Name: La sensibilità della membrana mitocondriale interna a Na+ rivela pool di CoQ funzionali parzialmente segmentati (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-20T13:15:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Scopri un saggio semplificato per studiare i pool di ubiquinolo e il trasferimento di elettroni nelle membrane mitocondriali utilizzando il sodio come secondo messaggero. Questo metodo facilita la ricerca biochimica.

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Ringraziamo il Dr. R. Martínez-de-Mena, M. M. Muñoz-Hernandez, A., dr C. Jimenez e E. R. Martínez-Jimenez per l'assistenza tecnica. Questo studio è stato supportato da MICIN: RTI2018-099357-B-I00 e HFSP (RGP0016/2018). Il CNIC è sostenuto dall'Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), dal Ministerio de Ciencia, dall'Innovación y Universidades (MCNU) e dalla Fondazione Pro CNIC ed è un Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505). Figura 2 creata con BioRender.com.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti seguendo la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e sono stati approvati dal comitato etico istituzionale del Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC), Spagna, in conformità con la direttiva dell'Unione europea del 22 settembre 2010 (2010/63 / UE) e con il regio decreto spagnolo del 1 ° febbraio 2013 (53/2013). Tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo il numero di animali utilizzati e la loro sofferenza.
NOTA: Questo test comparativo per studiare la segmentazione dei pool di CoQ mitocondriale è descritto come segue:
1. Quantificazione delle proteine
<ol><li>Congelare e scongelare i mitocondri isolati26 da un fegato di topo selvatico tre volte (cioè membrane mitocondriali) prima della sperimentazione per rendere gli organelli permeabili ai substrati di reazione.</li>
	<li>Quantificare la quantità proteica del campione di mitocondri isolati con i metodi bradford o acido bicinchoninico (BCA). Nel caso di Bradford, aggiungere 2 μL di campione in 1 mL di 1x reagente bradford.</li>
	<li>Dividere il campione in quattro sottocampioni da 20 μg ciascuno (vale a dire: A, B, C, D; Figura 2A).</li>
</ol>2. Misurazione dell'attività CI+CIII
NOTA: questa parte del protocollo utilizza i campioni A e B per misurare l'attività CI+CIII (Figura 2B).
<ol><li>Dividere i campioni A e B in due sottocampioni da 10 μg ciascuno (vale a dire A1, A2, B1 e B2). Mescolare ciascuno dei sottocampioni in una cuvetta da 1 mL con 30 μL di cyt c (10 mg/mL), 10 μL di 100 mM di malonato e aggiungere il tampone preriscaldato C1/C2 (Tabella 1) a 37 °C fino a 980 μL (979 μL per le cuvette A2 e B2). ATTENZIONE: Questa fase prevede l'uso dei reagenti tossici malonato e cianuro di potassio. NOTA: cyt c (10 mg/mL) deve essere preparato fresco mescolando 10 mg di cyt c in 1 mL di soluzione 10 mM K2HPO4 , pH regolato a 7,2 e deve essere mantenuto nel ghiaccio per tutta la durata dell'esperimento.</li>
