Name: Effetto dellacido ialuronico 35 kDa su un modello in vitro di danno intestinale pretermine e guarigione mediante monostrati di derivazione enteroide (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Scopri il metodo di scratch assay su monostrati derivati da enteroidi per studiare la rigenerazione intestinale pretermine. Questa tecnica consente la visualizzazione in tempo reale della chiusura delle ferite.

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Questo contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health. HC è supportato dalla sovvenzione P20GM134973 del National Institutes of Health. KB è supportato da una sovvenzione della Children's Hospital Foundation (CHF) e della Presbyterian Health Foundation (PHF). I servizi di imaging delle cellule vive forniti dal nucleo di genomica funzionale del cancro sono stati supportati in parte dal National Institute of General Medical Sciences Grant P20GM103639 e dal National Cancer Institute Grant P30CA225520 del National Institutes of Health, assegnato al Centro di scienze della salute dell'Università dell'Oklahoma Stephenson Cancer Center.

Tutte le procedure animali in questo studio sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del Centro di scienze della salute dell'Università dell'Oklahoma. A seguito dell'approvazione istituzionale, campioni fetali di convenienza dell'intestino tenue da un primate non umano pretermine (NHP, gestazione al 90%, babbuino olivastro, Papio anubis) sono stati ottenuti dopo l'eutanasia per uno studio separato (Protocollo # 101523-16-039-I) 20.
1. Istituzione di enteroidi intestinali 3D di primati pretermine non umani
<ol><li>Preparazione dei supporti NOTA: I supporti possono essere preparati fino a 1 settimana prima dell'isolamento della cripta seguendo la tecnica asettica standard. Penicillina/streptomicina (concentrazione finale 1%) può essere utilizzata al posto degli antibiotici ad ampio spettro per le cellule primarie, se lo si desidera.<ol><li>Preparare il terreno di crescita organoide umano + Y-27632 (HOGMY) mescolando 50 ml di terreno di crescita organoide terreno basale umano con 50 ml di integratore organoide (Tabella dei materiali). Aggiungere 200 μL di antibiotici ad ampio spettro (concentrazione finale 100 μg/ml) (tabella dei materiali) e Y-27632 (ad una concentrazione finale di 10 μM). Riscaldare sul banco a temperatura ambiente.</li>
		<li>Preparare il terreno di crescita organoide umano (HOGM) mescolando 50 ml di terreno di crescita organoide terreno basale umano con 50 ml di integratore organoide. Aggiungere 200 μL di antibiotici ad ampio spettro (100 μg/ml). Riscaldare sul banco a temperatura ambiente. NOTA: HOGM verrà utilizzato quando si cambia supporto oltre i primi 2-3 giorni dopo il passaggio.</li>
		<li>Raffreddare 100 ml di 1x soluzione salina tamponata fosfato (PBS) senza calcio o magnesio fino a quando non è ghiacciata.</li>
		<li>Preparare 50 ml di tampone di lavaggio combinando 1x PBS senza calcio o magnesio con lo 0,1% di albumina sierica bovina (BSA). Raffreddare fino a quando non è ghiacciato.</li>
		<li>Preparare il tampone di lavaggio DMEM-F12 aggiungendo 1 mL di antibiotici ad ampio spettro (100 μg/mL) a 500 mL di DMEM/F12 (Mezzo d'aquila modificato/miscela di prosciutto nutriente F12 + 15 mM tampone HEPES). Tienilo ghiacciato.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolamento e placcatura della cripta NOTA: L'idrogel a base di matrice extracellulare (ECM) deve rimanere sul ghiaccio durante l'intera procedura. Questa procedura presuppone abbastanza tessuto per popolare sei cupole di idrogel a base di ECM. Se viene raccolta una diversa densità di cripte, il numero della cupola deve essere modificato di conseguenza.<ol><li>Scongelare 150 μL di estratto di membrana basale (BME) ridotto dal fattore di crescita (GFR) (privo di rosso fenolo) durante la notte sul ghiaccio a 2-8 °C.</li>
		<li>Incubare una piastra di polistirene trattata con coltura tissutale a 24 pozzetti, a fondo piatto, in un'incubatrice a 37 °C e al 5% di CO2 per almeno 30 minuti prima dell'uso.</li>
		<li>Dopo l'eutanasia NHP e la raccolta di tessuti, lavare il segmento di ileo dei detriti con una punta di pipetta da 1.000 μL utilizzando 1x PBS ghiacciato in una capsula di Petri usa e getta. NOTA: Il tessuto fresco deve essere raccolto rapidamente e mantenuto ghiacciato per raccogliere enteroidi sani.</li>
		<li>Tagliare l'ileo longitudinalmente lungo tutto l'intestino e lavare con PBS 3x ghiacciato. Tritare il tessuto in piccoli frammenti (circa 2 mm di lunghezza) con forbici sterili su un tubo conico da 50 mL contenente 15 mL di PBS ghiacciato, a partire dalla porzione del segmento ileale più vicina al tubo.</li>
		<li>Utilizzare una pipetta sierologica da 10 ml per interrompere le cripte con pipettaggio su e giù 5-10 volte. Lasciare che i segmenti di tessuto si depositino sul fondo del tubo, quindi rimuovere il surnatante e sostituirlo con PBS fresco e ghiacciato. Ripetere questo processo almeno 7x-10x fino a quando il surnatante è libero e privo di detriti.</li>
		<li>Una volta pulito, rimuovere il surnatante e risospendere le cripte in 25 ml di reagente di dissociazione cellulare. Posizionare il tubo su una piattaforma a dondolo a 20 giri / min per 15 minuti a temperatura ambiente.</li>
		<li>Rimuovere il tubo dal bilanciere, lasciare che le cellule si depositino per circa 30 s a 1 minuto e rimuovere il surnatante. Aggiungere 10 ml di tampone di lavaggio ghiacciato. Pipetta su e giù con una pipetta p1000 per dissociare ulteriormente in singole cripte.</li>
		<li>Filtrare il tessuto attraverso un filtro cellulare da 70 μm in un nuovo tubo conico da 50 ml. Risciacquare il tubo conico originale da 50 mL con 10 mL di tampone di lavaggio ghiacciato e filtrare attraverso il filtro da 70 μm per assicurarsi che tutte le cripte siano state rimosse dal tubo originale. Ripetere questo lavaggio del fazzoletto per un totale di 4 risciacqui.</li>
		<li>Centrifugare il filtrato a 300 x g per 5 minuti a 4 °C e rimuovere il surnatante. Aggiungere 600 μL di HOGMY e interrompere il pellet pipettando su e giù con una pipetta da 200 μL. Mettere il tubo sul ghiaccio fino a quando la soluzione diventa ghiacciata. NOTA: Se la soluzione non è ghiacciata, la cupola non manterrà la struttura corretta quando placcata. Evitare di introdurre bolle durante il pipettaggio di cupole di idrogel a base di ECM, poiché le bolle impediranno la corretta aderenza al fondo della piastra.</li>
		<li>Aggiungere 600 μL di idrogel a base di ECM ghiacciato per sospendere il pellet cellulare e mescolare bene con una pipetta da 200 μL.</li>
		<li>Rimuovere la piastra a 24 pozzetti dall'incubatore e posizionarla su uno scalda a piastre a 37 °C. Pipettare 50 μL di miscela di idrogel ghiacciata a base di HOGMY/ECM al centro di 24 pozzetti di una piastra di coltura a 24 pozzetti (50 μL per cupola).</li>
