Name: Microscopia a fluorescenza intravitale a campo largo della microcircolazione polmonare polmonare polmonare acuta sperimentale utilizzando un sistema di imaging stabilizzato sotto vuoto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T14:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Scopri la microscopia a fluorescenza intravitale per studiare le interazioni leucocita-endotelio e la perfusione capillare nel polmone. Questo metodo stabilizzato sotto vuoto consente imaging ad alta risoluzione con minimo trauma fisico.

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Gli autori desiderano ringraziare la dott.ssa Pina Colarusso, che ha fornito una significativa esperienza nella redazione e revisione di questo manoscritto.

Tutte le procedure qui descritte sono state eseguite previa approvazione da parte del Comitato per gli animali da laboratorio dell'Università di Dalhousie (UCLA).
1. Preparazione
<ol><li>Sistema di imaging polmonare: per preparare la finestra, somministrare un sottile strato di grasso sottovuoto nella parte superiore dell'anello esterno evitando la contaminazione del canale del vuoto. Posizionare un coperchio di vetro pulito da 8 mm sulla finestra e premere delicatamente verso il basso per creare una guarnizione.</li>
	<li>Microscopio a fluorescenza a campo largo: consente di eseguire l'imaging con un microscopio a fluorescenza a campo largo convenzionale dotato di un obiettivo a lunga distanza di lavoro 20x/0,40 e di una telecamera CCD (Charge-Coupled Device) in bianco e nero con un frame-rate di 25 FPS. Applicare un filtro di eccitazione passa-banda da 530-550 nm per eccitare Rhodamine-6G e un filtro passa-banda da 460-490 nm per eccitare l'isotiocianato di fluoresceina (FITC).</li>
	<li>Sistema per vuoto: collegare la finestra di imaging a una pompa per vuoto dotata di un manometro digitale in grado di fornire un'aspirazione costante di 50-60 mmHg, come mostrato nella Figura 1 supplementare. In breve, collegare la finestra di imaging alla pompa tramite un tubo in polietilene ID da 1,0 mm, un tubo in polietilene ID da 1,0 cm, un pallone sottovuoto e un filtro in linea da 0,2 μm.</li>
	<li>Ventilatore: consente di impostare un piccolo ventilatore per roditori per fornire una ventilazione a pressione controllata a una velocità e un volume calcolati in base al peso del mouse. Fornire una pressione positiva di fine espirazione (PEEP) a 5 cmH2O per tutta la durata dell'esperimento e impostare la pressione target su 20 cmH2O.</li>
	<li>Anestetico: utilizzando un sistema di somministrazione di anestesia a basso flusso, innescare una siringa da 5,0 ml con isoflurano al 99,9%. Utilizzare un sistema di evacuazione dei gas di scarico per ridurre al minimo il rischio di inalazione da parte del chirurgo.</li>
</ol>2. Anestesia
<ol><li>Posizionare un topo C57Bl/6 maschio di 20-25 g di 12 settimane nella camera di induzione dell'anestesia. Con la camera saldamente chiusa, iniziare l'induzione con gas isoflurano ad una concentrazione del 3% e una portata di 500 ml/min.</li>
	<li>Una volta che il mouse è anestetizzato (visualizzato dalla frequenza respiratoria rallentata), trasferirlo al supporto di intubazione e fissare gli incisivi superiori alla sutura pendente.</li>
	<li>Stringere la sutura per fissare il muso all'interno del cono del naso. Iniziare il flusso di gas attraverso il cono del naso ad una concentrazione del 2,5%.</li>
	<li>Confermare un'adeguata profondità di anestesia tramite pizzicamento della punta prima di passare al passaggio successivo.</li>
</ol>3. Intubazione
<ol><li>Ruotare il supporto in modo tale che la parte posteriore del supporto e il lato dorsale della faccia del topo verso il chirurgo.</li>
	<li>Passare la punta di un cavo in fibra ottica lungo 20 cm attraverso una cannula endotracheale da 20 G e immergere la punta in Lidocaina HCl (1%) per facilitare il passaggio del cavo attraverso la laringe.</li>
	<li>Usando una pinza smussata, sollevare la mascella inferiore e spostare la lingua per fornire un passaggio chiaro nel tratto respiratorio.</li>
