Name: Mantenimento della diversità cellulare del glioblastoma umano ex vivo utilizzando la coltura di organoidi tridimensionali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-25T13:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Scopri come mantenere la diversità cellulare del glioblastoma umano ex vivo utilizzando organoidi tridimensionali. Questo metodo consente di studiare l'efficacia dei farmaci e i meccanismi di resistenza in modelli tumorali realistici.

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Vorremmo ringraziare il Dr. Justin Lathia per i suoi preziosi consigli e il suo continuo supporto. Ringraziamo anche Katrina Fife, Lisa Wallace e Maya Camhi per il loro eccellente supporto tecnico.

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<li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+stem+cells+generate+vascular+pericytes+to+support+vessel+function+and+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma stem cells generate vascular pericytes to support vessel function and tumor growth.</a> Cell. 153 (1), 139-152 (2013).</li>
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<li>Hjelmeland, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acidic+stress+promotes+a+glioma+stem+cell+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Acidic stress promotes a glioma stem cell phenotype.</a> Cell Death and Differentiation. 18 (5), 829-840 (2011).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno conflitti da rivelare.

Gli organoidi GBM sono un metodo di coltura complementare alle sfere tradizionali che includono una maggiore eterogeneità cellulare e microambientale 4,22,30. Sebbene richieda più tempo e risorse, la coltura di organoidi può offrire preziose informazioni sul comportamento intratumorale e sui meccanismi di resistenza ai farmaci.
GBM è guidato da una popolazione di CSC 5,31, e questi metodi sono stati sviluppati per consentire la crescita continua e l'auto-rinnovamento di questa popolazione CSC. Il fattore di crescita epidermico (EGF) e il fattore di crescita dei fibroblasti (FGF) sono noti per migliorare il mantenimento e la crescita delle cellule staminali e fornire la segnalazione attiva del recettore tirosin-chinasi (RTK). La formazione di popolazioni cellulari eterogenee e microambienti tumorali distinti all'interno dei tumori GBM si basa sul supporto dei comportamenti CSC. La selezione di una lrECM imita l'ambiente cerebrale ricco di laminina e supporta le cellule nella coltura di organoidi per auto-organizzarsi e migrare per invasione. Sebbene alcuni gruppi abbiano stabilito una coltura di organoidi senza l'uso di un lrECM o di mezzi arricchiti con EGF / FGF24,28, che possono offrire un modo più efficiente in termini di tempo di questo metodo di coltura e una selezione più forte di segnalazione oncogena per guidare la crescita, questi metodi sono stati scelti per ottimizzare l'ambiente pro-cellule staminali per stabilire al meglio l'eterogeneità cellulare degli organoidi. Sia gli organoidi cerebrali che gli organoidi GBM sono stati realizzati con lrECM in letteratura precedentemente 21,32,33. Sebbene abbiamo stabilito dati riguardanti le popolazioni tumorali trovate all'interno degli organoidi e la variazione spaziale, si sa meno sulle popolazioni non tumorali all'interno degli organoidi e per quanto tempo sopravvivono dai campioni originali del paziente. Alcune colorazioni IHC (come CD45) possono fornire questi dati e potrebbero essere un interessante punto di ricerca in futuro con gli organoidi.
Conoscere l'uso previsto per la coltura di organoidi è importante per selezionare i metodi appropriati. La creazione di organoidi da campioni primari rispetto alla crescita di organoidi uniformi per esperimenti specifici ha procedure leggermente diverse. Avere un apprezzamento per il modo in cui gli organoidi maturano e riempiono visivamente l'impalcatura lrECM è importante per essere in grado di allocare tempo e risorse adeguati alla coltura degli organoidi. Le regioni sparse di cellule negli organoidi si espandono lentamente e crescono fino a riempire la lrECM, che può richiedere da 2 a 8 settimane, a seconda del comportamento del campione. Questo tasso di crescita è in qualche modo intrinseco a ciascun esemplare; È conservato in diversi lotti di organoidi e abbastanza coerente con il tasso relativo di crescita delle sfere. Gli organoidi possono essere mantenuti per oltre 1 anno e mantenere le capacità di formazione del tumore sullo xenotrapianto nei topi; Tuttavia, si raccomanda di coltivarli con uno scopo distinto per non sprecare risorse di laboratorio (sia materiali che tempo)4. La crescita degli organoidi è stata testata in più dimensioni e formati di pozzetti e dimostra che una piastra di 10 cm è l'impostazione ideale per mantenere la vitalità cellulare ottimale, seguita da una piastra a 6 pozzetti con tre organoidi per pozzetto34. Gli organoidi consumano più media rispetto alle loro controparti di coltura bidimensionale e l'utilizzo di un formato di pozzo più piccolo non porta a una corretta manutenzione. Ad esempio, un pozzetto di una lastra di formato 96 pozzetti non ha abbastanza spazio o volume di supporto rispetto alle dimensioni di un organoide per sostenere la crescita degli organoidi.
Come stabiliscono gli organoidi, essere osservatori è importante per aumentare il successo. Inizialmente, gli organoidi consumeranno i media lentamente, ma man mano che diventano più densi e più maturi, consumeranno i media più rapidamente. L'aggiunta di rosso fenolo ai media può aiutare a servire come indicatore del consumo dei media. Quando il terreno è più giallo, può chiederci di regolare il modello di alimentazione, sia che si tratti di scambiare un volume maggiore di media, aumentare la quantità totale di terreno nella piastra, dividere gli organoidi tra più piastre di coltura cellulare per tenere il passo con la loro crescita, o anche regolare la timeline per gli esperimenti. 
In molti modi, gli organoidi sono un modo inefficiente di condurre ricerche sul cancro. Coinvolgono lunghe scale temporali e sono costosi e pesanti in termini di risorse rispetto alla cultura della sfera GBM. Tuttavia, rispetto agli xenotrapianti derivati dal paziente, un metodo alternativo per ricreare la diversità cellulare e microambientale, sono più semplici, meno costosi e controllabili. La selezione di quando utilizzare al meglio gli organoidi è importante per i ricercatori sul cancro. Non sono destinati a sostituire la sfera tradizionale o la cultura aderente e non a sostituire i modelli di xenotrapianto. Gli organoidi possono, se applicati alla giusta domanda scientifica, combinare i benefici di entrambi questi sistemi e possono permetterci di osservare la biologia delle cellule tumorali che altrimenti rimarrebbero nascoste. La comunità scientifica sta solo iniziando a capire quali opportunità di apprendimento offrono gli organoidi, ma è chiaro che saranno uno strumento inestimabile in futuro per comprendere la complessa biologia del GBM.