	<li>Aggiungere 10 μL di 1 M KCl nelle cuvette A1 e A2 e aggiungere 10 μL di 1 M NaCl nelle cuvette B1 e B2.</li>
	<li>Aggiungere 1 μL di 1 mM di rotenone nella cuvetta contenente i sottocampioni A2 e B2. ATTENZIONE: Questo passaggio prevede l'uso del reagente tossico rotenone.</li>
	<li>Subito prima della misurazione, aggiungere 10 μL di NADH (10 mM) in tutte le cuvette. NOTA: I 10 μL vengono preferibilmente aggiunti sul gradino della cuvetta, quindi la reazione inizia al momento della miscelazione.</li>
	<li>Mescolare la cuvetta capovolgendola con cura tre volte. Posizionarlo nel lettore di cuvette ad assorbanza (spettrofotometro UV/VISJASCO).</li>
	<li>Fare clic su Misura > Parametri > Generale e impostare i parametri di misurazione su Lunghezza d'onda: 550 nm e Tempo: 4 minuti di lettura; premere i pulsanti Accetta e Start per iniziare l'esperimento.</li>
	<li>Al termine della misurazione, salvare la pendenza comprendente l'aumento lineare dell'assorbanza facendo clic su File e Salva con nome. La pendenza può anche essere raccolta manualmente.</li>
</ol>3. Misurazione dell'attività CII+CIII
NOTA: questa parte del protocollo utilizza i campioni C e D per misurare l'attività CII+CIII (Figura 2C).
<ol><li>Dividere i campioni C e D in due sottocampioni da 10 μg ciascuno (vale a dire C1, C2, D1 e D2). Mescolare ciascuno dei sottocampioni in una cuvetta da 1 mL con 30 μL di cyt c (10 mg/mL), 1 μL di 1 mM di rotenone e aggiungere tampone C1/C2 preriscaldato a 37 °C fino a 980 μL (970 μL per le cuvette C2 e D2). ATTENZIONE: Questo passaggio prevede l'uso dei reagenti tossici cianuro di potassio e rotenone. NOTA: cyt c (10 mg/mL) deve essere preparato fresco mescolando 10 mg di cyt c in 1 mL di soluzione 10 mM K2HPO4 , pH regolato a 7,2 e deve essere mantenuto nel ghiaccio per tutta la durata dell'esperimento.</li>
	<li>Aggiungere 10 μL di 1 M KCl nelle cuvette C1 e C2 e aggiungere 10 μL di 1 M NaCl nelle cuvette D1 e D2.</li>
	<li>Aggiungere 1 μL di 1 mM di antimicina A nella cuvetta contenente i sottocampioni C2 e D2. ATTENZIONE: Questa fase prevede l'uso del reagente tossico antimicina A.</li>
	<li>Subito prima della misurazione, aggiungere 10 μL di succinato (1 M) in tutte le cuvette. NOTA: I 10 μL vengono preferibilmente aggiunti sul gradino della cuvetta, quindi la reazione inizia al momento della miscelazione.</li>
	<li>Mescolare la cuvetta con cura, capovolgendola tre volte. Posizionarlo nel lettore di cuvette ad assorbanza (spettrofotometro UV/VIS).</li>
	<li>Fare clic su Misura > Parametri > Generale e impostare i parametri di misura su Lunghezza d'onda: 550 nm e Tempo: 4 minuti di lettura; premere i pulsanti Accetta e Start per iniziare l'esperimento.</li>
	<li>Al termine della misurazione, salvare la pendenza comprendente l'aumento lineare dell'assorbanza facendo clic su File e Salva con nome. La pendenza può anche essere raccolta manualmente.</li>
</ol>