		<li>Una volta placcate, lasciare riposare le cupole su uno scalda a 37 °C per 1 minuto per consentire l'aderenza al fondo della piastra. Capovolgere con cautela la piastra, assicurarsi che non si sia accumulata condensa sul fondo della piastra e posizionare la piastra invertita nell'incubatore a 37 °C e al 5% di CO2.</li>
		<li>Dopo 15 minuti, ruotare la piastra con il lato destro verso l'alto e pipettare 750 μL di HOGMY a temperatura ambiente in ciascun pozzetto. NOTA: Pipettare lentamente i supporti sulla parete laterale dei pozzetti, facendo attenzione a non interrompere la cupola di idrogel 3D a base di ECM appena formata.</li>
		<li>Una volta che tutti i pozzetti sono stati riempiti con il media, posizionare la piastra nell'incubatore e cambiare il mezzo ogni 3 giorni con 750 μL di HOGM. Passaggio enteroidi ogni 7-10 giorni.</li>
	</ol></li>
	<li>Passaggio enteroide intestinale NOTA: il seguente protocollo è per una piastra di coltura a 24 pozzetti contenente enteroidi NHP a una velocità di divisione di 1:2.<ol><li>Rimuovere il mezzo enteroide da ciascun pozzetto, facendo attenzione a non interrompere la cupola ECM contenente enteroidi, aggiungere 500 μL di reagente di dissociazione cellulare ghiacciato a ciascun pozzetto utilizzando una pipetta da 1.000 μL e incubare a temperatura ambiente per 1 minuto.</li>
		<li>Interrompere manualmente l'ECM mediante pipettaggio su e giù 8-12x. Trasferire il contenuto di 12 pozzetti in un tubo conico da 15 ml.</li>
		<li>Una volta che tutta la soluzione è stata raccolta dalla piastra di coltura a 24 pozzetti, aggiungere 250 μL di reagente di rottura cellulare a ciascun pozzetto per assicurarsi che tutti gli enteroidi NHP siano stati rimossi da ciascun pozzetto, aggiungendo quest'ultimo risciacquo ai tubi conici da 15 ml esistenti.</li>
		<li>Posizionare su una piattaforma a dondolo a 40 giri/min per 15 minuti a temperatura ambiente (20 °C). In alternativa, agitare manualmente i tubi per 15 minuti a temperatura ambiente.</li>
		<li>Dopo 15 min, centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante dai tubi da 15 mL fino a quando rimane solo il pellet.</li>
		<li>Aggiungere 8 ml di DMEM + antibiotici ad ampio spettro ghiacciati in un tubo conico da 15 ml, assicurandosi che il pellet sia sufficientemente distrutto. Centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.</li>
		<li>Aggiungere 600 μL di HOGMY e interrompere il pellet pipettando su e giù con una pipetta da 1.000 μL. Mettere il tubo sul ghiaccio fino a quando la soluzione diventa ghiacciata. Una volta che la soluzione è ghiacciata, aggiungere 600 μL di ECM ghiacciato per sospendere il pellet cellulare e mescolare bene con una pipetta da 1.000 μL. Ripetere i passaggi 1.3.2.-1.3.7. per i restanti 12 pozzi.<ol><li>Per i passaggi rimanenti, fare riferimento ai passaggi 1.2.11.-1.2.16.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Istituzione del monostrato enteroide e del saggio della ferita da graffio
<ol><li>Preparazione dei media e del trattamento<ol><li>Raffreddare 5 ml di PBS senza calcio o magnesio fino a quando non si raffredda il ghiaccio.</li>
		<li>Preparare il tampone di lavaggio DMEM-F12 aggiungendo 1 mL di antibiotici ad ampio spettro (100 μg/mL) a 500 mL di DMEM/F12 (Mezzo d'aquila modificato/miscela di prosciutto nutriente F12 + 15 mM tampone HEPES). Mantieni il ghiaccio freddo.</li>
		<li>Preparare 100 mL di HOGMY, come descritto al punto 1.1.1., e riscaldarlo sul piano di lavoro a temperatura ambiente.</li>
		<li>Riscaldare 25 mL di acido tripsina-etilendiamminotetraacetico allo 0,25% (EDTA) a bagnomaria a 37 °C.</li>
		<li>Preparare concentrazioni di 50 μg/mL, 100 μg/mL e 200 μg/mL di HA35 per il trattamento cellulare, utilizzando PBS sterile senza calcio o magnesio come solvente. La diluizione finale di HA35 utilizzerà HOMGY come solvente. NOTA: La preparazione di HA35 può richiedere diverse diluizioni, poiché HA35 spesso esce dalla soluzione ad una concentrazione superiore a 5 mg/ml.</li>
	</ol></li>
	<li>Formazione di monostrato enteroide NOTA: la seguente procedura fornisce volumi sufficienti per la generazione di una piastra a 24 pozzetti di monostrati enteroidi. Regolare i volumi per il numero desiderato di monostrati.<ol><li>Scongelare 96 μL di idrogel BME a base di ECM (privo di rosso fenolo) durante la notte su ghiaccio a 2-8 °C. Diluire l'idrogel a base di ECM in PBS ghiacciato senza calcio o magnesio in un rapporto di 1:50. Rivestire ogni pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti con 200 μL di idrogel diluito a base di ECM ghiacciato.</li>
		<li>Incubare la piastra rivestita di idrogel a base ECM per un minimo di 1 ora a 37 °C e 5% di CO2. Aspirare il mezzo dalla piastra di coltura a 24 pozzetti contenente gli enteroidi 3D destinati ai monostrati e sostituirli con 500 μL di reagente/pozzetto di dissociazione cellulare.</li>
		<li>Interrompere manualmente le cupole di idrogel basate su ECM mediante pipettaggio su e giù 8x-12x e trasferire il contenuto di 12 pozzetti in un tubo conico da 15 ml.</li>
		<li>Lavare i 12 pozzetti vuoti con 250 μL di reagente di dissociazione cellulare per assicurarsi che tutti gli enteroidi siano stati rimossi e trasferire il contenuto in un tubo conico da 15 ml. Ripetere il passaggio 2.2.5. e il punto 2.2.6. per i restanti 12 pozzetti utilizzando un secondo tubo conico da 15 ml.</li>
		<li>Centrifugare i tubi conici a 300 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante. Aggiungere 10 ml di tampone di lavaggio DMEM-F12 ghiacciato a tubi conici da 15 ml e sospendere i pellet enteroidi invertendo i tubi. Centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C.</li>
		<li>Rimuovere il surnatante e risospendere i pellet cellulari in 12 mL di tripsina-EDTA a 37 °C. Mettere i tubi a bagnomaria a 37 °C per 10 minuti o fino a quando le cellule appaiono solubili. Aggiungere 3 mL di tampone di lavaggio DMEM-F12 a ciascun tubo per diluire Trypsin-EDTA, mescolare capovolgendo i tubi e posizionare su ghiaccio.</li>
		<li>Filtrare gli enteroidi dissociati attraverso un filtro a cellule a maglie da 37 μM, raccogliendo il contenuto in tubi conici puliti da 15 ml. Centrifugare i tubi a 300 x g per 5 minuti a 4 °C.</li>
		<li>Mentre le celle sono pellettizzate nella centrifuga, rimuovere la piastra rivestita di idrogel a base di ECM dall'incubatore e aspirare qualsiasi soluzione di idrogel a base di ECM in eccesso senza graffiare la superficie rivestita o lasciare asciugare completamente la piastra.</li>
		<li>Rimuovere il surnatante dai tubi conici e risospendere i pellet cellulari con 6 mL di HOMGY. Aggiungere 500 μL della sospensione combinata di 12 mL di cellule HOMGY in ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti rivestita con idrogel a base di ECM ad una densità di semina di circa 3 x 105 celle/pozzetto. Ruotare la piastra con un coperchio per garantire una distribuzione uniforme delle celle all'interno dei pozzetti.</li>
