Microscopia elettronica a trasmissione in situ indotta dalla luce per l'osservazione dell'interazione liquido-materia molle
26 luglio 2022
Il presente protocollo descrive le modifiche al microscopio elettronico a trasmissione (TEM) con un sistema di illuminazione della luce, la fabbricazione di cellule liquide e osservazioni TEM in situ delle interazioni indotte dalla luce tra cellule batteriche e un fotosensibilizzatore. Vengono inoltre discussi i metodi di preparazione del campione, il danno al fascio di elettroni e l'imaging.
Il protocollo presenta come la combinazione di TEM a celle liquide e illuminazione della luce può essere utilizzata per osservare i cambiamenti strutturali nei batteri incapsulati con fotosensibilizzatore su illuminazione della luce. Il principale vantaggio di questa tecnica è la sua semplicità. Il protocollo non richiede una difficile preparazione del campione e fornisce un incapsulamento sufficiente dei batteri con soluzione fotosensibilizzante.
Per iniziare, modificare il microscopio elettronico a trasmissione collegando la fibra ottica alla colonna del microscopio nella parte superiore della lente dell'obiettivo. Lasciare alcuni centimetri di spazio tra la lente dell'obiettivo e la lente del condensatore, oltre a una fessura libera per gli accessori. Posizionare due griglie TEM non trattate ricoperte di carbonio amorfo tra due pinzette incrociate, rivolte verso l'alto verso l'alto.
Tenere le griglie il più vicino possibile al bordo. Metti quattro microlitri di soluzione batterica su una delle griglie. La densità ottica del campione deve essere compresa tra cinque e 10.
Attendere 60 secondi e asciugare accuratamente il liquido con carta da filtro. Cerca di distribuire il liquido su tutta la superficie della griglia durante il processo. Metti quattro microlitri di fotosensibilizzatore sulla stessa griglia.
Dopo cinque secondi, asciugare il liquido. Lasciare uno strato molto sottile di liquido sul substrato. Posizionare rapidamente la griglia asciutta sopra quella coperta di liquido.
Spostare delicatamente la griglia superiore sul bordo della seconda e spremere i substrati ai bordi usando una pinzetta. Ripetere attentamente la compressione. Lasciare la cellula liquida tra le pinzette per un minuto.
Inserire il campione nel supporto TEM subito dopo aver terminato la preparazione. Dopo aver inserito il campione nel microscopio, avviare le osservazioni in modalità a basso ingrandimento per trovare un'area di osservazione adatta. Durante le osservazioni mantenere la dose di elettroni più bassa possibile.
Espandi il tempo di esposizione. Trova le celle circondate da liquido all'ingrandimento appropriato con un tempo di esposizione prolungato e cattura immediatamente la prima immagine. Mantieni costante la dose di elettroni e raccogli immagini ogni 30 secondi per osservare i cambiamenti.
Esaminare attentamente le immagini e calcolare la dose totale di elettroni che corrisponde ai primi cambiamenti visibili nelle cellule. Prima di iniziare l'esperimento, impostare l'intensità della luce laser regolando il valore corrente. Inserire il campione nel microscopio e trovare l'area di osservazione.
Acquisire la prima immagine della cella prima di iniziare l'illuminazione del campione e utilizzare il beam blanker per spegnere il fascio di elettroni per evitare gli effetti dell'irradiazione elettronica. Accendi il laser. Inizia con un breve tempo di illuminazione, poiché la luce laser ha un'intensità relativamente elevata.
Dopo quel tempo, spegnere la fonte di luce. Disattiva il beam blanker e acquisisci immediatamente l'immagine. Se possibile, utilizzare un algoritmo automatico per esporre il campione solo per il tempo necessario per l'acquisizione dell'immagine.
Misurare attentamente il tempo di irradiazione elettronica per calcolare la dose di elettroni utilizzata per l'imaging. Si osserva una notevole degradazione dello strato esterno della cellula causata dalle specie reattive dell'ossigeno generate dalla radiazione più leggera del fotosensibilizzatore dopo un minuto. Un'ulteriore illuminazione luminosa ha reso i cambiamenti più visibili.
Punti di osservazione adeguati con abbastanza liquido possono essere facilmente trovati a basso ingrandimento, poiché queste aree appaiono più scure e sfocate. I batteri coperti di liquido sono meno visibili di quelli secchi, ma possono ancora essere distinti. È utile osservare il confine del liquido durante l'imaging e il suo movimento può essere facilmente rilevato, il che implica che l'area scelta potrebbe essere inadatta e instabile.
Un altro problema durante le osservazioni è l'evaporazione dell'acqua e la precipitazione della soluzione che può verificarsi in aree casuali del campione, comprese le aree circostanti i batteri. L'incapsulamento dei batteri può essere eseguito anche utilizzando membrane di grafene e nitrato di silicio. La preparazione del campione è più difficile, ma la stabilità della cella liquida sarà migliore.
Il metodo presentato può essere utilizzato per osservazioni di reazioni indotte dalla luce su liquido. Ad esempio, l'influenza della luce su materiali metallici, catalizzatori indotti dalla luce e reazioni fotochimiche.
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Panoramica
Questo protocollo descrive l'uso della microscopia elettronica a trasmissione (TEM) abbinata all'illuminazione luminosa per studiare le interazioni batteriche con un fotosensibilizzatore. Si sottolinea la semplicità del metodo e l'efficace incapsulamento dei batteri.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Neuroscienze
- Biophysica
- Microbiologia
Sfondo
- La microscopia elettronica a trasmissione (TEM) è una tecnica di imaging potente.