Il glioblastoma (GBM) è il tumore cerebrale primario più comune con una prognosi infausta di circa 15 mesi dalla diagnosi1. I trattamenti che sono efficaci negli studi preclinici possono spesso essere scarsamente efficaci nei pazienti 2,3. La scarsa risposta clinica è attribuita a molti fattori, tra cui l'eterogeneità microambientale del GBM e le complesse interazioni intratumorali. Questi possono essere difficili da ricreare in laboratorio con metodi tradizionali di coltura aderente o a sfera4. Anche la presenza di un sottogruppo di cellule staminali tumorali autorinnovanti (CSC) all'interno del GBM può contribuire a questa complessità 5,6. Le CSCs sono cruciali per la propagazione del tumore e mantengono la crescita tumorale promuovendo l'angiogenesi attiva, l'invasione del cancro e la resistenza alle terapie, comprese le radiazioni 7,8,9. Le CSCs non sono distribuite uniformemente in tutti i tumori, ma piuttosto sono arricchite all'interno di specifici microambienti, tra cui la nicchia perivascolare e le regioni perinecrotiche, che forniscono ciascuna una regolazione molecolare distinta dei loro stati cellulari 10,11,12,13,14. Le CSC non sono destinatari passivi di segnali microambientali, ma possiedono invece la capacità di rimodellare i propri microambienti 7,15,16. Il microambiente di una CSC può promuovere il mantenimento dello stato delle cellule staminali in risposta a pressioni come scarsità di nutrienti, pH e ipossia17,18,19,20, suggerendo l'importanza di queste condizioni in un sistema modello. La ricapitolazione del diverso microambiente cellulare all'interno dei tumori è quindi fondamentale per comprendere la resistenza terapeutica e identificare nuove terapie.
La cultura tridimensionale è aumentata in popolarità negli ultimi anni21,22. Gli organoidi sono stati utilizzati in altri tipi di cancro e l'obiettivo principale di mantenere le cellule come organoidi è quello di consentire la crescita di popolazioni cellulari eterogenee (molte delle quali possono normalmente essere superate in una coltura di sfere più omogenee) e la diversità spaziale, vista come microambienti tumorali regionali con specificità genetica 4,23,24,25,26 . Esistono molti metodi per la coltura tridimensionale delle cellule tumorali, che presentano vantaggi e svantaggi27,28,29. La coltura organoide non è destinata a sostituire la tradizionale coltura aderente o a sfera. È meglio utilizzato come tecnica complementare ai metodi bidimensionali quando ci sono domande specifiche in cui l'interazione tra microambiente cellulare e risposte delle cellule tumorali è critica.
Questo articolo descrive metodi affidabili e ripetibili per generare organoidi GBM da campioni primari di pazienti o colture derivate dal paziente. Affrontiamo due diversi obiettivi per la coltura tridimensionale di organoidi: (1) stabilire organoidi dal tessuto primario del paziente, con il massimo potenziale di attecchimento indipendentemente dall'uniformità, o (2) coltivare organoidi uniformi per un uso sperimentale più quantitativo. Quando si stabilisce un campione primario come organoidi, non è necessario filtrare per singole cellule o contare le cellule, perché mantenere il numero massimo di cellule e tipi per stabilire la coltura iniziale è una priorità. Quando si coltivano organoidi per esperimenti comparativi, tuttavia, sono necessari la filtrazione a singola cellula e il conteggio delle cellule per garantire che gli organoidi replicati siano comparabili per coerenza sperimentale. Questo protocollo descrive in dettaglio come stabilire colture di organoidi e creare organoidi uniformi, nonché metodi raffinati per incorporare e preservare organoidi ed esperimenti di coltura cellulare standard, tra cui immunoistochimica, immunofluorescenza e valutazione della vitalità cellulare totale negli organoidi GBM.