<ol><li>Calvo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+of+respiratory+supercomplexes+in+mice%3A+SCAF1+relevance+and+segmentation+of+the+Qpool%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Functional role of respiratory supercomplexes in mice: SCAF1 relevance and segmentation of the Qpool.</a> Science Advances. 6 (26), (2020).</li>
<li>Garcia-Poyatos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaf1+promotes+respiratory+supercomplexes+and+metabolic+efficiency+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Scaf1 promotes respiratory supercomplexes and metabolic efficiency in zebrafish.</a> EMBO Reports. 21 (7), 50287(2020).</li>
<li>Lapuente-Brun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplex+assembly+determines+electron+flux+in+the+mitochondrial+electron+transport+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain.</a> Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).</li>
<li>Cogliati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+super-assembly+of+respiratory+complexes+III+and+IV%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV.</a> Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).</li>
<li>Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Degliesposti, G., Skehel, M., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+respiratory+Supercomplex+I%2BIII2+reveal+functional+and+conformational+crosstalk%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Structures of respiratory Supercomplex I+III2 reveal functional and conformational crosstalk.</a> Molecular Cell. 75 (6), 1131-1146 (2019).</li>
<li>Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+active+mitochondrial+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Respiratory active mitochondrial supercomplexes.</a> Molecular Cell. 32 (4), 529-539 (2008).</li>
<li>Jeon, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+substrate+pool+revealed+by+cryo-EM+of+a+lipid-preserved+respiratory+supercomplex%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">A dynamic substrate pool revealed by cryo-EM of a lipid-preserved respiratory supercomplex.</a> Antioxidants and Redox Signaling. , (2021).</li>
<li>Gu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+architecture+of+the+mammalian+respirasome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The architecture of the mammalian respirasome.</a> Nature. 537 (7622), 639-643 (2016).</li>
<li>Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+architecture+of+respiratory+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The architecture of respiratory supercomplexes.</a> Nature. 537 (7622), 644-648 (2016).</li>
<li>Sousa, J. S., Mills, D. J., Vonck, J., Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+asymmetry+and+electron+flow+in+the+bovine+respirasome%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Functional asymmetry and electron flow in the bovine respirasome.</a> Elife. 5, 21290(2016).</li>
<li>Andreasson, C., Ott, M., Buttner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+orchestrate+proteostatic+and+metabolic+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Mitochondria orchestrate proteostatic and metabolic stress responses.</a> EMBO Reports. 20 (10), 47865(2019).</li>
<li>Berndtsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+supercomplexes+enhance+electron+transport+by+decreasing+cytochrome+c+diffusion+distance%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Respiratory supercomplexes enhance electron transport by decreasing cytochrome c diffusion distance.</a> EMBO Reports. 21 (12), 51015(2020).</li>
<li>Bianchi, C., Genova, M. L., Parenti Castelli, G., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+respiratory+chain+is+partially+organized+in+a+supercomplex+assembly%3A+kinetic+evidence+using+flux+control+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial respiratory chain is partially organized in a supercomplex assembly: kinetic evidence using flux control analysis.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36562-36569 (2004).</li>
<li>Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+organization+of+respiratory+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Supramolecular organization of respiratory complexes.</a> Annual Review of Physiology. 78, 533-561 (2016).</li>
<li>Genova, M. L., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+appraisal+of+the+role+of+respiratory+supercomplexes+in+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A critical appraisal of the role of respiratory supercomplexes in mitochondria.</a> Biological Chemistry. 394 (5), 631-639 (2013).</li>
<li>Letts, J. A., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+the+supercomplex%3A+the+higher-order+organization+of+the+mitochondrial+electron+transport+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Clarifying the supercomplex: the higher-order organization of the mitochondrial electron transport chain.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 24 (10), 800-808 (2017).</li>
<li>Milenkovic, D., Blaza, J. N., Larsson, N. G., Hirst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enigma+of+the+respiratory+chain+supercomplex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">The enigma of the respiratory chain supercomplex.</a> Cell Metabolism. 25 (4), 765-776 (2017).</li>