		<li>Incubare la piastra a 37 °C e 5% di CO 2, scambiando i fluidi HOMGY ogni 2 giorni fino a quando i monostrati raggiungono il &gt;90% di confluenza.</li>
	</ol></li>
	<li>Trattamento monostrato e saggio della ferita da graffio<ol><li>Una volta che i monostrati raggiungono il &gt;90% di confluenza, aspirare il mezzo per rimuovere eventuali cellule che non riescono ad attaccarsi. Trattare cellule con 500 μL di HA35 (50 μg/mL, 100 μg/mL, 200 μg/mL) o PBS, disciolte in HOMGY, per 24 ore.</li>
		<li>Dopo 24 ore, rimuovere il supporto, facendo attenzione a non interrompere la superficie del monostrato. Utilizzando una punta per pipetta da 200 μL, effettuare un graffio lineare su tutto il diametro superficiale del monostrato in ciascun pozzetto, facendo attenzione a non lasciare asciugare i monostrati.</li>
		<li>Lavare i monostrati graffiati 1x con 500 μL di 1x PBS. Aggiungere 500 μL di HA35 (50 μg/mL, 100 μg/mL, 200 μg/mL) o PBS disciolto in HOMGY e trasferire la piastra allo strumento di analisi delle cellule vive (Table of Materials) all'interno di un incubatore a 37 °C e al 5% di CO2 .</li>
		<li>Sotto l'icona Schedule nel software di analisi delle celle vive (Table of Materials), fare clic sull'icona Launch Add New Vessel Wizard e impostare la frequenza di scansione per la scansione in base a una pianificazione. Creare un nuovo contenitore Whole Well in Tipo di scansione, specificare le impostazioni di scansione (ad esempio, Fase per i canali immagine e 4x per l'obiettivo) e fare clic su Avanti.</li>
		<li>Selezionare il produttore della targhetta e il numero di catalogo dall'elenco fornito. Sotto l'icona Pianificazione , scegliere il simbolo più in cui verrà posizionata la piastra all'interno dello strumento di analisi delle cellule vive. Selezionare il pattern di scansione desiderato, quindi creare una mappa delle lastre selezionando "+" nella pagina Layout piastra. Selezionare Differire l'analisi fino a un secondo momento, quindi impostare il programma di scansione per ogni 4 ore per 24 ore e verificare le impostazioni di acquisizione nella pagina Riepilogo della procedura guidata nave . Infine, seleziona Aggiungi alla pianificazione.</li>
		<li>Una volta completato il test 24, sotto l'icona Visualizza, fare doppio clic su Nome nave ed esportare immagini e filmati. Selezionare i pozzi e una serie di immagini da visualizzare ed esportare come JPEG. Analizzare le immagini per la percentuale di guarigione delle ferite utilizzando il plug-in Wound Healing Size per ImageJ21, come da passaggio 2.4. sotto.</li>
	</ol></li>
	<li>Analisi delle ferite da graffio<ol><li>Aprire il software ImageJ. Caricare le immagini del saggio della ferita da graffio (. TIFF o .JPG).</li>
		<li>Selezionare Immagine &gt; Digitare &gt; 8 bit per modificare l'immagine da RGB a 24 bit a 8 bit. Installa il plug-in Wound Healing Size selezionando Plugin &gt; Macro &gt; Installa &gt; plug-in Wound Healing Size.</li>
		<li>Ruota l'immagine in modo che il graffio sia verticale e inizializza il plug-in Wound Healing Size Tool.</li>
		<li>Selezionare i parametri del plugin nella finestra di dialogo per adattarsi al meglio alla ferita antigraffio. Impostate il valore dei parametri per le opzioni di dimensione di guarigione delle ferite come segue: Raggio finestra varianza su 20, Valore soglia su 100 e Percentuale di pixel saturi su 0,001 e scegliete Sì per Imposta scala globale. Finalizzare la selezione facendo clic sul pulsante OK . Verificare se l'area selezionata è l'area della ferita. I parametri di cui sopra possono richiedere la standardizzazione da laboratorio a laboratorio.</li>
		<li>Ripetere i passaggi 2.4.2.-2.4.4. per i punti temporali rimanenti per ogni scratch.</li>
		<li>Calcola la percentuale di guarigione della ferita dell'area del graffio delle cellule in migrazione o proliferanti nell'arco di 24 ore come segue: % guarigione delle ferite = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63758/63758eq01.jpg" style="margin: auto;"> dove T 0 = % Area al tempo 0 h e Tc = % Area a 0 h, 4 h, 12 h o 24 h.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Gunasekaran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan+35+kDa+enhances+epithelial+barrier+function+and+protects+against+the+development+of+murine+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan 35 kDa enhances epithelial barrier function and protects against the development of murine necrotizing enterocolitis.</a> Pediatric Research. 87 (7), 1177-1184 (2020).</li>
<li>Montenegro-Miranda, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+organoid+model+of+damage+and+repair+identifies+HNF4%CE%B1+as+a+critical+regulator+of+intestinal+epithelial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">A novel organoid model of damage and repair identifies HNF4α as a critical regulator of intestinal epithelial regeneration.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (2), 209-223 (2020).</li>
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<li>Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+for+accurate+quantification+of+cell+migration+using+human+small+intestine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering+Communications%22%5BJournal%5D)">An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells.</a> Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).</li>
<li>Roodsant, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+2D+primary+organoid-derived+epithelial+monolayer+model+to+study+host-pathogen+interaction+in+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A human 2D primary organoid-derived epithelial monolayer model to study host-pathogen interaction in the small intestine.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 272(2020).</li>
<li>Singh, A., Poling, H. M., Spence, J. R., Wells, J. M., Helmrath, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+organoids%3A+a+next-generation+tool+for+modeling+human+development%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal organoids: a next-generation tool for modeling human development.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 319 (3), 375-381 (2020).</li>
<li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+enteroids+as+an+ex-vivo+model+of+host-pathogen+interactions+in+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract.</a> Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1124-1134 (2014).</li>
<li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+enteroids+as+a+model+of+upper+small+intestinal+ion+transport+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Human enteroids as a model of upper small intestinal ion transport physiology and pathophysiology.</a> Gastroenterology. 150 (3), 638-649 (2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare e nessun conflitto di interessi.