	<li>Inserire un otoscopio modificato (~ 60 ° di circonferenza dello speculum rimosso) in modo tale che gli incisivi superiori si inseriscano nello spazio nello speculum. Regolare l'ambito e la posizione della lingua fino a quando l'epiglottide e le corde vocali sono chiaramente visibili.</li>
	<li>Inserire il cavo in fibra ottica caricato con la cannula endotracheale attraverso lo spazio nello speculum e nella laringe. Usando piccoli movimenti circolari, passa il cavo attraverso le corde vocali e nella trachea.</li>
	<li>Spingere la cannula lungo il cavo in fibra ottica, passando tra le corde vocali e nella trachea.</li>
</ol>4. Ventilazione
<ol><li>Recupera il mouse dal supporto per l'intubazione e posizionalo su una piastra riscaldante nella posizione di decubito laterale destro.</li>
	<li>Collegare la cannula al tubo del ventilatore e avviare il ventilatore. Ridurre la concentrazione di anestetico all'1,5% e monitorare la profondità testando il riflesso del pedale. Se il riflesso persiste, aumentare la concentrazione in modo incrementale fino al 2%.</li>
	<li>Metti il gel lacrimale negli occhi del mouse per evitare l'essiccazione.</li>
	<li>Usando il nastro adesivo, fissare la cannula al muso. Usando il nastro adesivo, fissare la zampa anteriore destra alla piastra riscaldante approssimativamente a ore 9. Estendere caudalmente la zampa posteriore sinistra e fissarla approssimativamente a ore 6.</li>
	<li>Usando un nastro di stoffa, allungare leggermente la zampa anteriore sinistra fino alla posizione a ore 12 e fissare l'altra estremità del nastro alla parte superiore della piattaforma IVM come mostrato nella Figura 2A (mantenere una leggera tensione qui facilita la toracotomia successiva).</li>
	<li>Inserire una sonda di temperatura rettale e fissare la sonda fissandola alla piastra riscaldante. Posizionare un pulsossimetro sulla zampa posteriore destra e fissarlo alla piastra riscaldante, facendo attenzione a non interrompere la circolazione.</li>
	<li>Una volta che la temperatura è stabile a 37,0 °C ± 0,1 °C, procedere all'esecuzione della toracotomia.</li>
</ol>5. Toracotomia
<ol><li>Sterilizzare il torace e l'addome con una salvietta alcolica al 70%. Applicare una leggera mano di olio minerale per inumidire i capelli sul lato sinistro del topo, dallo sterno alla colonna vertebrale e dalla spalla al fondo della gabbia toracica.</li>
	<li>Con pinze smussate e forbici dritte, fai una piccola incisione longitudinale vicino al fondo della gabbia toracica per esporre lo strato muscolare sottostante.</li>
	<li>Muovendosi ventralmente, utilizzare la dissezione smussata per separare il tessuto epiteliale e adiposo dallo strato muscolare. Cauterizzare eventuali vasi sanguigni esposti. Una volta che il rischio di perdita di sangue è stato mitigato, estendere l'incisione originale ventralmente fino al processo xifoide.</li>
	<li>Ripetere questo processo dorsalmente fino a ~ 5 mm lateralmente alla colonna vertebrale.</li>
	<li>Muovendosi cranicamente, utilizzare la dissezione smussata per esporre la gabbia toracica. Cauterizzare eventuali vasi sanguigni esposti per preservare la stabilità emodinamica.</li>
	<li>Una volta che il rischio di perdita di sangue è stato mitigato, estendere l'incisione dal processo xifoide all'ascella.</li>
	<li>Ripetere questo processo sul lato dorsale dell'incisione fino a ~ 1 cm inferiore all'orecchio sinistro.</li>
	<li>Utilizzando una pinza emostatica, afferrare il tessuto epiteliale e adiposo sezionato e posizionarlo libero dall'area chirurgica (Figura 2B).</li>
	<li>Iniettare una soluzione di Rhodamine-6G (0,5 mg/mL; 1,5 mL/kg) per la visualizzazione dei leucociti e della FITC-albumina bovina (50 mg/mL; 1 mL/kg) per la visualizzazione della perfusione capillare attraverso la vena della coda.</li>
	<li>Usando una pinza dentata, afferrare la costola immediatamente inferiore alla posizione della base del polmone all'estremità dell'ispirazione e ritrarre leggermente per allontanare la costola dal polmone. Tagliare la costola per indurre uno pneumotorace.</li>