<table><tbody><tr><td>Compresse di 3,3-diaminobenzidina (DAB)</td><td>MP Biomedicals 08980681</td><td></td><td>Compresse di 3,3-diaminobenzidina (DAB)</td></tr><tr><td>Piastre PCR a 96 pozzetti</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>Piastre PCR a 96 pozzetti</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>SCR005</td><td>Soluzione di distacco cellulare</td></tr><tr><td>Antibiotico-antimicotico</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15240062</td><td>Integratore di antibiotico-antimicotico</td></tr><tr><td>B-27 meno vitamina A</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12587001</td><td>integratore di B-27 meno vitamina A (50x)</td></tr><tr><td>GelCode Blue Stain Reagent</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>24590</td><td>Reagente azzurrante</td></tr><tr><td>Filtro cellulare (70 &; m)</td><td>CellTreat Scientific</td><td>229483</td><td>Filtro cellulare (70 &; micro; m)</td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 3D</td><td>Promega</td><td>G9681</td><td>Saggio di vitalità cellulare luminescente</td></tr><tr><td>Chiarificatore 2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>7301</td><td>Reagente chiarificante nucleare ematossilina</td></tr><tr><td>Clear-Rite 3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>6901</td><td>sostituto dello xilene</td></tr><tr><td>Epredia Gill 2 Ematossilina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>72504</td><td>Ematossilina</td></tr><tr><td>Glutammina in 0,85% NaCl</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Glutammina in 0,85% NaCl (200 mM)</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>354234</td><td>Matrice extracellulare arricchita con laminina</td></tr><tr><td>Mini PAP pen</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>008877</td><td>Penna barriera idrofobica</td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22-050-102</td><td>Mezzo di montaggio</td></tr><tr><td>Neurobasal terreni meno rosso fenolo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12349015</td><td>Terreni neurobasali meno rosso fenolo (500 mL)</td></tr><tr><td>Siero d'asino normale (NDS)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td>Siero d'asino normale (NDS)</td></tr><tr><td>Paraformaldeide 4% in PBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AAJ19943K2</td><td>Paraformaldeide 4% in PBS</td></tr><tr><td>Rosso fenolo</td><td>Sigma</td><td>P0290</td><td>Rosso fenolo (0,5%)</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant con DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P10144</td><td>Mountant a polimerizzazione liquida</td></tr><tr><td>Proteina EGF umana ricombinante</td><td>R& Sistemi D</td><td>236-EG-01M</td><td>Proteina EGF umana ricombinante (250 &micro; g/mL)</td></tr><tr><td>R& R& basico di FGF umano ricombinante</td><td> D systems</td><td>4144-TC-01</td><td>FGF umano ricombinante di base (250 &micro; g/mL)</td></tr><tr><td>SignalStain Antibody Diluente</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>8112</td><td>Diluente anticorpale</td></tr><tr><td>SignalStain Boost Reagente di rilevamento IHC</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>8114</td><td>Reagente per la rilevazione di immunoistochimica</td></tr><tr><td>SignalStain Citrate Unmasking Solution</td><td>Cell Signaling</td><td>14746</td><td>Soluzione di smascheramento del citrato</td></tr><tr><td>Lama di rasoio a lama singola</td><td>Uline</td><td>H-595B</td><td>Single edge lama di rasoio</td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360070</td><td>Piruvato di sodio (100 mM)</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomolds</td><td>VWR</td><td>25608-916</td><td>Criostampi monouso</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td>Composto per la temperatura di taglio ottimale</td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T10282</td><td>Macchia di cellule immensa (0,4%)</td></tr><tr><td>Xilene</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>X3P-1GAL</td><td>Xilene</td></tr></tbody></table>