<li>Moe, A., Di Trani, J., Rubinstein, J. L., Brzezinski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+and+kinetics+reveal+electron+transfer+by+2D+diffusion+of+cytochrome+c+in+the+yeast+III-IV+respiratory+supercomplex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure and kinetics reveal electron transfer by 2D diffusion of cytochrome c in the yeast III-IV respiratory supercomplex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (11), 2021157118(2021).</li>
<li>Szibor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+consequences+from+xenotopic+expression+of+a+tunicate+AOX+in+mouse+mitochondria%3A+Switch+from+RET+and+ROS+to+FET%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta.+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic consequences from xenotopic expression of a tunicate AOX in mouse mitochondria: Switch from RET and ROS to FET.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Bioenergetics. 1861 (2), 148137(2020).</li>
<li>Guaras, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CoQH2%2FCoQ+ratio+serves+as+a+sensor+of+respiratory+chain+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The CoQH2/CoQ ratio serves as a sensor of respiratory chain efficiency.</a> Cell Reports. 15 (1), 197-209 (2016).</li>
<li>Hernansanz-Agustin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%28%2B%29+controls+hypoxic+signalling+by+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Na(+) controls hypoxic signalling by the mitochondrial respiratory chain.</a> Nature. 586 (7828), 287-291 (2020).</li>
<li>Vercellino, I., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assembly%2C+regulation+and+function+of+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 23 (2), 141-161 (2022).</li>
<li>Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+the+respiratory+supercomplexes%3A+the+plasticity+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).</li>
<li>Enriquez, J. A., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coenzyme+q+and+the+respiratory+chain%3A+coenzyme+q+pool+and+mitochondrial+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Syndromology%22%5BJournal%5D)">Coenzyme q and the respiratory chain: coenzyme q pool and mitochondrial supercomplexes.</a> Molecular Syndromology. 5 (3-4), 119-140 (2014).</li>
<li>Hernansanz-Agustin, P., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+segmentation+of+CoQ+and+cyt+c+pools+by+respiratory+complex+superassembly%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Functional segmentation of CoQ and cyt c pools by respiratory complex superassembly.</a> Free Radical Biology and Medicine. 167, 232-242 (2021).</li>
<li>Fernandez-Vizarra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondria+for+biogenetical+studies%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update.</a> Mitochondrion. 10 (3), 253-262 (2010).</li>
<li>Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+functional+role+of+the+electron+transport+chain+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes.</a> Biochemical Society Transactions. 49 (6), 2655-2668 (2021).</li>
<li>den Brave, F., Becker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplex+formation+boosts+respiration%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Supercomplex formation boosts respiration.</a> EMBO Reports. 21 (12), 51830(2020).</li>
<li>Perez-Mejias, G., Guerra-Castellano, A., Diaz-Quintana, A., Dela Rosa, M. A., Diaz-Moreno, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+c%3A+Surfing+off+of+the+mitochondrial+membrane+on+the+tops+of+Complexes+III+and+IV%5BTitle%5D)+AND+%22Computational+and+Structural+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Cytochrome c: Surfing off of the mitochondrial membrane on the tops of Complexes III and IV.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 654-660 (2019).</li>
<li>Stepanova, A., Valls, A., Galkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+monovalent+cations+on+the+kinetics+of+hypoxic+conformational+change+of+mitochondrial+complex+I%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Effect of monovalent cations on the kinetics of hypoxic conformational change of mitochondrial complex I.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (10), 1085-1092 (2015).</li>
<li>Acin-Perez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+to+measure+mitochondrial+respiration+in+frozen+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples.</a> The EMBO Journal. 39 (13), 104073(2020).</li>
<li>Böckmann, R. A., Hac, A., Heimburg, T., Grubmüller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+sodium+chloride+on+a+lipid+bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Effect of sodium chloride on a lipid bilayer.</a> Biophysical Journal. 85 (3), 1647-1655 (2003).</li>
<li>Cordomí, A., Edholm, O., Perez, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ions+on+a+dipalmitoyl+phosphatidylcholine+bilayer.+a+molecular+dynamics+simulation+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Effect of ions on a dipalmitoyl phosphatidylcholine bilayer. a molecular dynamics simulation study.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 112 (5), 1397-1408 (2008).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Sebbene questo protocollo rappresenti una procedura molto semplice per identificare l'esistenza dei pool di CoQ parzialmente segmentati, ci sono alcuni passaggi critici da prendere in considerazione. I substrati (cioè NADH o succinato) sono preferibilmente aggiunti per ultimi poiché può verificarsi l'autoossidazione di questi composti. Il capovolgimento della cuvetta deve essere attento per evitare la formazione di bolle che potrebbero interferire con la lettura.
Inoltre, la presente tecnica p...

