Microscopia a fluorescenza intravitale a campo largo della microcircolazione polmonare polmonare polmonare acuta sperimentale utilizzando un sistema di imaging stabilizzato sotto vuoto

Questo protocollo descrive in dettaglio la preparazione chirurgica e l'uso di un sistema stabilizzato sotto vuoto per visualizzare l'adesione dei leucociti polmonari e la perfusione capillare in vivo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'imaging intravitale stabile ad alta risoluzione del polmone specchio intatto con traumi fisici minimi. Per iniziare, preparare la finestra di imaging somministrando un sottile strato di grasso sottovuoto nella parte superiore dell'anello esterno evitando la contaminazione del canale del vuoto.

Posizionare un coperchio di vetro pulito da 8 millimetri sulla finestra e premere delicatamente verso il basso per creare una guarnizione. Collegare la finestra di imaging a una pompa per vuoto dotata di un manometro digitale e in grado di fornire da 50 a 60 millimetri di aspirazione costante al mercurio. Passare una lunghezza di cavo in fibra ottica attraverso una cannula endotracheale calibro 20 e immergere la punta in lidocaina HCL.

Dopo l'anestesia, inserire un otoscopio modificato, in modo tale che gli incisivi superiori si inseriscano nello spazio nello speculum. Regolare l'ambito e la posizione della lingua fino a quando l'epiglottide e le corde vocali sono chiaramente visibili. Inserire il cavo in fibra ottica attraverso lo spazio nello speculum e utilizzare piccoli movimenti circolari per far passare il cavo tra le corde vocali, quindi utilizzando il cavo in fibra ottica come guida, far scorrere delicatamente la cannula nella trachea per intubare il mouse.

Dopo aver iniziato la ventilazione con isoflurano all'1,5%, confermare la profondità dell'anestesia testando il riflesso del pedale. Fissare la cannula al muso con nastro adesivo. Utilizzare il nastro adesivo per fissare la zampa anteriore destra alla piastra riscaldante a ore nove ed estendere caudalmente la zampa posteriore sinistra e fissarla alla posizione delle sei.

Usando un nastro di stoffa, allungare leggermente la zampa anteriore sinistra fino alla posizione a ore 12 e fissare l'altra estremità del nastro alla parte superiore della piattaforma di microscopia intravitale, quindi applicare una sonda di temperatura rettale e un pulsossimetro a zampa per monitorare i segni vitali durante l'esperimento. Per preparare il topo all'intervento chirurgico, sterilizzare il torace e l'addome con una salvietta alcolica al 70% e applicare una leggera mano di olio minerale per smorzare i capelli sul lato sinistro del mouse. Fare una piccola incisione vicino al fondo della gabbia toracica per esporre lo strato muscolare sottostante, quindi estendere l'incisione iniziale e utilizzare la dissezione smussata per esporre la gabbia toracica.

Usando una pinza emostatica, afferrare il tessuto epiteliale e adiposo sezionato e posizionarlo libero dall'area chirurgica. Per etichettare fluorescentemente i leucociti e il flusso sanguigno, somministrare un bolo di 2,5 millilitri per chilogrammo di Rhodamine 6G e FITC-albumina attraverso la vena della coda. Usando una pinza dentata, afferrare la costola immediatamente inferiore alla posizione della base del polmone all'estremità dell'ispirazione.

Ritrarre leggermente la pinza per allontanare la costola dal polmone e quindi tagliare la costola per indurre uno pneumotorace. Estendere l'incisione lateralmente in entrambe le direzioni, facendo attenzione a non toccare il polmone. Afferrare la costola più alta successiva con una pinza smussata e ritrarsi leggermente per consentire al polmone di allontanarsi dalla parete toracica.

Se il polmone non si stacca, premere leggermente la parete toracica contro il polmone per far sì che il polmone aderisca alla pleura sottostante e quindi cada più facilmente. Continuare l'incisione originale alla fine fino allo sterno e cranicamente fino a quando l'apice del polmone è esposto. Utilizzare applicatori di cotone e garze per attenuare qualsiasi sanguinamento che si presenta.