mantenimento della diversità cellulare del glioblastoma umano ex vivo utilizzando la coltura di organoidi tridimensionali

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Il glioblastoma (GBM) è il tumore cerebrale maligno primario più comune con una prognosi estremamente sfavorevole. La diversità cellulare e molecolare intratumorale, così come le complesse interazioni tra microambienti tumorali, possono rendere difficile trovare trattamenti efficaci. I metodi tradizionali di coltura aderente o a sfera possono mascherare tali complessità, mentre la coltura organoide tridimensionale può ricapitolare i gradienti microambientali regionali. Gli organoidi sono un metodo di coltura tridimensionale GBM che imita meglio l'architettura tumorale del paziente, contiene popolazioni cellulari fenotipicamente diverse e può essere utilizzato per esperimenti a medio rendimento. Sebbene la coltura organoide tridimensionale sia più laboriosa e dispendiosa in termini di tempo rispetto alla cultura tradizionale, offre vantaggi unici e può servire a colmare il divario tra gli attuali sistemi in vitro e in vivo . Gli organoidi si sono affermati come strumenti inestimabili nell'arsenale dei biologi del cancro per comprendere meglio il comportamento del tumore e i meccanismi di resistenza, e le loro applicazioni continuano a crescere. Qui vengono forniti dettagli sui metodi per generare e mantenere gli organoidi GBM. Sono inoltre descritte le istruzioni su come eseguire l'incorporazione e il sezionamento di campioni organoidi utilizzando tecniche sia congelate che di incorporamento di paraffina, nonché raccomandazioni per protocolli di immunoistochimica e immunofluorescenza su sezioni organoidi e misurazione della vitalità totale delle cellule organoidi.

