12125-01-8</td><td></td></tr><tr><td>Standard di test batterico Bruker Bruker</td><td>Daltonics</td><td>8255343</td><td></td></tr><tr><td>Fonte commerciale di Xrn-1</td><td>New England BioLabs</td><td>M0338S</td> Pirocarbonato <td></td>di</tr><tr><td>dietile, 97%</td> <td>ACROS Organics</td><td>A0368487</td><td></td></tr><tr><td>analisi Flex software</td><td>Bruker daltonics</td><td></td><td>FlexAnalysis software versione 3.4, Bruker Daltonics</td></tr><tr><td>Lambda 365 Spettrofotometro UV-vis</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastra MALDI: MSP 96 bersaglio in acciaio rettificato</td><td>Bruker Daltonics</td><td>280799</td><td></td></tr><tr><td>Spettrometro di massa</td><td>Bruker</td><td></td><td>Microflex LRFTOF (Bruker Daltonics, Billerica, MA)</td></tr><tr><td>Mili-Q IQ 7000</td><td>Il sistema Milipore Sigma</td><td></td><td>A Mili-Q è stato utilizzato per purificare tutta l'acqua utilizzata in questo lavoro</td></tr><tr><td>Dispositivi centrifughi Nanosep con membrana OmegaTM 10 K, blu (24/pkg)</td><td>Pall Corporation</td><td>OD010C33</td><td>media filtrante, Omega (polietersulfone modificato) 10 K dimensione dei pori</td></tr><tr><td>NEBuffer 3</td><td>New England Biolabs</td><td>B7003S</td><td>Questa è la soluzione B</td></tr><tr><td>Strumento analizzatore di oligo</td><td>IDT-DNA</td><td></td><td>https://www.idtdna.com/calc/analyzer</td></tr><tr><td>Puntali per pipette P10</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-441</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette P200</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-419</td><td></td></tr><tr><td>RNase Away</td><td>Molecular BioProducts</td><td>7005-11</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polinucleotide chinasi</td><td>New England BioLabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polinucleotide chinasi Buffer di reazione</td><td>Nuovo Inghilterra BioLabs</td><td>B0201S</td><td>Questa è la soluzione</td></tr><tr><td>A Acido trifluoroacetico</td><td>Alfa Aesar</td><td>76-05-1</td><td></td></tr><tr><td>Xrn-1 esoribonucleasi</td><td>Espresso in casa</td><td>Vedi ref. 20</td><td></td></tr><tr><td>ZipTip Pipette Tips per la preparazione del campione</td><td>Millipore</td><td>ZTC 18S 096</td><td>10 &; L puntali per pipette caricati con uno standard C18 da 0,6 & micro; Letto a L</td></tr></tbody></table>

identificazione di frammenti di rna risultanti dalla degradazione enzimatica mediante spettrometria di massa maldi-tof

Identification of RNA Fragments Resulting from Enzymatic Degradation using MALDI-TOF Mass Spectrometry

L'RNA è un biopolimero presente in tutti i domini della vita e le sue interazioni con altre molecole e / o specie reattive, ad esempio DNA, proteine, ioni, farmaci e radicali liberi, sono onnipresenti. Di conseguenza, l'RNA subisce varie reazioni che includono la sua scissione, degradazione o modifica, portando a specie biologicamente rilevanti con funzioni e implicazioni distinte. Un esempio è l'ossidazione della guanina a 7,8-diidro-8-ossoguanina (8-oxoG), che può verificarsi in presenza di specie reattive dell'ossigeno (ROS). Nel complesso, le procedure che caratterizzano tali prodotti e trasformazioni sono in gran parte preziose per la comunità scientifica. A tal fine, la spettrometria di massa a ionizzazione a desorbimento laser assistita da matrice (MALDI-TOF) è un metodo ampiamente utilizzato. Il presente protocollo descrive come caratterizzare i frammenti di RNA formatisi dopo il trattamento enzimatico. Il modello scelto utilizza una reazione tra l'RNA e l'esoribonucleasi Xrn-1, in cui la digestione enzimatica viene interrotta in siti ossidati. Due sequenze di RNA lungo 20 nucleotidi [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] e [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] sono state ottenute tramite sintesi in fase solida, quantificate mediante spettroscopia UV-vis e caratterizzate tramite MALDI-TOF. I fili ottenuti sono stati poi (1) fosforilati 5' e caratterizzati tramite MALDI-TOF; (2) trattati con Xrn-1; (3) filtrati e dissalati; (4) analizzato tramite MALDI-TOF. Questa configurazione sperimentale ha portato all'identificazione inequivocabile dei frammenti associati allo stallo di Xrn-1: [5'-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] e [5'-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]. Gli esperimenti descritti sono stati condotti con 200 picomoli di RNA (20 pmol utilizzati per le analisi MALDI); tuttavia, quantità inferiori possono comportare picchi rilevabili con spettrometri che utilizzano sorgenti laser con più potenza di quella utilizzata in questo lavoro. È importante sottolineare che la metodologia descritta può essere generalizzata e potenzialmente estesa all'identificazione del prodotto per altri processi che coinvolgono RNA e DNA e può aiutare nella caratterizzazione / delucidazione di altri percorsi biochimici.