Sollevare la gabbia toracica per esporre i vasi sanguigni intercostali sull'aspetto dorsale della cavità toracica, facendo attenzione a non danneggiare il polmone, cauterizzare il vaso intercostale più inferiore vicino alla colonna vertebrale, quindi tagliare la costola adiacente. Muovendosi cranicamente, e alla fine, utilizzare un modello ripetuto di cauterizzazione e taglio per asportare una porzione di circa uno per due centimetri della gabbia toracica. Per prepararsi all'imaging, trasferire la piattaforma di microscopia intravitale allo stadio del microscopio e posizionare la finestra di imaging direttamente sopra il polmone esposto.

Utilizzare il micropolatore per abbassare attentamente la finestra di imaging fino a quando non aderisce e stabilizza la superficie polmonare. Per visualizzare la microcircolazione polmonare, utilizzare un microscopio a fluorescenza ad ampio campo dotato di un obiettivo 20x e set di filtri FITC e Rhodamine standard. Utilizzare una telecamera CCD in bianco e nero per registrare i video con un contrasto ottimale.

Utilizzando il set di filtri FITC, identificare una sede polmonare in base al modello convergente del flusso sanguigno e registrare un video di 30 secondi con la sede a fuoco, quindi ripetere la registrazione nello stesso campo visivo utilizzando il filtro Rhodamine impostato per visualizzare i leucociti. Per individuare un'arteria polmonare, utilizzare il set di filtri FITC per identificare un vaso con un modello divergente di flusso sanguigno e registrare un video di 30 secondi. Ripeti la registrazione nello stesso campo visivo usando il set di filtri Rhodamine per visualizzare i leucociti.

Per localizzare le regioni capillari di interesse, utilizzare il set di filtri FITC per identificare un'area di alveoli e capillari non intersecati da vasi più grandi e registrare un video di 30 secondi. Ripeti la registrazione nello stesso campo visivo usando il set di filtri Rhodamine per visualizzare i leucociti. Questo video mostra l'imaging FITC del flusso sanguigno all'interno di una sede polmonare come indicato dalla freccia verde.

L'imaging della rodamina consente la visualizzazione dei leucociti nella stessa sede con due leucociti aderenti indicati dalle frecce rosse. Questi metodi sono stati applicati anche per visualizzare gli stessi fenomeni e le arterie polmonari e le regioni capillari di interesse. Per dimostrare la quantificazione dei parametri microcircolatori, i topi sono stati trattati con LPS intranasale per indurre l'infiammazione polmonare.

Il traffico di leucociti nelle sedi polmonari è mostrato qui con aree delineate che rappresentano le regioni endoteliali analizzate in topi naïve e trattati con LPS. L'adesione e il rotolamento dei leucociti sono aumentati nei topi trattati con LPS. Il traffico leucocitario nelle arterie polmonari è mostrato qui con aree delineate che rappresentano le regioni endoteliali analizzate in topi naïve e trattati con LPS.

L'adesione dei leucociti era più alta nei topi trattati con LPS. Questa figura mostra l'adesione dei leucociti all'interno dei capillari polmonari in topi naïve e trattati con LPS. L'adesione dei leucociti ha dimostrato di essere più alta nei topi trattati con LPS rispetto agli ingenui.

Questa figura mostra la perfusione di capillari polmonari in topi naïve e trattati con LPS. La densità capillare funzionale ha dimostrato di essere inferiore nei topi trattati con LPS rispetto agli ingenui. Ci sono molti aspetti impegnativi di questo protocollo.

Ottimizzare il posizionamento del mouse sulla piattaforma è un semplice passo che può rendere le fasi chirurgiche e di imaging molto più riproducibili. Questa procedura è adattabile a una vasta gamma di parametri di studio e approcci microscopici. Pertanto, dovrebbe facilitare ulteriori ricerche sulla microcircolazione polmonare sia in stati sani che malati.