Il tratto gastrointestinale di un neonato pretermine è sottoposto a continua pressione rigenerativa da ripetute esposizioni a insulti ambientali associati a disbiosi, metaboliti batterici infiammatori e tossine e ipossia intermittente23,24. Sfortunatamente, l'epitelio intestinale del neonato pretermine non è in grado di stabilire rapidamente l'integrità funzionale23, con conseguente disfunzione della barriera, aumento della permeabilità in...

L'enterocolite necrotizzante (NEC) è una delle emergenze gastrointestinali più comuni nei neonati pretermine1. La malattia è caratterizzata da una grave infiammazione intestinale che può rapidamente deteriorarsi in necrosi intestinale, sepsi e potenzialmente morte. Sebbene l'eziologia non sia chiara, l'evidenza suggerisce che la NEC è multifattoriale ed è il risultato di una complessa interazione di alimentazione, colonizzazione batterica anormale e epitelio intestinale immaturo 2,3. I neonati pretermine hanno aumentato la permeabilità intestinale, la colonizzazione batterica anormale e una bassa capacità rigenerativa degli enterociti4,5, aumentando il rischio di disfunzione della barriera intestinale, traslocazione batterica e sviluppo di NEC. Pertanto, identificare strategie o interventi per accelerare la maturazione epiteliale intestinale e promuovere la rigenerazione o la guarigione dell'epitelio intestinale è fondamentale per prevenire questa malattia mortale.
Gli studi hanno dimostrato che il latte umano (HM) è protettivo contro NEC nei neonati pretermine 6,7,8,9,10,11. Studi sia sull'uomo che sugli animali hanno dimostrato che la formula a base bovina aumenta la permeabilità intestinale ed è direttamente tossica per le cellule epiteliali intestinali 2,12. Sebbene non completamente chiarito, l'evidenza suggerisce che gli effetti protettivi dell'HM sono mediati attraverso componenti bioattivi come la lattoferrina, l'immunoglobulina A (IgA) e gli oligosaccaridi HM13. HM è anche ricco di acido ialuronico (HA), un glicosaminoglicano unicamente non solfato con acido D-glucuronico ripetuto e disaccaridi N-acetil-D-glucosamina14,15. È importante sottolineare che abbiamo dimostrato che 35 kDa HA orale (HA35), una imitazione HM HA, attenua la gravità del danno intestinale, previene la traslocazione batterica e diminuisce la mortalità in un modello murino di danno intestinale simile a NEC16,17. 
Qui, gli effetti di HA35 sulla guarigione intestinale e sulla rigenerazione in vitro sono ulteriormente studiati. Attualmente, il test in vitro più utilizzato per le ferite e la riparazione intestinale è un test di ferita da graffio eseguito in monostrati di cellule di cancro del colon-retto (CRC). La rilevanza fisiologica di un tale modello per l'intestino infantile pretermine è limitata, poiché la riparazione delle ferite delle cellule CRC dipende fortemente dalla natura altamente proliferativa delle cellule tumorali piuttosto che dai processi di riparazione guidati dalle cellule staminali18. Per superare questa limitazione, qui viene descritta la creazione di un modello 2D di ferita da graffio enteroide, compresa la procedura di isolamento e mantenimento di enteroidi intestinali piccoli intestinali derivati da cellule staminali primarie da primati non umani pretermine (NHP). Dato che la NEC pretermine è più spesso riportata nell'intestino tenue distale, l'uso di organoidi di cellule epiteliali primarie in un modello di danno intestinale e riparazione fornisce un modello in vitro più fisiologicamente traducibile rispetto ai modelli esistenti che utilizzano monostrati colorettali tradizionali18,19.