	<li>Estendere l'incisione lateralmente lungo il muscolo intercostale in entrambe le direzioni, facendo attenzione a non toccare la superficie polmonare esposta.</li>
	<li>Usando una pinza smussata, afferrare la costola successiva più alta e ritrarsi leggermente per consentire al polmone di allontanarsi dalla parete toracica. Se il polmone non si stacca, premere leggermente la parete toracica contro il polmone per far sì che il polmone aderisca alla pleura sottostante e quindi cada più facilmente.</li>
	<li>Continuare l'incisione originale ventralmente fino allo sterno e cranicamente fino a quando l'apice del polmone è esposto. Utilizzare applicatori di cotone e garze per attenuare qualsiasi sanguinamento che si presenta.</li>
	<li>Sollevare la cassa toracica per esporre i vasi sanguigni intercostali sull'aspetto dorsale della cavità toracica. Fare attenzione a non danneggiare il polmone, cauterizzare il vaso intercostale più inferiore vicino alla colonna vertebrale e quindi tagliare la costola. Muovendosi cranicamente e ventralmente, ripetere fino a quando una porzione di circa 1 cm x 1,5 cm della cassa toracica viene asportata (Figura 2C).</li>
	<li>Rimuovere qualsiasi accumulo di liquidi in eccesso nella cavità toracica tramite azione capillare utilizzando piccole strisce di garza.</li>
	<li>Mentre si procede alla microscopia, consentire ~ 5 minuti per il fluido intrapleurico di dissiparsi per un'interfaccia più sicura tra il polmone e la finestra di imaging.</li>
</ol>6. Microscopia
<ol><li>Accendere la pompa per vuoto e regolare la pressione a ~ 50-60 mmHg.</li>
	<li>Trasferire la piattaforma IVM allo stadio del microscopio. Posizionare il palo metallico e il micromanipolatore in modo tale che la finestra di imaging si trovi direttamente sopra il polmone esposto e il braccio della finestra si avvicini al polmone da, approssimativamente, la posizione a ore 3.</li>
	<li>Utilizzando il micromanipolatore, abbassare attentamente la finestra di imaging fino a quando non aderisce e stabilizza la superficie polmonare (Figura 3A).</li>
	<li>Utilizzando l'obiettivo 20x e il filtro di eccitazione passa-banda 460-490 nm, identificare una venula polmonare in base al modello convergente del flusso sanguigno. Centra la nave nel campo visivo e registra 30 s di video.<ol>
<li>Passa al filtro di eccitazione passa-banda 530-550 nm e registra 30 s di video nello stesso campo visivo.</li>
		<li>Ripetere il passaggio precedente fino a quando non sono state riprodotte cinque venule polmonari.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizzando il filtro di eccitazione passa-banda 460-490 nm, identificare un'arteriola polmonare in base al modello divergente del flusso sanguigno. Centra la nave nel campo visivo e registra 30 s di video.<ol>
<li>Passa al filtro di eccitazione passa-banda 530-550 nm e registra 30 s di video nello stesso campo visivo.</li>
		<li>Ripetere il passaggio precedente fino a quando cinque arteriole polmonari sono state riprese.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizzando il filtro di eccitazione passa-banda 460-490 nm, individuare una regione di alveoli e capillari non intersecati da vasi più grandi e registrare 30 s di video.<ol>
<li>Passa al filtro di eccitazione passa-banda 530-550 nm e registra 30 s di video nello stesso campo visivo.</li>
		<li>Ripetere il passaggio precedente fino a quando non sono state visualizzate cinque regioni capillari.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Eutanasia e protocollo di pulizia
<ol><li>Rimuovere la piattaforma IVM dallo stadio del microscopio e regolare la consegna dell'isoflurano al 5% per 5 minuti per eutanasizzare il mouse.</li>
	<li>Durante l'attesa, scartare il vetro di copertura e scollegare la finestra di imaging dalla piattaforma. Pulire la finestra di imaging con un piccolo pennello e utilizzare una siringa da 30 G inserita nel canale per sciacquarla più volte con acqua distillata. Quindi, sciacquare con etanolo al 95% utilizzando la pompa per vuoto.</li>
	<li>Dopo 5 minuti, arrestare il ventilatore e garantire l'eutanasia completa tramite lussazione cervicale.</li>
</ol>