Gli oligonucleotidi utilizzati in questo lavoro sono stati sintetizzati, caratterizzati e quantificati prima dell'uso. La concentrazione di tutti gli oligonucleotidi è stata determinata tramite spettroscopia UV-vis registrata a 90 °C per evitare letture errate derivanti dalla potenziale formazione delle strutture secondarie. La Figura 3 mostra gli spettri degli oligonucleotidi modello di RNA utilizzati in questo lavoro, presi a temperatura ambiente e dopo l'applicazione di calore.</...

MALDI-TOF è stato utilizzato per caratterizzare frammenti ottenuti dalla reattività tra RNA ossidato ed esoribonucleasi Xrn-1. Il presente protocollo descrive una metodologia che può essere applicata ad altri processi che coinvolgono RNA e/o DNA.

Identificazione di frammenti di RNA risultanti dalla degradazione enzimatica mediante spettrometria di massa MALDI-TOF

RNA is a biopolymer present in all domains of life, and its interactions with other molecules and/or reactive species, e.g., DNA, proteins, ions, drugs, ...

La spettrometria di massa è stata ampiamente adottata per varie applicazioni. La metodologia in questo articolo fornisce la caratterizzazione inequivocabile di frammenti di RNA ottenuti da un processo enzimatico in vitro. I vantaggi di questa tecnica includono che si ottiene il picco di ferro della molecola, che gli esperimenti possono essere eseguiti con piccole quantità di materiale per applicazioni in vitro e che il protocollo può essere realizzato con una formazione minima.La metodologia descritta può essere ampiamente applicata ai processi di studio che coinvolgono DNA, RNA o proteine. Gli esempi includono trasformazioni biochimiche come informazioni incrociate, identificazione di modifiche chimiche o altre interazioni e reattività dei biopolimeri. Una difficoltà può verificarsi dall'accessibilità a uno spettrometro MALDI o alle strutture principali che offrono questo servizio.Un altro aspetto è stabilire il limite di rilevamento che può essere più alto o più basso a seconda dello strumento. Per iniziare, accendere lo spettrofotometro UV-Vis, quindi fare clic sull'icona PerkinElmer UV WinLab per aprire la finestra di controllo del funzionamento dello strumento. Accendere lo spettrofotometro del regolatore di temperatura Peltier utilizzando l'interruttore situato alla destra dello strumento e fare clic su Scan-Lambda 365, presente in Metodi di base.Si aprirà un'altra schermata e verrà richiesto all'utente di assicurarsi che i porta celle siano vuoti. Fare clic su OK e consentire allo strumento di eseguire i controlli del sistema. Ora, regola i parametri di scansione selezionando Raccolta dati.Nella nuova finestra in Impostazioni di scansione, modificare l'inizio a 350 nanometri e l'estremità a 215 nanometri. Attiva il Peltier selezionando il plus a sinistra dell'accessorio. Quindi fare clic su Peltier a più celle, modificare i gradi Celsius di temperatura a 25 e fare clic su Peltier On.Passare alla scheda delle informazioni di esempio e immettere il numero di campioni, nomi e posizione della cella desiderata.Clicca su Autozero e inserisci la cuvetta contenente la soluzione di sfondo. Fare clic su Start e inserire la cuvetta nella cella desiderata e assicurarsi che la finestra della cuvetta sia orientata parallelamente alla faccia anteriore dello strumento. Ora, fai clic su OK per iniziare la prima scansione a 25 gradi Celsius.Per le misurazioni a temperature più elevate, fare clic su Multiple Cell Peltier, modificare la temperatura alla temperatura del campione desiderata e ripetere la scansione. Fare clic su File, Esporta e scegliere la posizione del file desiderata e selezionare XY Data per ottenere un file di testo. Per eseguire la fosforilazione 5'dell'RNA, preparare una soluzione in un tubo microcentrifiva da 0,6 microlitri aggiungendo 33,5 microlitri di acqua priva di RNasi, cinque microlitri di soluzione A, sei microliti di 10 millimolari adenosina trifosfato, una microlite di 200 micromolari RNA soluzione acquosa e 4,5 microlitri