Il sistema di fosforilazione ossidativa mitocondriale (OXPHOS) è la principale via che guida la sintesi dell'adenosina trifosfato (ATP), la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e il consumo di equivalenti riducenti, come nicotinamide adenina dinucleotide (NADH) o succinato, da parte dei mitocondri. Il sistema OXPHOS è composto da cinque complessi proteici: il Complesso I (CI) ossida il NADH e riduce il CoQ in ubichinolo (CoQH2). Il Complesso II (CII) ossida il succinato in fumarato e riduce il CoQ in CoQH2. Il Complesso III (CIII) ossida nuovamente il CoQH2 in CoQ, riducendo il citocromo c (cyt c). Infine, il complesso IV (CIV) ossida cyt c e riduce l'ossigeno in acqua. Questa catena di ossidoriduzione, la cosiddetta catena di trasporto degli elettroni (mETC), è accoppiata al pompaggio di H + attraverso l'IMM, che crea un gradiente elettrochimico utilizzato dal complesso V (CV) per fosforilare l'adenosina difosfato (ADP) in ATP.
I complessi mETC possono essere soli nell'IMM o assemblarsi in strutture quaternarie chiamate supercomplessi. CIV può assemblarsi con CIII, formando il III2+IV o Q-respirasome (in quanto è in grado di respirare in presenza di CoQH2)1,2,3 o formando omodimeri o omooligomeri4. CIII può interagire con CI, formando il supercomplesso I+III25. Infine, CI è anche in grado di interagire con il Q-respirasome, costruendo l'I+III2+IV o N-respirasome (in quanto può respirare consumando NADH)1,6,7,8,9,10.
CoQ e cyt c sono portatori mobili di elettroni incaricati di trasferire elettroni da CI/CII a CIII e da CIII a CIV, rispettivamente. Se i supercomplessi impongano o meno una restrizione locale funzionale per questi vettori è stato oggetto di intenso dibattito negli ultimi due decenni 2,7,11,12,13,14,15,16,17. Tuttavia, diversi gruppi indipendenti hanno dimostrato che CoQ e cyt c possono essere segmentati funzionalmente in pool nell'IMM. Per quanto riguarda il CoQ, può essere segmentato funzionalmente in uno specifico pool di CoQ per CI (CoQNAD) e un altro pool dedicato agli enzimi FAD-dipendenti (CoQFAD)1,7,12,18,19. Tuttavia, al fine di differenziare l'esistenza di pool di CoQ funzionali parzialmente segmentati, è stata richiesta la sovraespressione dell'ossidasi alternativa (AOX) e la generazione di specifici mutanti del mtDNA, che possono assemblare CI in assenza di CIII, 1,19,20.
Il meccanismo di produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) durante l'ipossia era sconosciuto fino a poco tempo fa. In caso di ipossia acuta, l'IC subisce la transizione attiva/disattivativa (A/D), che comporta la diminuzione della sua attività di pompaggio H+ della NADH-CoQ ossidoreduttasi. Tale diminuzione del pompaggio H+ acidifica la matrice mitocondriale e dissolve parzialmente i precipitati calcio-fosfato nella matrice mitocondriale, rilasciando Ca2+ solubile. Questo aumento di Ca2+ solubile attiva lo scambiatore Na+/Ca2+ (NCLX), che estrude Ca2+ in cambio di Na+. L'aumento mitocondriale di Na+ interagisce con i fosfolipidi nel lato interno dell'IMM, diminuendone la fluidità e il trasferimento di CoQ tra CII e CIII, producendo infine anione superossido, un segnale redox21. È interessante notare che il trasferimento di CoQ è diminuito solo tra CII e CIII, ma non tra CI e CIII, evidenziando che 1) Na + è stato in grado di modulare solo uno dei pool coQ esistenti nei mitocondri; 2) esistono pool di CoQ funzionalmente differenziati nell'IMM. Pertanto, un protocollo ampiamente utilizzato per lo studio delle attività enzimatiche mitocondriali può essere utilizzato per valutare l'esistenza dei pool di CoQ menzionati.
L'attuale protocollo si basa sulla misura della riduzione del cyt c ossidato, il substrato del CIII, per assorbanza in presenza di succinato (cioè substrato CII) o NADH (cioè substrato CI). Lo stesso campione è diviso in due, uno dei quali sarà trattato con KCl e l'altro con la stessa concentrazione di NaCl. In questo modo, dato che Na+ diminuisce la fluidità IMM, se coQ esistesse in un pool unico nell'IMM, sia CI+CIII che CII+CIII diminuirebbero in presenza di Na+. Tuttavia, se il CoQ esistesse in pool di CoQ funzionali parzialmente segmentati, l'effetto di Na+ sarebbe per lo più (o solo) evidente sull'attività CII+CIII, ma non sull'IC+CIII. Come recentemente pubblicato21, Na+ influisce solo sul trasferimento di CoQ tra CII e CIII (Figura 1C,D), ma non tra CI e CIII (Figura 1A,B).
Questo protocollo, insieme a una panoplia di tecniche, è stato utilizzato per confermare l'esistenza di pool di CoQ funzionali parzialmente segmentati nell'IMM, uno dedicato all'IC (cioè CoQNAD) e un altro dedicato agli enzimi legati alla FAD (cioè CoQFAD)1,3,7; un'osservazione che, sebbene continui ad essere discussa22, è stata corroborata indipendentemente da diversi gruppi 7,19. Pertanto, il superassemblaggio di CI in supercomplessi influisce sulla mobilità locale del CoQ, facilitandone l'utilizzo da parte del CIII all'interno del supercomplesso 1,7,13,14,23,24,25.