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<li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+permanent+window+for+the+murine+lung+enables+high-resolution+imaging+of+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis.</a> Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).</li>
<li>Amato, M. B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+a+protective-ventilation+strategy+on+mortality+in+the+acute+respiratory+distress+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Effect of a protective-ventilation strategy on mortality in the acute respiratory distress syndrome.</a> New England Journal of Medicine. 338 (6), 347-354 (2009).</li>
<li>Looney, M. R., Bhattacharya, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Live imaging of the lung.</a> Annual Review of Physiology. 76, 431-445 (2013).</li>
</ol>

La dott.ssa Kamala D. Patel è presidente e co-fondatrice di Luxidea, l'impresa da cui è stata acquistata la finestra di imaging utilizzata in questo esperimento.

Il protocollo qui presentato richiede pratica e attenzione ad alcuni passaggi critici. In primo luogo, è importante preparare la finestra di imaging prima di iniziare l'intubazione e la chirurgia. Utilizzare una quantità minima di grasso sottovuoto per rivestire l'anello esterno della finestra di imaging, applicare il vetro di copertura e testare l'aspirazione con una goccia di acqua distillata. Prepararlo in anticipo impedirà al polmone esposto di asciugarsi durante l'installazione, altrimenti. Mentre è possibile lavare...

La microscopia intravitale (IVM) è un utile strumento di imaging per visualizzare e studiare vari processi biofisici in vivo. Il polmone è molto difficile da fotografare in vivo a causa della sua posizione chiusa, della natura fragile del suo tessuto e degli artefatti di movimento indotti dalla respirazione e dal battito cardiaco 1,2. Sono state sviluppate varie configurazioni di microscopia intravitale (IVM) per l'imaging in tempo reale delle interazioni leucocita-endoteliali nella microcircolazione polmonare per superare queste sfide. Tali approcci si basano sull'esposizione chirurgica e sulla stabilizzazione del polmone per l'imaging.
Gli animali sono in genere preparati per l'IVM polmonare mediante procedure chirurgiche. In primo luogo, gli animali vengono intubati e ventilati, il che consente l'escissione chirurgica di una finestra toracica e successivi interventi per stabilizzare il polmone per l'imaging. Una tecnica prevede l'incollaggio del parenchima su un coverslip3 di vetro, una procedura che rischia un trauma fisico significativo al tessuto ripreso. Più avanzato è l'utilizzo di un sistema di vuoto per stabilizzare il polmone sotto una finestra di vetro4. Questa configurazione facilita l'aderenza sciolta della superficie polmonare al coverslip tramite un vuoto reversibile distribuito su una vasta area locale ed espande il polmone limitando comunque il movimento nelle dimensioni x, y e z4. Il vuoto viene applicato uniformemente attraverso un canale che circonda l'area di imaging della configurazione e tira il tessuto in una regione conica poco profonda di fronte al coverslip4 di grado di imaging. Attraverso questa finestra di visualizzazione, la microcircolazione polmonare può essere studiata utilizzando varie modalità di imaging ottico.
Lung IVM consente l'imaging quantitativo di una moltitudine di parametri microcircolatori. Questi includono misurazioni come la velocità e la lunghezza della traccia leucocitaria5, la velocità del flusso dei globuli rossi6 e l'ossigenazione7, le metastasi tumorali8, la distinzione delle sottopopolazioni di cellule immunitarie 9,10,11, la visualizzazione delle microparticelle12, la dinamica alveolare 13,14, la permeabilità vascolare15 e la funzione capillare 16 . L'attenzione qui è sul reclutamento dei leucociti e sulla funzione capillare. L'inizio del reclutamento dei leucociti nella microcircolazione polmonare comporta interazioni transitorie di rotolamento e interazioni adesive solide tra leucociti e cellule endoteliali, entrambe aumentate in condizioni infiammatorie16,17. Tipicamente, il rotolamento è quantificato dal numero di leucociti che passano una linea di riferimento definita dall'operatore, mentre l'adesione è quantificata dal numero di leucociti che sono immobili sull'endotelio16. La funzione capillare può anche essere influenzata negli stati infiammatori, spesso con conseguente diminuzione della perfusione. Ciò può essere attribuito a diversi fattori, tra cui una riduzione della deformabilità dei globuli rossi18 e l'espressione variegata di NO sintasi inducibile da parte delle cellule endoteliali con conseguente smistamento patologico19. Tipicamente, la lunghezza aggregata dei capillari perfusi per area viene misurata e riportata come densità capillare funzionale (FCD).
