Identificazione di frammenti di RNA risultanti dalla degradazione enzimatica mediante spettrometria di massa MALDI-TOF

MALDI-TOF è stato utilizzato per caratterizzare frammenti ottenuti dalla reattività tra RNA ossidato ed esoribonucleasi Xrn-1. Il presente protocollo descrive una metodologia che può essere applicata ad altri processi che coinvolgono RNA e/o DNA.

La spettrometria di massa è stata ampiamente adottata per varie applicazioni. La metodologia in questo articolo fornisce la caratterizzazione inequivocabile di frammenti di RNA ottenuti da un processo enzimatico in vitro. I vantaggi di questa tecnica includono che si ottiene il picco di ferro della molecola, che gli esperimenti possono essere eseguiti con piccole quantità di materiale per applicazioni in vitro e che il protocollo può essere realizzato con una formazione minima.

La metodologia descritta può essere ampiamente applicata ai processi di studio che coinvolgono DNA, RNA o proteine. Gli esempi includono trasformazioni biochimiche come informazioni incrociate, identificazione di modifiche chimiche o altre interazioni e reattività dei biopolimeri. Una difficoltà può verificarsi dall'accessibilità a uno spettrometro MALDI o alle strutture principali che offrono questo servizio.

Un altro aspetto è stabilire il limite di rilevamento che può essere più alto o più basso a seconda dello strumento. Per iniziare, accendere lo spettrofotometro UV-Vis, quindi fare clic sull'icona PerkinElmer UV WinLab per aprire la finestra di controllo del funzionamento dello strumento. Accendere lo spettrofotometro del regolatore di temperatura Peltier utilizzando l'interruttore situato alla destra dello strumento e fare clic su Scan-Lambda 365, presente in Metodi di base.

Si aprirà un'altra schermata e verrà richiesto all'utente di assicurarsi che i porta celle siano vuoti. Fare clic su OK e consentire allo strumento di eseguire i controlli del sistema. Ora, regola i parametri di scansione selezionando Raccolta dati.

Nella nuova finestra in Impostazioni di scansione, modificare l'inizio a 350 nanometri e l'estremità a 215 nanometri. Attiva il Peltier selezionando il plus a sinistra dell'accessorio. Quindi fare clic su Peltier a più celle, modificare i gradi Celsius di temperatura a 25 e fare clic su Peltier On.Passare alla scheda delle informazioni di esempio e immettere il numero di campioni, nomi e posizione della cella desiderata.

Clicca su Autozero e inserisci la cuvetta contenente la soluzione di sfondo. Fare clic su Start e inserire la cuvetta nella cella desiderata e assicurarsi che la finestra della cuvetta sia orientata parallelamente alla faccia anteriore dello strumento. Ora, fai clic su OK per iniziare la prima scansione a 25 gradi Celsius.

Per le misurazioni a temperature più elevate, fare clic su Multiple Cell Peltier, modificare la temperatura alla temperatura del campione desiderata e ripetere la scansione. Fare clic su File, Esporta e scegliere la posizione del file desiderata e selezionare XY Data per ottenere un file di testo. Per eseguire la fosforilazione 5'dell'RNA, preparare una soluzione in un tubo microcentrifiva da 0,6 microlitri aggiungendo 33,5 microlitri di acqua priva di RNasi, cinque microlitri di soluzione A, sei microliti di 10 millimolari adenosina trifosfato, una microlite di 200 micromolari RNA soluzione acquosa e 4,5 microlitri di polinucleotide chinasi e mescolare delicatamente la soluzione.

Incubare la miscela di reazione a 37 gradi Celsius per 45 minuti mettendola a bagnomaria. Quindi inattivando l'enzima posizionando il tubo di reazione in un blocco di calore, preriscaldato a 65 gradi Celsius per 10 minuti. Lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente per produrre una soluzione finale di RNA fosforilato 5'.

Dopo l'incubazione, utilizzare 50 microlitri di questa soluzione, aggiungere cinque microlitri di soluzione B e cinque microlitri di soluzione 1-femtomolo di Xrn-1 per eseguire l'idrolisi dell'RNA. Incubare il tubo di reazione a temperatura ambiente per due ore. Trasferire questa miscela di reazione in un dispositivo centrifugo da 10 kilodalton e filtrare gli enzimi centrifugando per 10 minuti a 700 volte G.Trasferire il filtrato in un tubo centrifugo da 0,6 millilitri.

Quindi, aggiungere 20 microlitri di acqua priva di RNasi per lavare l'RNA residuo sul tubo centrifugo, seguito dalla centrifugazione. Infine, combinare questo filtrato con il filtrato risultante ottenuto in precedenza per centrifugazione in un dispositivo centrifugo a 10 kilodaltons e congelare la soluzione a zero gradi Celsius o spedire per l'analisi. Per dissalare e concentrare il campione, utilizzare le punte delle pipette C18 a scambio cationico disponibili in commercio caricate con un letto di mezzo cromatografico C18 alla sua estremità.

Per questo, posizionare la punta della pipetta da 10 microlitri su una pipetta da 10 microlitri e lavare questa punta due volte con una soluzione acquosa di acetil nitrile al 50%. Scartare i volumi utilizzati in un tubo di scarico separato ogni volta ed equilibrare la punta C18 con 10 microlitri di soluzione acquosa di acido trifluoroacetico allo 0,1% due volte. Rimuovere manualmente la punta C18 dalla pipetta e fissarla su una pipetta da 200 microlitri contenente una punta della pipetta P200.

Quindi immergere la punta C18 nella soluzione risultante preparata durante l'idrolisi degli oligonucleotidi dell'RNA da Xrn-1 e aspirare rilasciare la soluzione attraverso la punta C18 10 volte. Ora, staccare la punta C18 dalla pipetta P200, posizionarla su una pipetta da 10 microlitri e lavare la punta C18 utilizzando una soluzione acquosa di soluzione di acido trifluoroacetico allo 0,1% due volte. Scartare i volumi utilizzati in un tubo di scarico separato ogni volta.

Lavare la punta C18 con acqua senza RNasi da 10 microlitri due volte. Per individuare sulla piastra MALDI, eluire l'oligonucleotide dell'RNA dalla punta C18 immergendo il campione nella matrice desiderata ed erogando nuovamente la soluzione nel tubo 10 volte. Pipettare questa soluzione su due punti separati di un microlitro ciascuno sulla piastra e lasciare asciugare i punti all'aria.

La concentrazione di RNA utilizzata in questo lavoro è stata determinata tramite spettroscopia UV-Visibile registrata a 90 gradi Celsius per evitare letture errate derivanti dalla potenziale formazione delle strutture secondarie. La sequenza complessiva degli eventi comprendeva due parti. Uno, l'efficiente fosforilazione 5'dell'RNA, evidenziata dalla comparsa di un solo picco corrispondente al prodotto atteso.

E due, il frammento di stallo derivante dal trattamento della miscela campione con Xrn-1. Gli stessi risultati sono stati ottenuti utilizzando una sequenza diversa che conteneva due lesioni ossidative. Le potenziali modifiche da considerare includono l'eliminazione dell'uso del dispositivo di filtraggio o la considerazione di matrici diverse per lo spotting MALDI.

Ad esempio, acido sinapinico o acido picolinico. I frammenti di RNA sono stati ottenuti da un processo enzimatico. Questo processo è stato stabilito accoppiando MALDI, analisi elettroforetica, sintesi in fase solida e dicroismo circolare.

Il protocollo descritto ha un potenziale per essere utilizzato in vari campi, dalla ricerca nelle scienze chimiche alle applicazioni in campo biomedico.