<table><tbody><tr><td>Antimicina A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td>Saggio delle proteine <td>Sigma-Aldrich</td><td>10775835001</td><td></td></tr><tr><td>Bradford</td><td>Bio-Rad</td><td>5000001</td><td></td></tr><tr><td>Citocromo c da cuore equino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7752</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Acido malonico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1296</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Roche</td><td>10107735001</td><td></td></tr><tr><td>Cianuro di potassio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>207810</td><td></td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Spectra Manager software</td><td>JASCO</td><td>versione 2</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro</td><td>UV/VISJASCO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Succinato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>398055</td><td></td></tr></tbody></table>

la sensibilità della membrana mitocondriale interna a na+ rivela pool di coq funzionali parzialmente segmentati

Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools

I pool di ubichinone (CoQ) nella membrana mitocondriale interna (IMM) sono parzialmente segmentati in enzimi del complesso I o FAD-dipendenti. Tale suddivisione può essere facilmente valutata mediante un saggio comparativo che utilizza NADH o succinato come donatori di elettroni nei mitocondri congelati-scongelati, in cui viene misurata la riduzione del citocromo c (cyt c). Il test si basa sull'effetto di Na+ sull'IMM, diminuendone la fluidità. Qui presentiamo un protocollo per misurare l'attività della NADH-cyt c ossidoreduttasi e le attività della succinato-cyt c ossidoreduttasi in presenza di NaCl o KCl. Le reazioni, che si basano sulla miscela di reagenti in una cuvetta in modo graduale, vengono misurate spettrofotometricamente durante 4 minuti in presenza di Na+ o K+. La stessa miscela viene eseguita in parallelo in presenza degli specifici inibitori enzimatici al fine di sottrarre la variazione aspecifica dell'assorbanza. L'attività della NADH-cyt c ossidoreduttasi non diminuisce in presenza di nessuno di questi cationi. Tuttavia, l'attività della succinato-cit c ossidoreduttasi diminuisce in presenza di NaCl. Questo semplice esperimento evidenzia: 1) l'effetto di Na+ nel diminuire la fluidità IMM e il trasferimento di CoQ; 2) che il supercomplesso I+III2 protegge il trasferimento di ubichinone (CoQ) dall'essere influenzato dall'abbassamento della fluidità IMM; 3) che il trasferimento di CoQ tra CI e CIII è funzionalmente diverso dal trasferimento di CoQ tra CII e CIII. Questi fatti supportano l'esistenza di pool di CoQ funzionalmente differenziati nell'IMM e mostrano che possono essere regolati dal mutevole ambiente Na+ dei mitocondri.

I risultati tipici di questo protocollo sono rappresentati di seguito (Figura 3). Poiché l'assorbanza cyt c ridotta si trova a 550 nm, tutti i sottocampioni disinibiti devono mostrare un aumento dell'assorbanza a 550 nm. I sottocampioni inibiti mostrano idealmente una pendenza piatta o leggermente crescente (Figura 3). Le pendenze dei sottocampioni inibiti devono essere sottratte dai sottocampioni disinibiti.
I campioni A e B, entramb...

Questo protocollo descrive un test comparativo, utilizzando attività complesse mitocondriali CI+CIII e CII+CIII in presenza o assenza di Na+, per studiare l'esistenza di pool di CoQ funzionali parzialmente segmentati.

La sensibilità della membrana mitocondriale interna a Na+ rivela pool di CoQ funzionali parzialmente segmentati

Ubiquinone (CoQ) pools in the inner mitochondrial membrane (IMM) are partially segmented to either complex I or FAD-dependent enzymes. Such subdivision ...

Questo protocollo evidenzia il ruolo del sodio come secondo messaggero e mostra anche l'esistenza di pool di ubichinolo parzialmente differenziati. Questa tecnica dimostra un approccio estremamente semplice per lo studio delle piscine di ubichinolo che altrimenti richiede modelli cellulari molto specifici. Questo approccio può essere utilizzato per lo studio del trasferimento di elettroni in altre membrane, in particolare di enzimi all'interno di gocce lipidiche.Dividere i campioni in quattro sottocampioni di 20 microgrammi ciascuno ed etichettarli da A a D.Dividere i campioni A e B in due sottocampioni di 10 microgrammi ciascuno ed etichettarli come A1, A2, B1 e B2. Preparare il buffer C1/C2 come descritto nel protocollo di testo e preriscaldare a 37 gradi Celsius. In una cuvetta da un millilitro, aggiungere ciascuno dei sottocampioni a 30 microlitri di citocromo c e 10 microlitri di malonato. Aggiungere il buffer C1/C2 per portare il volume a 980 microlitri nelle cuvette A1 e B1 e 979 microlitri in A2 e B2. Aggiungere 10 microlitri di cloruro di potassio monofusolare nelle cuvette A1 e A2 e 10 microlitri di cloruro di sodio monofusolare in B1 e B2. Aggiungere un microlitro di rot

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La sensibilità della membrana mitocondriale interna a Na⁺ rivela pool di CoQ funzionali parzialmente segmentati

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