Studiare il reclutamento dei leucociti nei polmoni in tempo reale richiede l'etichettatura di bersagli biologici con coloranti fluorescenti o anticorpi marcati fluorescenti20. In alternativa, vari ceppi di topo transgenico come i topi lysozyme M-green fluorescent protein (LysM-GFP) possono essere utilizzati per visualizzare specifici sottoinsiemi di cellule immunitarie come i neutrofili21,22. I leucociti marcati fluorescenti possono quindi essere visualizzati utilizzando la microscopia a fluorescenza a campo largo, la microscopia confocale o la microscopia multifotonica. Queste tecniche raggiungono il contrasto utilizzando specifiche lunghezze d'onda di eccitazione e rilevando la fluorescenza emessa, bloccando contemporaneamente il rilevamento della lunghezza d'onda di eccitazione, evidenziando così l'oggetto etichettato.
La ricerca esistente riguardante la quantificazione del rotolamento dei leucociti, l'adesione e la densità capillare funzionale nel polmone murino si è basata principalmente sull'analisi video manuale. Ciò è reso possibile da software open source come Fiji 6,23, software proprietario come CapImage12 o sistemi di elaborazione delle immagini personalizzati24. Al contrario, varie piattaforme software proprietarie (ad esempio, NIS Element, Imaris, Volocity, MetaMorph) consentono la misurazione automatizzata di una vasta gamma di altri parametri fisiologici, tra cui molti di quelli precedentemente menzionati qui 5,6,7,8,9,10,11,12,13,15.
Importanti osservazioni sono state fatte per quanto riguarda la patologia della lesione polmonare acuta (ALI) e della sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS) utilizzando IVM polmonare. L'ARDS è caratterizzata da una serie di processi fisiopatologici nel polmone, tra cui edema polmonare e danno alveolare causato da disfunzione dell'endotelio e della barriera epiteliale25. Utilizzando un modello murino, è stato scoperto che l'ALI indotta dalla sepsi è associata a significativi cambiamenti dannosi nel traffico di cellule immunitarie nell'ambiente polmonare26. I neutrofili reclutati nei capillari dei topi con ALI indotta da sepsi sono stati trovati per impedire la microcircolazione, aumentando così l'ipossia in ALI26. Inoltre, IVM è stato utilizzato per ottenere informazioni sul meccanismo di riparazione sottostante dopo l'inizio di ARDS27. Lung IVM è stato anche uno strumento prezioso per comprendere i cambiamenti fisiopatologici in varie malattie polmonari ostruttive. Ad esempio, la visualizzazione del trasporto di muco in malattie come la fibrosi cistica (FC) e la broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) ha facilitato lo studio di trattamenti nuovi ed esistenti per la clearance mucosa28. Il traffico di leucociti in queste condizioni è stato analizzato anche17.
Questo protocollo espande l'approccio inizialmente descritto da Lamm et al.29 per studiare le interazioni leucocita-endoteliali utilizzando la microscopia a fluorescenza convenzionale. Le procedure descritte impiegano un sistema di imaging polmonare in vivo , che include una base metallica di 16,5 cm x 12,7 cm, un micromanipolatore e una finestra di imaging a vuoto (Figura 1). Il sistema è montato in una piattaforma stampata 3D di 20 cm x 23,5 cm (file supplementare 1) per fornire un fissaggio sicuro per il tubo del ventilatore e la piastra riscaldante. Questo metodo offre immagini riproducibili e quantificabili della microcircolazione polmonare murina in vivo. Aspetti importanti della preparazione chirurgica e il corretto utilizzo di un sistema di imaging polmonare stabilizzato sotto vuoto sono spiegati in dettaglio. Infine, un modello sperimentale di ALI viene utilizzato per fornire immagini e analisi rappresentative del rotolamento alterato dei leucociti, dell'adesione dei leucociti e della perfusione capillare associata all'infiammazione. L'uso di questo protocollo dovrebbe facilitare ulteriori importanti indagini sui cambiamenti fisiopatologici nella microcircolazione polmonare durante gli stati di malattia acuta.