La Figura 1 mostra la crescita precoce degli organoidi osservata al microscopio ottico con un ingrandimento 10x. La Figura 1A mostra la migrazione e l'invasione di singole celle attraverso lrECM nella vista centrale. Le cellule continueranno ad espandersi e "colonizzare" la lrECM, e appariranno più dense e infine opache dall'ispezione visiva. La figura 1B mostra diversi organoidi maturi (a 7 settimane) senza ingrandimento, rispetto alle dimensioni di un centesimo.
La Figura 2 mostra la colorazione immunoistochimica degli organoidi GBM per il fosfo-istone H3, un marker di proliferazione attiva. La maggior parte delle cellule altamente proliferative sono viste nel perimetro organoide rispetto al nucleo organoide. La colorazione positiva avrà un aspetto marrone / rame.
La Figura 3 descrive il processo per omogeneizzare e misurare il numero totale di cellule negli organoidi GBM utilizzando un saggio di vitalità cellulare luminescente specifico per 3D. A causa dell'elevato numero di cellule presenti negli organoidi GBM, la struttura organoide più grande viene inizialmente omogeneizzata mediante triturazione in reagente di saggio luminescente. Quindi le frazioni del lisato organoide totale vengono caricate in singoli pozzetti e diluite con un ulteriore reagente di analisi luminescente prima dell'incubazione e della lettura su un appropriato lettore di piastre multi-pozzetto.
La figura 4 rappresenta i dati di controllo DMSO (veicolo comune) per gli organoidi. I dati tracciati dimostrano la consistenza intra-organoide e inter-organoide. I dati di vitalità luminescenti saranno tipicamente normalizzati ai controlli per ciascun campione durante la generazione di dati sperimentali.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig01.jpg"> Figura 1: Vista al microscopio ottico (10x). (A) Crescita precoce degli organoidi che dimostra la migrazione/invasione delle cellule GBM in tutta la matrice extracellulare ricca di laminina. (B) organoidi maturi rispetto alle dimensioni di una monetina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig02.jpg"> Figura 2: Immunoistochimica degli organoidi GBM. (A, B) Organoidi GBM che mostrano cellule colorate con fosfo-istone H3 per la proliferazione attiva. Le barre di scala sono 600 μm e 300 μm per A e B, rispettivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig03.jpg"> Figura 3: Protocollo di vitalità cellulare luminescente per organoidi . (A) Spostare i singoli organoidi in piccole provette da centrifuga ed eliminare i mezzi in eccesso. (B) Aggiungere 500 μL di PBS 1:1 e miscela di dosaggio di vitalità cellulare luminescente a ciascuna provetta e pipetta in modo aggressivo per abbattere l'organoide. (C) Aggiungere 25 μL di questa miscela organoide e 75 μL della stessa miscela 1:1 PBS e dosaggio luminescente di vitalità cellulare a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. (D) Posizionare su uno shaker per 2 minuti, seguito da incubazione per 20 minuti a RT, quindi leggere la luminescenza su un lettore di piastre. Figura realizzata utilizzando BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig04.jpg"> Figura 4: Vitalità cellulare. Dati di vitalità cellulare per organoidi in 0,1% dimetil solfossido (DMSO) per sei repliche tecniche di quattro organoidi per quattro campioni di pazienti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Componente</td>
			<td>Quantità</td>