<table><tbody><tr><td>Pipetta sierologica da 10 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-675-49</td><td></td></tr><tr><td>100x21mm Piatto, Nunclon Delta</td><td>ThermoFisher Scientific 172931</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tubo conico</td><td>VWR</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>24 pozzetti, trattato TC, piastra a fondo piatto</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>37 &; M Filtro cellulare reversibile</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>27215</td><td></td></tr><tr><td>50 mL tubo conico</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>70 &; m Filtri cellulari sterili</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>Albumina, bovina (BSA)</td><td>VWR</td><td>0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay</td><td>Promega</td><td>G9681</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) con 15 mM di tampone HEPES</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>36254</td><td></td></tr><tr><td>Gentle Cell Reagente di dissociazione</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>100-0485</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr> <tr><td>Incucyte S3 Live-Cell Analysis Instrument</td><td>Sartorius</td><td>4647</td><td></td></tr><tr><td>Incucyte Scratch Wound Analysis Software Module</td><td>Sartorius</td><td>9600-0012</td><td></td></tr><tr><td>IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>06010</td><td>Questo è HOGMY, ma senza l'Y-27632 o antibiotici. Usato anche come base per l'HOGM, ma poi mancano solo gli antibiotici.</td></tr><tr><td>Lipopolisaccaridi da Escherichia coli O111:B4, purificati mediante cromatografia di filtrazione su gel</td><td>Millipore Sigma</td><td>L3012-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Baseline Membrane Matrix, Phenol Red-Free</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treatated, Micropiastra a fondo piatto</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>136101</td><td></td></tr><tr><td>PBS (soluzione salina tamponata con fosfato), 1X [-] calcio, magnesio, pH 7,4</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td>Si tratta di antibiotici ad ampio spettro</td></tr><tr><td>Ialuronato di sodio, grado di ricerca, HA20K</td><td>Lifecore Biomedical</td><td>HA20K-1</td><td></td></tr><tr><td>TC20 Contatore di cellule automatizzato</td><td>Azienda: Bio-Rad</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA 1X, 0,25% tripsina</td><td>Fisher Scientific MT25053CI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tecnologie STEMCELL</td><td>72302</td><td></td></tr></tbody></table>

effetto dell'acido ialuronico 35 kda su un modello in vitro di danno intestinale pretermine e guarigione mediante monostrati di derivazione enteroide

Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers

I saggi in vitro delle ferite da graffio sono comunemente usati per studiare i meccanismi e le caratteristiche della guarigione epiteliale in una varietà di tipi di tessuto. Qui, descriviamo un protocollo per generare un monostrato bidimensionale (2D) da enteroidi primati non umani tridimensionali (3D) derivati da cripte intestinali dell'ileo terminale. Questi monostrati derivati da enteroidi sono stati poi utilizzati in un test in vitro per testare la capacità dell'acido ialuronico 35 kDa (HA35), un imitatore di HA del latte umano, di promuovere la migrazione e la proliferazione cellulare lungo il bordo della ferita epiteliale. Dopo che i monostrati sono cresciuti fino alla confluenza, sono stati graffiati manualmente e trattati con HA35 (50 μg / mL, 100 μg / mL, 200 μg / mL) o controllo (PBS). La migrazione cellulare e la proliferazione nel gap sono state riprese utilizzando un microscopio a luce trasmessa attrezzato per l'imaging di cellule vive. La chiusura della ferita è stata quantificata come percentuale di guarigione delle ferite utilizzando il plug-in Wound Healing Size in ImageJ. L'area del graffio e il tasso di migrazione cellulare e la percentuale di chiusura della ferita sono stati misurati nell'arco di 24 ore. HA35 in vitro accelera la guarigione delle ferite nei piccoli monostrati enteroidi intestinali, probabilmente attraverso una combinazione di proliferazione cellulare sul bordo della ferita e migrazione verso l'area della ferita. Questi metodi possono potenzialmente essere utilizzati come modello per esplorare la rigenerazione intestinale nell'intestino tenue umano pretermine.

Gli effetti dell'HA sulla riparazione dei tessuti e sulla guarigione delle ferite in vari tessuti e organi sono ben documentati; tuttavia, gli effetti specifici dell'HA con un peso molecolare di 35 kDa sulla guarigione e rigenerazione dell'intestino tenue fetale o neonatale sono attualmente sconosciuti. Per testare la capacità di HA35 di promuovere la guarigione delle ferite in un modello dell'intestino tenue fetale o neonatale, abbiamo generato enteroidi intestinali 3D dal tessuto ileale NHP e ulteriormente dissociato q...

Questo protocollo descrive un metodo per stabilire ed eseguire un test di ferita da graffio su monostrati bidimensionali (2D) derivati da enteroidi tridimensionali (3D) isolati da ileo di primati non umani.

Effetto dell'acido ialuronico 35 kDa su un modello in vitro di danno intestinale pretermine e guarigione mediante monostrati di derivazione enteroide

In vitro scratch wound assays are commonly used to investigate the mechanisms and characteristics of epithelial healing in a variety of tissue types. ...