<table><tbody><tr><td>Siringa BD Luer Slip Tip da 1 mL sterile, monouso</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>309659</td><td>Siringa da 1 mL</td></tr><tr><td>Pinza per medicazione ADSON, larghezza punta 0,6 mm, lunghezza denti 11,5 mm, 12 cm</td><td>RWD Life Science Co.</td><td>F12002-12</td><td>Pinze smussate</td></tr><tr><td>Albumina-fluoresceina Isotiocianato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9771-1G</td><td>FITC-albumina</td></tr><tr><td>Tampone alcolico Alcool isopropilico 70% v / v</td><td>Canadian Custom Packaging Company</td><td>80002455</td><td>Salvietta imbevuta di alcol</td></tr><tr><td>AVDC110 Convertitore video digitale avanzato</td><td>Canopus</td><td>00631069602029</td><td>Convertitore video digitale</td></tr><tr><td>B / N - CCD - Imaging</td> a <td>tromba della fotocamera</td><td>BC-71</td><td>Camera</td></tr><tr><td>Bovie Deluxe Kit di cauterizzazione ad alta temperatura</td><td>Strumenti di scienza fine</td><td>18010-00</td><td>Cauterizzatore</td></tr><tr><td>C57BL / 6 Topi</td><td>Charles River Laboratories International</td><td>C57BL / 6NCrl</td><td>C57BL / 6 Topi</td></tr><tr><td>Applicatori con punta in cotone</td><td>Puritan</td><td>806-WC</td><td>Applicatore</td></tr><tr><td>CS-8R 8mm Vetrino coprioggetto rotondo</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0701</td><td>Vetrino coprioggetti in vetro</td></tr><tr><td>Manometro digitale</td><td>ITM Instruments Inc.</td><td>DG2551L0NAM02L0IM& V</td><td>Manometro digitale</td></tr><tr><td>Dr Mom Slimline Stainless LED Otoscopio</td><td>Dr. Mom Otoscopi</td><td>1001</td><td>Otoscopio</td></tr><tr><td>Etilalcolico 95% Vol</td><td>Alcoli commerciali</td><td>P016EA95</td><td>95% etanolo</td></tr><tr><td>Forbici fini - Acciaio inossidabile martensitico</td><td>Fine Science Tools</td><td>14094-11</td><td>Forbici</td></tr><tr><td>Fisherbrand Nastro per etichettatura colorato</td><td>Fisher Scientific</td><td>1590110</td><td>Nastro adesivo</td></tr><tr><td>Gast DOA-P704-AA Pompa per vuoto ad alta capacità</td><td>Cole-Parmer Canada Company</td><td>ZA-07061-40</td><td>Pompa per vuoto</td></tr><tr><td>Hartman Hemostats</td><td>Fine Science Tools</td><td>13003-10</td><td>Pinze emostatiche</td></tr><tr><td>Grasso per vuoto Dow</td><td>Corning</td><td>DC976VF</td><td>Grasso per vuoto</td></tr><tr><td>Isoflurano USP</td><td>Fresenius Kabi</td><td>CP0406V2</td><td>Isoflurano</td></tr><tr><td>LIDOcaina HCl Iniezione 1% 50 mg/5 mL</td><td>Teligent Canada</td><td>0121AD01</td><td>Lidocaina HCl 1%</td></tr><tr><td>Lung SurgiBoard</td><td>Luxidea, Inc.</td><td>IMCH-0001</td><td>Progettato per la microscopia intravitale del polmone</td></tr><tr><td>Olio minerale</td><td>Teva Canada</td><td>00485802</td><td>Olio minerale</td></tr><tr><td>Kit per intubazione endotracheale di topo</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>ETI-MSE</td><td>Supporto per intubazione, maschera per anestesia, cannula endotracheale da 20 G, cavo in fibra ottica</td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza MST49</td> Leica <td>Microsystems</td><td>10 450 022</td><td>Microscopio a fluorescenza</td></tr><tr><td>N Plan L 20x/0.40 Obiettivo per microscopio a lunga distanza di lavoro</td><td>Leica Microsystems</td><td>566035</td><td>20x Obiettivo</td></tr><tr><td>Spugne non tessute 2" x 2"</td><td>AMD-Ritmed</td><td>A2101-CH</td><td>Garza</td></tr><tr><td>Optixcare Eye Lube Plus</td><td>Aventix</td><td>5914322</td><td>Gel lacrimale</td></tr><tr><td>Original Prusa i3 MK3S+ Stampante 3D</td><td>Prusa Research</td><td>PRI-MK3S-KIT-ORG-PEI Stampante</td><td>3D</td></tr><tr><td>Ossigeno, Compresso</td><td>Linde Canada Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ago Precision Glide per ossigeno 30 G x 1/2 (0,3 mm x 13 mm)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>305106</td><td>Ago da 30 G</td></tr><tr><td>Pyrex 5340-2L 5340 Palloni filtranti, 2000 mL</td><td>Cole-Parmer Canada Company</td><td>5340-2L</td><td>Pallone sottovuoto</td></tr><tr><td>Rhodamine 6 G</td><td>Sigma-Aldrich 252433</td><td></td><td>Rhodamine 6G</td></tr><tr><td>Secure Soft Cloth Medical Tape - 3"</td><td>Primed</td><td>PM5-630709</td><td>Nastro in tessuto</td></tr><tr><td>Silastic Medical Grade Tubing .040 in. ID x .085 pollici. OD</td><td>Dow Corning</td><td>602-205</td><td>Tubo in polietilene con diametro interno di 1,0 mm</td></tr><tr><td>Sistema di anestesia a basso flusso Somnosuite</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>SS-01, modulo SS-04</td><td>Piccolo ventilatore per roditori, Sistema di anestesia a basso flusso, Termoforo, Sonda di temperatura rettale, Pulsossimetro</td></tr><tr><td>Pinze per tessuti, lunghe 12,5 cm, curve, 1 x 2 denti</td><td>World Precision Instruments</td><td>501216</td><td>Pinze</td></tr> <tr><td>dentateNastro medico transporo, 1527-1, 1 in x 10 yd (2,5 cm x 9,1 m)</td> <td>3M</td><td>7000002795</td><td>Tubo nastro medico</td></tr><tr><td>, trasparente, 3/8 in diametro interno.</td><td>Grainger Canada</td><td>USSZUSA-HT3314</td><td>Tubo in polietilene con diametro interno da 1,0 cm</td></tr><tr><td>Whatman 6720-5002 Filtri in linea da 50 mm, PTFE, 0,2 e micro; m</td><td>Cole-Parmer Canada Company</td><td>6720-5002</td><td>in linea 0.2&micro; Filtro M</td></tr></tbody></table>

