Name: Ingegnerizzazione e caratterizzazione di un modello optogenetico della giunzione neuromuscolare umana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Scopri come ingegnerizzare giunzioni neuromuscolari umane 3D in vitro con stimolazione optogenetica e analisi video. Questo metodo permette di quantificare la connettività neuromuscolare e valutare l'impatto di neurotossine e siero di pazienti con miastenia gravis.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Riconosciamo con gratitudine il sostegno finanziario da parte del NIH [numeri di sovvenzione EB025765 e EB027062], DOD [numero di premio W81XWH-18-1-0095] e UCSF Health Innovation via Engineering (HIVE Fellowship). Riconosciamo con gratitudine il nucleo di cellule staminali della Columbia University per il loro aiuto e guida con la riprogrammazione cellulare.

Tutte le linee cellulari per questo lavoro sono state create e utilizzate in conformità con le linee guida istituzionali della Columbia University, NY, USA.
1. Preparazione del bioreattore
<ol><li>Realizzare stampi per bioreattori<ol>
<li>Scaricare un file CAD del bioreattore dal file CAD supplementare o creare un progetto personalizzato.</li>
		<li>Generare un percorso utensile CNC dal modello 3D utilizzando il software CAM.</li>
		<li>Macchina stampi acetali utilizzando una fresatrice CNC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fabbricazione di bioreattori<ol>
<li>Mescolare una base 10:1 alla miscela di agenti polimerizzanti di polidimetilsilossano (PDMS, 77 g di miscela per 4 piattaforme/stampi).</li>
		<li>Posizionare la miscela in una camera a vuoto, chiudere tutte le valvole, accendere il vuoto e degassare la miscela per almeno 30 minuti fino a quando non rimangono bolle d'aria. Versare la miscela in stampi e degassare gli stampi nella camera a vuoto per 1 ora.</li>
		<li>Chiudere gli stampi con la metà superiore dello stampo nell'orientamento corretto. Posizionare un'asta esagonale in acciaio sopra il centro e bloccare su entrambi i lati.</li>
		<li>Riempi la parte superiore con PDMS.</li>
		<li>Polimerizzare gli stampi in forno a 65 °C per almeno 4 ore.</li>
		<li>Rimuovere le piattaforme dagli stampi dopo il raffreddamento a temperatura ambiente.</li>
		<li>Pulire i dispositivi in un bagno ad ultrasuoni utilizzando cicli di 1 ora di sapone per i piatti, 400 ml di isopropanolo al 100% e acqua distillata.</li>
		<li>Asciugare durante la notte a 65 °C.</li>
		<li>Immergere le coperture in vetro in poliolo tensioattivo non ionico all'1% per 30 minuti e assicurarsi che le coperture non si impilano in modo che siano tutte adeguatamente rivestite.</li>
		<li>Risciacquare bene con acqua distillata e asciugare per una notte a 65 °C.</li>
		<li>Utilizzare un detergente al plasma in alto con 6 L / min di ossigeno per 1-2 minuti per trattare i coperchi di vetro e la piattaforma PDMS. Una volta trattati, legare i due insieme premendo il PDMS verso il basso sulla coverslip per almeno 30 s.</li>
		<li>Autoclave dei dispositivi incollati prima di aggiungere celle.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Costruire una configurazione di stimolazione ottica
<ol><li>Utilizzando un sistema a cubo a gabbia da 30 mm, collegare uno specchio dicroico da 573 nm al centro. Accoppia un LED rosso da 627 nm con un filtro di eccitazione a lungo passaggio da 594 nm e collegalo al lato superiore del cubo, con il LED rivolto verso lo specchio. Quindi collegare un LED blu da 488 nm con un filtro di eccitazione a passaggio corto da 546 nm sul lato adiacente del cubo, con il LED rivolto verso lo specchio come mostrato nello schema nella Figura 3A.</li>
	<li>Attaccare un diaframma dell'iride azionato ad anello sul fondo del cubo della gabbia per controllare le dimensioni dell'area illuminata.</li>
	<li>Alimenta ogni LED da un driver LED T-Cube e controllalo tramite una scheda Arduino Uno Rev3. Collegare l'ingresso laterale del driver LED a una spina della fonte di alimentazione, collegare l'uscita centrale ad Arduino e collegare l'uscita laterale direttamente ai LED.</li>
	<li>Collegare Arduino Uno ad un PC tramite un cavo USB.</li>
	<li>Scaricare file dal collegamento GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis).</li>
	<li>Apri il file "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" dalla cartella GitHub.</li>
	<li>Impostare i parametri di partenza: Passi = 30; startFrequency = 0,5; endFrequency = 3; pulseLength = 100.</li>