Questo protocollo estende il test molto comune della ferita da graffio utilizzato per gli studi di rigenerazione con monostrati derivati da enteroidi che rappresentano tutti i principali tipi di cellule dell'intestino tenue. Questa tecnica consente la visualizzazione in tempo reale della chiusura della ferita in un modello monostrato enteroide pretermine 2D di rigenerazione intestinale. La nostra tecnica può essere applicata allo studio dell'intestino dei mammiferi pretermine, che è tipicamente scarsamente modellato utilizzando linee cellulari di cancro colorettale trasformate.Inizia scongelando 96 microlitri di matrice extracellulare, o BME idrogel a base di ECM, durante la notte sul ghiaccio da due a otto gradi Celsius. Diluire l'idrogel a base di ECM e il PBS ghiacciato senza calcio o magnesio in un rapporto di uno a 50. Rivestire ogni pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti con 200 microlitri di idrogel diluito a base di ECM ghiacciato e incubare la piastra rivestita per un minimo di un'ora a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.Quindi aspirare il mezzo dalla piastra di coltura a 24 pozzetti contenente gli enteroidi 3D destinati ai monostrati e sostituirlo con 500 microlitri di reagente di dissociazione cellulare per pozzetto. Interrompere manualmente le cupole di idrogel basate su ECM pipettando su e giù da otto a 12 volte e trasferendo il contenuto di 12 pozzetti su un tubo conico da 15 millilitri. Lavare i 12 pozzetti vuoti con 250 microlitri di reagente di dissociazione cellulare per assicurarsi che tutti gli enteroidi siano stati rimossi e trasferire il contenuto in tubi conici da 15 millilitri.Centrifugare i tubi conici a 300g per cinque minuti a quattro gradi Celsius ed eliminare il surnatante. Aggiungere 10 millilitri di tampone di lavaggio DMEM / F-12 ghiacciato ai tubi conici e sospendere i pellet enteroidi invertendo i tubi. Centrifugare a 300g per cinque minuti a quattro gradi Celsius e rimuovere il surnatante.Risospendere i pellet cellulari in 12 millilitri di tripsina-EDTA a 37 gradi Celsius e posizionare i tubi in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 10 minuti o fino a quando le cellule appaiono solubili. Aggiungere tre millilitri di tampone di lavaggio DMEM / F-12 a ciascun tubo per diluire Trypsin-EDTA. Mescolare capovolgendo i tubi e metterli sul ghiaccio.Filtrare gli enteroidi dissociati attraverso un filtro cellulare a maglie di 37 micrometri. Raccogliere il contenuto in tubi conici puliti da 15 millilitri e centrifugare i tubi a 300 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il surnatante dai tubi conici e risospendere i pellet cellulari con sei millilitri di HOMGY.Quindi, rimuovere la piastra rivestita in idrogel a base di ECM dall'incubatore e aspirare qualsiasi soluzione di idrogel a base di ECM in eccesso senza graffiare la superficie rivestita o asciugare completamente la piastra. Aggiungere 500 microlitri della sospensione combinata di celle HOMGY da 12 millilitri in ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti rivestita con idrogel a base di ECM. Ruotare la piastra con il coperchio per garantire una distribuzione uniforme delle celle all'interno dei pozzetti.Incubare la piastra a 37 gradi Celsius e 5% anidride carbonica, scambiando i mezzi HOMGY ogni due giorni fino a quando i monostrati raggiungono una confluenza superiore al 90%. Una volta che i monostrati raggiungono una confluenza superiore al 90%, aspirare il supporto per rimuovere eventuali celle che non riescono ad attaccarsi. Trattare le cellule con 500 microlitri di HA35 o PBS sciolti in HOMGY per 24 ore.Successivamente, rimuovere il supporto senza interrompere la superficie del monostrato. Utilizzando una punta per pipetta da 200 microlitri, effettuare un graffio lineare su tutto il diametro superficiale del monostrato in ciascun pozzetto, facendo attenzione a non lasciare asciugare i monostrati. Lavare i monostrati graffiati una volta con 500 microlitri di 1X PBS e aggiungere 500 microlitri di HA35 o PBS sciolti in HOMGY.Trasferire la piastra allo strumento di analisi delle cellule vive all'interno di un incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Sotto l'icona Schedule nel software di analisi delle celle live, fare clic sull'icona Launch Add New Vessel Wizard. Selezionare Scan on Schedule (Scansione in base alla pianificazione), quindi fare clic su Avanti.Selezionare Nuovo in Crea nave e fare clic su Avanti, quindi selezionare Pozzo intero in Tipo di scansione e fare clic su Avanti. Scegliete Fase per i canali immagine e 4x per l'obiettivo. Selezionare il produttore della targhetta e il numero di catalogo dall'elenco fornito e fare clic su Avanti.Selezionare una posizione vuota del recipiente seguita dal modello di scansione desiderato. Inserisci il nome della targa in Nome, quindi seleziona più per creare un layout di targa. Selezionare piccolo più per creare un nome di trattamento.Immettere il nome breve e quindi OK. Evidenziare i pozzetti a piastre corrispondenti a quel trattamento e colpire il grande plus per designare i pozzi con quel trattamento. Immettere la concentrazione del composto e fare clic su OK. Al termine della piastra, selezionare OK, Avanti (Next). Selezionare Posticipa analisi fino a un secondo momento, quindi Crea nuova pianificazione con scansioni a intervalli di quattro ore.Interrompere la scansione a un giorno, zero ore. Assicurarsi che il riepilogo sia corretto e quindi aggiungere alla pianificazione. Nel software di analisi delle cellule live, selezionare Visualizza nella parte superiore dello schermo.Dal menu Nome nave, passare alla scansione completata di 24 ore e fare doppio clic sul nome dell'imbarcazione. Seleziona l'icona Esporta immagini e filmati a sinistra seguita dall'opzione Come visualizzato. Evidenziare i pozzi di interesse, quindi selezionare i punti temporali di interesse e la serie di immagini visualizzate.Assicurarsi che il tipo di sequenza e le scansioni siano corretti. Selezionare il percorso della cartella di destinazione desiderato. Scegli JPEG dal menu a discesa, quindi Esporta.Apri il software ImageJ e carica l'immagine del saggio della ferita da graffio. Selezionare Immagine, quindi digitare 8 bit per modificare l'immagine da RGB a 24 bit. Selezionare Plugin, Macros, Install, Wound_healing_size plugin per installare il plugin Wound Healing Size.Successivamente, imposta il raggio della finestra di varianza su 20, il valore di soglia su 100, la percentuale di pixel saturi su 0,001. Sì per Imposta scala globale e quindi fare clic su OK. Verificare che l'area delineata sia l'area della ferita e ripetere l'operazione per ulteriori graffi. Infine, calcola la percentuale di guarigione della ferita dell'area del graffio delle cellule in migrazione o proliferazione nell'arco di 24 ore utilizzando l'equazione mostrata sullo schermo.Qui, T0 è l'area al tempo zero ore e TC è l'area a zero ore, quattro ore, 12 ore o 24 ore. La generazione di enteroidi e la procedura di analisi della guarigione delle ferite monostrato derivata da enteroidi sono mostrate in queste immagini. Una coltura di enteroidi intestinali tridimensionali e non umani dei primati viene utilizzata per dissociarsi in monostrati bidimensionali.I monostrati sono stati coltivati a una confluenza superiore al 90% in una piastra a 24 pozzetti e quindi trattati con HA35 o PBS per 24 ore. I monostrati sono stati quindi graffiati con una punta per pipetta P200. Di seguito sono mostrate le immagini rappresentative di HA35 nei trattamenti di controllo di monostrati enteroidi di primati non umani.Le immagini sono state ottenute a zero ore, quattro ore, 12 ore e 24 ore dopo aver eseguito un graffio con una punta di pipetta P200. L'effetto di HA35 sui monostrati andoidi di guarigione delle ferite è mostrato qui. Il cambiamento nella guarigione delle ferite nel tempo nei monostrati enteroidi dipende dalla concentrazione del trattamento HA35.HA35 ha aumentato significativamente la guarigione delle ferite dopo quattro ore e 12 ore a 100 microgrammi per millilitro e 200 microgrammi per millilitro rispetto al controllo, ma i tassi di guarigione convergevano tra i trattamenti di 24 ore. Una delle cose più importanti da ricordare con questa procedura è che i monostrati enteroidi intestinali sono di breve durata. Quindi, una volta che sono al 90% confluidi, gli investigatori dovrebbero cercare di usarli rapidamente.Questa tecnica è diventata il nostro modello di riferimento per la rigenerazione intestinale pretermine in vitro, soprattutto se siamo interessati a lesioni più meccaniche piuttosto che infiammatorie.

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Questo video dimostra lo sviluppo della malattia da enterocolite necrotizzante in un modello enteroide neonatale di derivazione umana indotto dal trattamento con lipopolisaccaridi. Questo modello aiuta a studiare la fisiopatologia intestinale.