- L'illuminazione luminosa può migliorare l'osservazione dei campioni biologici.
- I fotosensibilizzatori sono composti che producono specie reattive dell'ossigeno in seguito all'esposizione alla luce.
- Comprendere le interazioni batteriche con i fotosensibilizzatori è fondamentale per varie applicazioni.
Scopo dello studio
- Dimostrare un metodo per osservare i cambiamenti strutturali nei batteri.
- Semplificare il processo di preparazione del campione per la microscopia elettronica a trasmissione (TEM).
- Esplorare le interazioni tra batteri e fotosensibilizzatori durante l'esposizione alla luce.
Metodi Utilizzati
- Modifica del MET con un sistema di illuminazione luminosa.
- Realizzazione di celle liquide per l'incapsulamento del campione.
- Osservazioni in situ di cellule batteriche.
- Utilizzo di griglie per MET non trattate per il posizionamento del campione.
Risultati principali
- Il protocollo permette un'efficace osservazione delle interazioni indotte dalla luce.
- È richiesta una preparazione minima del campione, aumentandone l'accessibilità.
- L'incapsulamento dei batteri con fotosensibilizzatore avviene in modo efficiente.
- È possibile monitorare in tempo reale i cambiamenti strutturali nei batteri.
Conclusioni
- Questo metodo fornisce un approccio diretto allo studio delle interazioni batteriche.
- Apre nuove strade di ricerca in microbiologia e biofisica.
- La combinazione di microscopia elettronica a trasmissione e illuminazione luminosa rappresenta uno strumento prezioso per i ricercatori.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La microscopia elettronica a trasmissione in situ indotta da luce consente la visualizzazione diretta delle interazioni tra liquidi e materiali morbidi sotto illuminazione controllata, supportando la riduzione dei rischi meccanicistici nella fase iniziale della scoperta. Questa capacità è fondamentale per distinguere gli effetti indotti dalla luce da quelli provocati dagli elettroni, migliorando la fiducia predittiva nella ricerca fotodinamica e catalitica. L'approccio semplifica la valutazione delle risposte dinamiche di sistemi biologici e materiali, fornendo informazioni utili per le decisioni strategiche nel passaggio tra ricerca di base e ricerca traslazionale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Prima Fase della Scoperta e Validazione del Target
- Permette l'osservazione in tempo reale di cambiamenti strutturali in campioni biologici sotto attivazione luminosa.
- Supporta la riduzione del rischio meccanicistico isolando gli effetti indotti dalla luce da artefatti dovuti agli elettroni.
- Facilita la validazione funzionale delle interazioni tra fotosensibilizzatori e batteri rilevanti per la ricerca antimicrobica.
Screening e sviluppo di saggi
- Fornisce una piattaforma per l'imaging quantitativo di processi attivati dalla luce in ambienti liquidi.
- Consente la valutazione riproducibile di cambiamenti microstrutturali con dosaggi controllati di elettroni e luce.
- Supporta la standardizzazione dei saggi permettendo una calibrazione precisa dell'illuminazione e dell'esposizione agli elettroni.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Fornisce informazioni sui meccanismi fotodinamici rilevanti per applicazioni antimicrobiche e catalitiche.
- Consente un percorso continuo dall'imaging nella fase di scoperta allo sviluppo di modelli preclinici per terapie attivate dalla luce.
- Supporta un avanzamento proporzionato al rischio chiarificando il contributo degli effetti della luce rispetto a quelli degli elettroni nei fenomeni osservati.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, consentendo un'immagine guidata da ipotesi sulle reazioni indotte dalla luce in sistemi liquidi.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui meccanismi attivati dalla luce in campioni biologici e materiali.
- Screening: Fornisce output di imaging riproducibili e quantitativi per lo sviluppo di saggi e la valutazione di composti.
- Analisi: Offre misurazioni precise della dose di elettroni e dell'intensità luminosa per distinguere i fattori meccanicistici determinanti.
- Ricerca traslazionale: Collega le prime intuizioni meccanicistiche alla validazione preclinica di interventi fotodinamici.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità modulare di imaging adattabile a diversi studi in fase liquida e guidati dalla luce.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva isolando e quantificando le variazioni microstrutturali indotte dalla luce.
- Valore operativo: Semplifica la preparazione del campione e standardizza le condizioni di acquisizione immagini per garantire riproducibilità.
- Valore strategico: Permette decisioni informate di tipo go/no-go chiarificando i contributi meccanicistici in sistemi complessi.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sul rischio di candidati terapeutici e catalitici attivati dalla luce.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'uso del microscopio elettronico a trasmissione e nella calibrazione dei sistemi di somministrazione della luce.
- Richiede un controllo preciso della dose di elettroni e dell'intensità luminosa per ottenere dati affidabili.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per quanto riguarda i protocolli di acquisizione delle immagini e la registrazione dei dati.
- Adattabile a diversi substrati (carbonio, grafene, nitruro di silicio) con profili di stabilità differenti.
- Le limitazioni potenziali includono l'evaporazione del campione e la compatibilità del substrato, come indicato nel protocollo.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:41
Encapsulation of Bacteria with the Photosensitizer
2:07
In Situ TEM Observations of Bacterial Cells in Liquid–Electron Dose Effect
2:50
In Situ TEM Observations of Light‐Induced Processes Between Bacterial Cells and Photosensitizer
3:51
Results: TEM Images of S. aureus Encapsulated with Methylene Blue Between Two Carbon Films and the Unfavorable Effects That May Occur During Imaging
4:47
Conclusion