		</tr><tr><td>Mezzo neurobasale meno rosso fenolo</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr><tr><td>Supplemento di B-27 meno vitamina A (50x)</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr><tr><td>Antibiotico-antimicotico (100x)</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr><tr><td>Piruvato di sodio (100 mM)</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr><tr><td>Glutammina in 0,85% NaCl (200 mM)</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr><tr><td>FGF umano ricombinante basico (250 μg/ml)</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr><tr><td>Proteina EFG umana ricombinante (250 μg/mL)</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr><tr><td>Rosso fenolo</td>
			<td>500 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Formulazione completa del mezzo neurobasale (NBMc)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reagente</td>
			<td>Ore</td>
		</tr><tr><td>50% etanolo</td>
			<td>3 minuti</td>
		</tr><tr><td>75% Etanolo</td>
			<td>3 minuti</td>
		</tr><tr><td>95% etanolo</td>
			<td>3 minuti</td>
		</tr><tr><td>95% etanolo</td>
			<td>4 minuti</td>
		</tr><tr><td>100% etanolo</td>
			<td>2 minuti</td>
		</tr><tr><td>100% etanolo</td>
			<td>3 minuti</td>
		</tr><tr><td>100% etanolo</td>
			<td>4 minuti</td>
		</tr><tr><td>Sostituto dello xilene</td>
			<td>2 minuti</td>
		</tr><tr><td>Sostituto dello xilene</td>
			<td>3 minuti</td>
		</tr><tr><td>Sostituto dello xilene</td>
			<td>4 minuti</td>
		</tr><tr><td>Paraffina</td>
			<td>15 minuti</td>
		</tr><tr><td>Paraffina</td>
			<td>15 minuti</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 2: Programma di lavorazione per piccoli organoidi (diametro inferiore a 3 mm)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reagente</td>
			<td>Ore</td>
		</tr><tr><td>50% etanolo</td>
			<td>6 minuti</td>
		</tr><tr><td>75% Etanolo</td>
			<td>6 minuti</td>
		</tr><tr><td>95% etanolo</td>
			<td>5 minuti</td>
		</tr><tr><td>95% etanolo</td>
			<td>8 minuti</td>
		</tr><tr><td>100% etanolo</td>
			<td>5 minuti</td>
		</tr><tr><td>100% etanolo</td>
			<td>5 minuti</td>
		</tr><tr><td>100% etanolo</td>
			<td>8 minuti</td>
		</tr><tr><td>Sostituto dello xilene</td>
			<td>5 minuti</td>
		</tr><tr><td>Sostituto dello xilene</td>
			<td>5 minuti</td>
		</tr><tr><td>Sostituto dello xilene</td>
			<td>8 minuti</td>
		</tr><tr><td>Paraffina</td>
			<td>30 minuti</td>
		</tr><tr><td>Paraffina</td>
			<td>30 minuti</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 3: Programma di lavorazione per organoidi di grandi dimensioni (diametro superiore a 3 mm)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reagente</td>
			<td>Ore</td>
		</tr><tr><td>Ematossilina</td>
			<td>2 minuti</td>
		</tr><tr><td>Running diH2O</td>
			<td>2 minuti</td>
		</tr><tr><td>Reagente chiarificante dell'ematossilina nucleare</td>
			<td>1 min</td>
		</tr><tr><td>Running diH2O</td>
			<td>1 min</td>
		</tr><tr><td>Reagente Bluing</td>
			<td>1 min</td>
		</tr><tr><td>Running diH2O</td>
			<td>2 minuti</td>
		</tr><tr><td>70% etanolo</td>
			<td>1 min</td>
		</tr><tr><td>100% etanolo</td>
			<td>1 min</td>
		</tr><tr><td>100% etanolo</td>
			<td>1 min</td>
		</tr><tr><td>Sostituto dello xilene</td>
			<td>2 minuti</td>
		</tr><tr><td>Sostituto dello xilene</td>
			<td>2 minuti</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 4: Controcolorazione dell'ematossilina