microscopia a fluorescenza intravitale a campo largo della microcircolazione polmonare polmonare polmonare acuta sperimentale utilizzando un sistema di imaging stabilizzato sotto vuoto

Intravital Widefield Fluorescence Microscopy of Pulmonary Microcirculation in Experimental Acute Lung Injury Using a Vacuum-Stabilized Imaging System

L'imaging intravitale delle interazioni leucocita-endoteliali offre preziose informazioni sulla malattia immuno-mediata negli animali vivi. Lo studio della lesione polmonare acuta (ALI) / sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS) e di altre patologie respiratorie in vivo è difficile a causa della limitata accessibilità e degli artefatti di movimento intrinseci dei polmoni. Tuttavia, sono stati sviluppati vari approcci per superare queste sfide. Questo protocollo descrive un metodo per la microscopia a fluorescenza intravitale per studiare in tempo reale le interazioni leucocita-endoteliale nella microcircolazione polmonare in un modello sperimentale di ALI. Un sistema di imaging polmonare in vivo e una piattaforma di microscopia intravitale stampata in 3D vengono utilizzati per proteggere il topo anestetizzato e stabilizzare il polmone riducendo al minimo le lesioni polmonari confondenti. Dopo la preparazione, la microscopia a fluorescenza a campo largo viene utilizzata per studiare l'adesione dei leucociti, il rotolamento dei leucociti e la funzione capillare. Mentre il protocollo qui presentato si concentra sull'imaging in un modello acuto di malattia polmonare infiammatoria, può anche essere adattato per studiare altri processi patologici e fisiologici nel polmone.

Per illustrare i risultati ottenibili attraverso questo protocollo, la lesione polmonare acuta (ALI) è stata indotta 6 ore prima dell'imaging utilizzando un modello di instillazione batterica intranasale di lipopolisaccaride (LPS). In breve, i topi (n = 3) sono stati anestetizzati con isoflurano e piccole goccioline di LPS da Pseudomonas aeruginosa in soluzione salina sterile (10 mg / mL) sono state pipettate nel naris sinistro alla dose di 5 mg / kg. Questo è stato confrontato con topi naïve (n = 3; nessuna som...

La microscopia a fluorescenza intravitale può essere utilizzata per studiare le interazioni leucocita-endoteliali e la perfusione capillare in tempo reale. Questo protocollo descrive i metodi per visualizzare e quantificare questi parametri nel microcircolo polmonare utilizzando un sistema di imaging polmonare stabilizzato nel vuoto.

Microscopia a fluorescenza intravitale a campo largo della microcircolazione polmonare polmonare polmonare acuta sperimentale utilizzando un sistema di imaging stabilizzato sotto vuoto

Intravital imaging of leukocyte-endothelial interactions offers valuable insights into immune-mediated disease in live animals. The study of acute lung ...