di polinucleotide chinasi e mescolare delicatamente la soluzione.Incubare la miscela di reazione a 37 gradi Celsius per 45 minuti mettendola a bagnomaria. Quindi inattivando l'enzima posizionando il tubo di reazione in un blocco di calore, preriscaldato a 65 gradi Celsius per 10 minuti. Lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente per produrre una soluzione finale di RNA fosforilato 5'.Dopo l'incubazione, utilizzare 50 microlitri di questa soluzione, aggiungere cinque microlitri di soluzione B e cinque microlitri di soluzione 1-femtomolo di Xrn-1 per eseguire l'idrolisi dell'RNA. Incubare il tubo di reazione a temperatura ambiente per due ore. Trasferire questa miscela di reazione in un dispositivo centrifugo da 10 kilodalton e filtrare gli enzimi centrifugando per 10 minuti a 700 volte G.Trasferire il filtrato in un tubo centrifugo da 0,6 millilitri.Quindi, aggiungere 20 microlitri di acqua priva di RNasi per lavare l'RNA residuo sul tubo centrifugo, seguito dalla centrifugazione. Infine, combinare questo filtrato con il filtrato risultante ottenuto in precedenza per centrifugazione in un dispositivo centrifugo a 10 kilodaltons e congelare la soluzione a zero gradi Celsius o spedire per l'analisi. Per dissalare e concentrare il campione, utilizzare le punte delle pipette C18 a scambio cationico disponibili in commercio caricate con un letto di mezzo cromatografico C18 alla sua estremità.Per questo, posizionare la punta della pipetta da 10 microlitri su una pipetta da 10 microlitri e lavare questa punta due volte con una soluzione acquosa di acetil nitrile al 50%. Scartare i volumi utilizzati in un tubo di scarico separato ogni volta ed equilibrare la punta C18 con 10 microlitri di soluzione acquosa di acido trifluoroacetico allo 0,1% due volte. Rimuovere manualmente la punta C18 dalla pipetta e fissarla su una pipetta da 200 microlitri contenente una punta della pipetta P200.Quindi immergere la punta C18 nella soluzione risultante preparata durante l'idrolisi degli oligonucleotidi dell'RNA da Xrn-1 e aspirare rilasciare la soluzione attraverso la punta C18 10 volte. Ora, staccare la punta C18 dalla pipetta P200, posizionarla su una pipetta da 10 microlitri e lavare la punta C18 utilizzando una soluzione acquosa di soluzione di acido trifluoroacetico allo 0,1% due volte. Scartare i volumi utilizzati in un tubo di scarico separato ogni volta.Lavare la punta C18 con acqua senza RNasi da 10 microlitri due volte. Per individuare sulla piastra MALDI, eluire l'oligonucleotide dell'RNA dalla punta C18 immergendo il campione nella matrice desiderata ed erogando nuovamente la soluzione nel tubo 10 volte. Pipettare questa soluzione su due punti separati di un microlitro ciascuno sulla piastra e lasciare asciugare i punti all'aria.La concentrazione di RNA utilizzata in questo lavoro è stata determinata tramite spettroscopia UV-Visibile registrata a 90 gradi Celsius per evitare letture errate derivanti dalla potenziale formazione delle strutture secondarie. La sequenza complessiva degli eventi comprendeva due parti. Uno, l'efficiente fosforilazione 5'dell'RNA, evidenziata dalla comparsa di un solo picco corrispondente al prodotto atteso.E due, il frammento di stallo derivante dal trattamento della miscela campione con Xrn-1. Gli stessi risultati sono stati ottenuti utilizzando una sequenza diversa che conteneva due lesioni ossidative. Le potenziali modifiche da considerare includono l'eliminazione dell'uso del dispositivo di filtraggio o la considerazione di matrici diverse per lo spotting MALDI.Ad esempio, acido sinapinico o acido picolinico. I frammenti di RNA sono stati ottenuti da un processo enzimatico. Questo processo è stato stabilito accoppiando MALDI, analisi elettroforetica, sintesi in fase solida e dicroismo circolare.Il protocollo descritto ha un potenziale per essere utilizzato in vari campi, dalla ricerca nelle scienze chimiche alle applicazioni in campo biomedico.

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