Qui, descriviamo un metodo per generare organoidi di glioblastoma (GBM) da campioni di pazienti primari o colture cellulari derivate dal paziente e mantenerli fino alla maturità. Questi organoidi GBM contengono popolazioni cellulari fenotipicamente diverse e ricreano microambienti tumorali ex vivo.

Mantenimento della diversità cellulare del glioblastoma umano ex vivo utilizzando la coltura di organoidi tridimensionali

Glioblastoma (GBM) is the most commonly occurring primary malignant brain cancer with an extremely poor prognosis. Intra-tumoral cellular and molecular ...

Trovare trattamenti per il glioblastoma è difficile a causa della diversità cellulare che esiste nei tumori e delle interazioni tra diversi microambienti. Gli organoidi possono aiutare a ricreare parte di quella diversità spaziale e possiamo usarla per comprendere meglio la biologia dei tumori. Mentre i metodi tradizionali di coltura cellulare tendono a produrre popolazioni omogenee di cellule tumorali, gli organoidi possono imitare meglio la diversità molecolare e cellulare del glioblastoma e modellare meglio le interazioni intratumorali.Gli organoidi possono essere utilizzati per studiare l'efficacia dei farmaci e i meccanismi di resistenza. La resistenza alle terapie cliniche può apparire solo negli organoidi e non nella cultura della sfera tradizionale, riflettendo la realtà clinica di questa malattia. Gli organoidi possono aiutare a dimostrare gli effetti regionali delle chemioterapie.Possono essere utilizzati per scoprire nuove terapie specifiche di nicchia e possono anche fungere da strumento predittivo per la medicina personalizzata in futuro. Alcuni materiali utilizzati per creare organoidi sono sensibili alla temperatura e trascurare di mantenere questi materiali alla loro giusta temperatura può portare a difficoltà nella creazione o nella manutenzione degli organoidi. Inizia a preparare gli stampi organoidi sotto un cappuccio di coltura togliendo la carta cerata dal foglio di parafilm e posizionandola tra due sterili 96 pozzetti di reazione a catena della polimerasi o piastre PCR.Assicurarsi che l'interno del parafilm sia pulito. Applicare una pressione uniforme sulla piastra superiore per formare piccole fossette profonde due millimetri nel parafilm senza creare fori. Separare i piatti.Il parafilm a fossette si attaccherà alla piastra superiore. Quindi posizionare la piastra superiore su ghiaccio secco per 30 secondi. Utilizzare una pinza sterile per estrarre il parafilm dalla piastra superiore con un movimento rapido.Il parafilm congelato è più facile da rimuovere. Posizionare lo stampo per parafilm completato in un piatto di coltura cellulare sterile coperto e sterile da 10 centimetri. Per preparare la sospensione unicellulare da glioblastoma o coltura aderente GBM, rimuovere il mezzo utilizzato dalla piastra.Quindi aggiungere due millilitri di soluzione di distacco cellulare a temperatura ambiente alla piastra e incubare la piastra a 37 gradi per tre minuti. Dopo aver confermato il distacco cellulare dalla piastra al microscopio, aggiungere otto millilitri di mezzo neurobasale completo, o mezzo NBMc, per neutralizzare la soluzione di distacco cellulare. Filtrare la sospensione attraverso un singolo filtro a celle da 70 micron.Ruotare le celle a 120 volte G per cinque minuti. Quindi rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in un millilitro di NBMc. Contare le cellule dalla sospensione a cella singola usando una macchia imper-media cellulare.Per produrre organoidi da una sospensione unicellulare, aggiungere una quantità appropriata di matrice extracellulare ricca di laminina, o lrECM, in un piccolo tubo di centrifuga in un secchiello del ghiaccio o in un blocco freddo. Preparare una miscela cellulare contenente 20.000 cellule per organoide. Mescolare accuratamente la miscela di sospensione cellulare lrECM per evitare di depositare le cellule, che si tradurrebbe in una formazione organoide non uniforme.Quindi, pipettare accuratamente 20 microlitri della miscela su uno stampo parafilm per formare una goccia simile a una perla. Assicurarsi di raffreddare la punta della pipetta ogni due o tre organoidi per evitare la polimerizzazione di lrECM. Una volta che il numero desiderato di organoidi viene pipettato sullo stampo del parafilm in una piastra di coltura di 10 centimetri, incubare gli organoidi a 37 gradi Celsius per una o due ore in un incubatore di coltura cellulare.Dopo che gli organoidi sono solidificati, lavare delicatamente gli organoidi dallo stampo del parafilm con il mezzo NBMc usando una punta P1000 e raccoglierli in una nuova piastra di coltura da 10 centimetri contenente 20 millilitri di NBMc. Posizionare la piastra di coltura in un'incubatrice senza agitare per quattro giorni. Dopo quattro giorni, sostituire il supporto nella piastra.Per fare questo, posizionare un pezzo di carta scura sotto la piastra di coltura cellulare. Inclinare la piastra e attendere 20 secondi. Mentre gli organoidi si depositano completamente sul fondo del piatto, rimuovere lentamente il supporto con una pipetta di vetro ad apertura grande.Dopo aver aggiunto nuovi supporti, posizionare la piastra nell'incubatore su uno shaker orbitale a 80 RPM e successivamente scambiare il fluido ogni due o tre giorni. La crescita dell'organoide è stata osservata utilizzando la microscopia ottica. Nella vista centrale, la crescita precoce degli organoidi ha mostrato migrazione e invasione di singole cellule attraverso lrECM.Gli organoidi maturi a sette settimane erano relativi alle dimensioni di un centesimo. La colorazione immunoistochimica degli organoidi GBM con fosfo-istone H3 ha rivelato cellule altamente proliferative con un aspetto marrone o viola nel perimetro organoide rispetto al nucleo. I dati di vitalità cellulare per organoidi nello 0,1% di DMSO hanno dimostrato la consistenza intraorganoide e interorganoide.Prestare attenzione alla biomassa organoide e all'acidificazione dei mezzi. Se gli organoidi attraversano i terreni troppo rapidamente, assicurarsi di scambiare i terreni più frequentemente o dividere gli organoidi tra piastre aggiuntive. Gli organoidi maturi possono essere utilizzati per esperimenti con terapie o incorporati e sezionati per l'uso con immunoistochimica o immunofluorescenza.Gli organoidi dissociati possono essere utilizzati per l'analisi FACS. Questi organoidi sono stati recentemente utilizzati nello screening funzionale tridimensionale per scoprire bersagli essenziali in nicchie spazialmente distinte di cellule staminali tumorali. Stiamo anche usando questi modelli per dare priorità a diversi farmaci e terapie prima dei test in vivo.

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