Questo protocollo descrive in dettaglio la preparazione chirurgica e l'uso di un sistema stabilizzato sotto vuoto per visualizzare l'adesione dei leucociti polmonari e la perfusione capillare in vivo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'imaging intravitale stabile ad alta risoluzione del polmone specchio intatto con traumi fisici minimi. Per iniziare, preparare la finestra di imaging somministrando un sottile strato di grasso sottovuoto nella parte superiore dell'anello esterno evitando la contaminazione del canale del vuoto.Posizionare un coperchio di vetro pulito da 8 millimetri sulla finestra e premere delicatamente verso il basso per creare una guarnizione. Collegare la finestra di imaging a una pompa per vuoto dotata di un manometro digitale e in grado di fornire da 50 a 60 millimetri di aspirazione costante al mercurio. Passare una lunghezza di cavo in fibra ottica attraverso una cannula endotracheale calibro 20 e immergere la punta in lidocaina HCL.Dopo l'anestesia, inserire un otoscopio modificato, in modo tale che gli incisivi superiori si inseriscano nello spazio nello speculum. Regolare l'ambito e la posizione della lingua fino a quando l'epiglottide e le corde vocali sono chiaramente visibili. Inserire il cavo in fibra ottica attraverso lo spazio nello speculum e utilizzare piccoli movimenti circolari per far passare il cavo tra le corde vocali, quindi utilizzando il cavo in fibra ottica come guida, far scorrere delicatamente la cannula nella trachea per intubare il mouse.Dopo aver iniziato la ventilazione con isoflurano all'1,5%, confermare la profondità dell'anestesia testando il riflesso del pedale. Fissare la cannula al muso con nastro adesivo. Utilizzare il nastro adesivo per fissare la zampa anteriore destra alla piastra riscaldante a ore nove ed estendere caudalmente la zampa posteriore sinistra e fissarla alla posizione delle sei.Usando un nastro di stoffa, allungare leggermente la zampa anteriore sinistra fino alla posizione a ore 12 e fissare l'altra estremità del nastro alla parte superiore della piattaforma di microscopia intravitale, quindi applicare una sonda di temperatura rettale e un pulsossimetro a zampa per monitorare i segni vitali durante l'esperimento. Per preparare il topo all'intervento chirurgico, sterilizzare il torace e l'addome con una salvietta alcolica al 70% e applicare una leggera mano di olio minerale per smorzare i capelli sul lato sinistro del mouse. Fare una piccola incisione vicino al fondo della gabbia toracica per esporre lo strato muscolare sottostante, quindi estendere l'incisione iniziale e utilizzare la dissezione smussata per esporre la gabbia toracica.Usando una pinza emostatica, afferrare il tessuto epiteliale e adiposo sezionato e posizionarlo libero dall'area chirurgica. Per etichettare fluorescentemente i leucociti e il flusso sanguigno, somministrare un bolo di 2,5 millilitri per chilogrammo di Rhodamine 6G e FITC-albumina attraverso la vena della coda. Usando una pinza dentata, afferrare la costola immediatamente inferiore alla posizione della base del polmone all'estremità dell'ispirazione.Ritrarre leggermente la pinza per allontanare la costola dal polmone e quindi tagliare la costola per indurre uno pneumotorace. Estendere l'incisione lateralmente in entrambe le direzioni, facendo attenzione a non toccare il polmone. Afferrare la costola più alta successiva con una pinza smussata e ritrarsi leggermente per consentire al polmone di allontanarsi dalla parete toracica.Se il polmone non si stacca, premere leggermente la parete toracica contro il polmone per far sì che il polmone aderisca alla pleura sottostante e quindi cada più facilmente. Continuare l'incisione originale alla fine fino allo sterno e cranicamente fino a quando l'apice del polmone è esposto. Utilizzare applicatori di cotone e garze per attenuare qualsiasi sanguinamento che si presenta.Sollevare la gabbia toracica per esporre i vasi sanguigni intercostali sull'aspetto dorsale della cavità toracica, facendo attenzione a non danneggiare il polmone, cauterizzare il vaso intercostale più inferiore vicino alla colonna vertebrale, quindi tagliare la costola adiacente. Muovendosi cranicamente, e alla fine, utilizzare un modello ripetuto di cauterizzazione e taglio per asportare una porzione di circa uno per due centimetri della gabbia toracica. Per prepararsi all'imaging, trasferire la piattaforma di microscopia intravitale allo stadio del microscopio e posizionare la finestra di imaging direttamente sopra il polmone esposto.Utilizzare il micropolatore per abbassare attentamente la finestra di imaging fino a quando non aderisce e stabilizza la superficie polmonare. Per visualizzare la microcircolazione polmonare, utilizzare un microscopio a fluorescenza ad ampio campo dotato di un obiettivo 20x e set di filtri FITC e Rhodamine standard. Utilizzare una telecamera CCD in bianco e nero per registrare i video con un contrasto ottimale.Utilizzando il set di filtri FITC, identificare una sede polmonare in base al modello convergente del flusso sanguigno e registrare un video di 30 secondi con la sede a fuoco, quindi ripetere la registrazione nello stesso campo visivo utilizzando il filtro Rhodamine impostato per visualizzare i leucociti. Per individuare un'arteria polmonare, utilizzare il set di filtri FITC per identificare un vaso con un modello divergente di flusso sanguigno e registrare un video di 30 secondi. Ripeti la registrazione nello stesso campo visivo usando il set di filtri Rhodamine per visualizzare i leucociti.Per localizzare le regioni capillari di interesse, utilizzare il set di filtri FITC per identificare un'area di alveoli e capillari non intersecati da vasi più grandi e registrare un video di 30 secondi. Ripeti la registrazione nello stesso campo visivo usando il set di filtri Rhodamine per visualizzare i leucociti. Questo video mostra l'imaging FITC del flusso sanguigno all'interno di una sede polmonare come indicato dalla freccia verde.L'imaging della rodamina consente la visualizzazione dei leucociti nella stessa sede con due leucociti aderenti indicati dalle frecce rosse. Questi metodi sono stati applicati anche per visualizzare gli stessi fenomeni e le arterie polmonari e le regioni capillari di interesse. Per dimostrare la quantificazione dei parametri microcircolatori, i topi sono stati trattati con LPS intranasale per indurre l'infiammazione polmonare.Il traffico di leucociti nelle sedi polmonari è mostrato qui con aree delineate che rappresentano le regioni endoteliali analizzate in topi naïve e trattati con LPS. L'adesione e il rotolamento dei leucociti sono aumentati nei topi trattati con LPS. Il traffico leucocitario nelle arterie polmonari è mostrato qui con aree delineate che rappresentano le regioni endoteliali analizzate in topi naïve e trattati con LPS.L'adesione dei leucociti era più alta nei topi trattati con LPS. Questa figura mostra l'adesione dei leucociti all'interno dei capillari polmonari in topi naïve e trattati con LPS. L'adesione dei leucociti ha dimostrato di essere più alta nei topi trattati con LPS rispetto agli ingenui.Questa figura mostra la perfusione di capillari polmonari in topi naïve e trattati con LPS. La densità capillare funzionale ha dimostrato di essere inferiore nei topi trattati con LPS rispetto agli ingenui. Ci sono molti aspetti impegnativi di questo protocollo.Ottimizzare il posizionamento del mouse sulla piattaforma è un semplice passo che può rendere le fasi chirurgiche e di imaging molto più riproducibili. Questa procedura è adattabile a una vasta gamma di parametri di studio e approcci microscopici. Pertanto, dovrebbe facilitare ulteriori ricerche sulla microcircolazione polmonare sia in stati sani che malati.

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