Induzione dell'enterocolite necrotizzante in un modello enteroide epiteliale umano

Questo protocollo descrive la misura della permeabilità della barriera epiteliale in tempo reale dopo il trattamento farmacologico in organoids intestinale umana utilizzando la microscopia a fluorescenza e microscopia cellulare di vivere.

Misura in tempo reale di permeabilità della barriera epiteliale in Organoids intestinale umana

Enteroids stanno emergendo come un modello di romanzo nello studio della malattia umana. Il protocollo descrive come simulare un modello enteroid di enterocolite necrotizzante umano mediante trattamento di lipopolisaccaride (LPS) di enteroids generato dal tessuto neonatale. Enteroids raccolti dimostrano cambiamenti infiammatori simili a quelli osservati nella enterocolite necrotizzante umana.

Un nuovo modello Enteroid epiteliali umane di enterocolite necrotizzantesi

Gli organoidi intestinali derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC) offrono interessanti opportunità per modellare le malattie enteriche in vitro. Dimostreremo la differenziazione degli hiPSCs in organoidi intestinali (iHOs), la stimolazione di questi iHOs con citochinesi e la microiniezione di Salmonella typhimurium nel lume Iho, permettendo lo studio di un'invasione epiteliale da parte di questo agente m patogeno.

Utilizzando organoidi intestinali derivati da cellule staminali pluripotenti indotta dall'uomo per studiare e modificare la protezione delle cellule epiteliali contro la Salmonella e altri patogeni

Qui, descriviamo la preparazione di monostrati epiteliali intestinali derivati da organoidi umani per studiare la funzione, la permeabilità e il trasporto della barriera intestinale. Poiché gli organoidi rappresentano la risposta originale del tessuto epiteliale agli stimoli esterni, questi modelli combinano i vantaggi dell'espandibilità delle linee cellulari e la rilevanza e la complessità del tessuto primario.

Monostrato epiteliale derivato da organoidi: un modello in vitro clinicamente rilevante per la funzione di barriera intestinale

Questo protocollo descrive un modello di enterocolite necrotizzante apicale (NEC) in un piatto che utilizza enteroidi intestinali piccoli con polarità invertita, consentendo l'accesso alla superficie apicale. Forniamo un protocollo di colorazione immunofluorescente per rilevare l'interruzione epiteliale correlata al NEC e un metodo per determinare la vitalità degli enteroidi apicali-out sottoposti al protocollo NEC-in-a-dish.

In vitro Modello enteroide apical-out di enterocolite necrotizzante

Questo protocollo descrive in dettaglio la creazione di enteroidi, un modello intestinale tridimensionale, dal tessuto intestinale fetale. L'imaging immunofluorescente dei biomarcatori epiteliali è stato utilizzato per la caratterizzazione del modello. L'esposizione apicale dei lipopolisaccaridi, un'endotossina batterica, utilizzando la tecnica della microiniezione ha indotto la permeabilità epiteliale in modo dose-dipendente misurata dalla fuoriuscita di destrano fluorescente.

Test della permeabilità epiteliale negli enteroidi derivati dal tessuto fetale

Qui descriviamo la costruzione di un sistema modello di linea cellulare intestinale tridimensionale (3D) di base e un protocollo di inclusione della paraffina per la valutazione microscopica ottica di equivalenti intestinali fissi. La colorazione di proteine selezionate consente l'analisi di più parametri visivi da un singolo esperimento per un potenziale utilizzo in studi preclinici di screening farmacologico.

Sistema modello intestinale tridimensionale (3D) di base con una componente immunitaria

Questo protocollo descrive un modello in vitro di enterocolite necrotizzante (NEC), che può essere utilizzato per studi meccanicistici sulla patogenesi della malattia. È dotato di un chip microfluidico seminato con enteroidi intestinali derivati dall'intestino neonatale umano, dalle cellule endoteliali e dal microbioma intestinale di un neonato con NEC grave.

Modello microfluidico di enterocolite necrotizzante che incorpora enteroidi intestinali neonatali umani e un microbioma disbiotico

Questo protocollo mira a valutare peptidi biofunzionali autoassemblanti per l'adesione cellulare, la morfologia degli organoidi e l'espressione genica mediante immunocolorazione. Utilizzeremo una linea cellulare di cancro del colon-retto per fornire un modo economico per ottenere organoidi per test intensivi.

Fabbricazione e caratterizzazione di organoidi di cancro del colon-retto da una linea cellulare SW1222 in una matrice peptidica autoassemblante ultracorta

Questo studio presenta un protocollo per la generazione di monostrati 2D intestinali bovini da organoidi, offrendo un migliore accesso per lo studio delle interazioni ospite-patogeno. Include metodi per valutare l'integrità e la funzionalità della membrana, avanzando modelli in vitro che imitano la fisiologia gastrointestinale del bestiame. Questo approccio promette significativi benefici biomedici e agricoli, tra cui strategie di trattamento avanzate.

Progressi nella tecnologia degli organoidi bovini utilizzando interfacce monostrato per l'intestino tenue e crasso

Scopri il metodo di scratch assay su monostrati derivati da enteroidi per studiare la rigenerazione intestinale pretermine. Questa tecnica consente la visualizzazione in tempo reale della chiusura delle ferite.

Effetto dellacido ialuronico 35 kDa su un modello in vitro di danno intestinale pretermine e guarigione mediante monostrati di derivazione enteroide (Video) | JoVE Journal

Effetto dell'acido ialuronico 35 kDa su un modello in vitro di danno intestinale pretermine e guarigione mediante monostrati di derivazione enteroide

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