	<li>Assicurarsi che l'uscita pin 4 sia assegnata al driver LED blu e che l'uscita pin 2 sia assegnata al driver LED rosso. Verificare che i fili centrali del driver LED siano collegati a terra e alla rispettiva uscita pin.</li>
	<li>Compila e carica il programma "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" su Arduino.</li>
	<li>Collegare ogni driver LED al canale corrispondente.</li>
</ol>3. Configurazione della coltura cellulare (giorno -21-0)
<ol><li>Cellule muscolari scheletriche primarie<ol>
<li>Scongelare ed espandere i mioblasti scheletrici primari (ottenuti da Cook Myosite) per un massimo di sei passaggi utilizzando il mezzo di crescita miotonico (+ supplemento). Mantenere le celle in un incubatore impostato a 37 °C e 5% CO2.</li>
		<li>Cambia i media ogni 2 giorni.</li>
		<li>Una volta che le cellule sono confluenti per circa il 60%, passarle usando lo 0,05% di tripsina-EDTA (1x, per 5 minuti a 37 °C). Raccogliere le cellule dissociate e aggiungere nuovi mezzi per neutralizzare la tripsina.</li>
		<li>Abbassare le cellule a 300 x g e aspirare il surnatante sopra il pellet cellulare.</li>
		<li>Risospese le cellule con MGM e seme 1:3 con 60 ml per pallone a triplo strato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ChR2-hiPSC NOTA: Tutte le linee cellulari per questo lavoro sono state create e utilizzate in conformità con le linee guida istituzionali della Columbia University, NY, USA. In questo protocollo, le hiPSC che esprimono ChR2 sono state generate tramite l'editing del genoma CRISPR-Cas9 utilizzando i metodi precedentemente descritti18, ma qualsiasi linea cellulare optogenetica stabile (lentivirale, piggyBac, ecc.) può essere utilizzata allo stesso modo. Sono stati scelti promotori costitutivi espressi sia in iPSC che in motoneuroni (CAG). Le cellule sono risultate avere cariotipo sano, come notato in precedenti pubblicazioni 18,19.<ol>
<li>Rivestire piastre a 6 pozzetti con 1 mL/pozzetto di matrice di membrana basale solubilizzata diluita in DMEM/F12 (1:80) e incubare le piastre a temperatura ambiente per 1 ora.</li>
		<li>Semina iPSC su piastre rivestite a 6 pozzetti con 2 mL di terreno di coltura cellulare privo di alimentatore (iPSC media), scambiando 2 mL di media a giorni alterni e passando ogni 5-7 giorni. Mantenere le cellule in un incubatore impostato a 37 ° C e 5% CO2.</li>
		<li>Passaggio<ol>
<li>Dissociare le cellule staminali incubando con 1 mL di reagente rilasciando cellule staminali prive di enzimi per 4 minuti e tagliando meccanicamente con una pipetta P1000 a punta larga.</li>
			<li>Cellule di semi in un rapporto di 1:24 o 1:48 in mezzi iPSC con 2 μM di dicloridrato Y-27632 in 2 ml/pozzetto su piastre rivestite a 6 pozzetti.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Semina del tessuto muscolare scheletrico (giorno -3)
<ol><li>Isolare e contare 30 x 106 mioblasti utilizzando un contatore cellulare automatizzato.</li>
	<li>Sospendere i mioblasti in una miscela 4:1 di 3 mg/mL di collagene I e matrice solubilizzata della membrana basale (800 μL di miscela di collagene + 200 μL di matrice di membrana basale per raggiungere un volume finale di 1 mL). Per il componente collagene, aggiungere l'agente neutralizzante di accompagnamento (miscela 9:1 di collagene all'agente neutralizzante) e diluire la miscela con 1x PBS per ottenere un volume di 800 μL.</li>
	<li>Aggiungere 15 μL di sospensione di collagene cellulare a ciascuna camera muscolare del bioreattore, assicurandosi di distribuire la sospensione su entrambi i pilastri utilizzando la punta della pipetta (Figura 2).</li>
	<li>Lasciare polimerizzare la miscela cellula-gel a 37 °C per 30 minuti e quindi riempire bene ogni bioreattore con 450 μL di terreno di crescita miotonico.</li>
	<li>Dopo 3 giorni (una volta che il gel si è compattato), iniziare la differenziazione del miotubo.</li>
</ol>5. Differenziazione miotubica (giorni 0-14)
<ol><li>Iniziare l'infusione di miotubi commutando i tessuti a 450 μL di mezzi che inducono la fusione (FS, Tabella 1) per 7 giorni, cambiando i mezzi a giorni alterni. NOTA: Provare a iniziare la differenziazione dei miotubi lo stesso giorno della differenziazione dei motoneuroni dalle hiPSC al fine di seminare i motoneuroni alla fine dei programmi di differenziazione di entrambi i tipi di cellule.</li>
	<li>Il giorno 7 cambiare il mezzo a 450 μL di terreno di maturazione Ia (MMIa, Tabella 1).</li>
	<li>Il giorno 9, passare a 450 μL di terreno di maturazione Ib (MMIb, Tabella 1).</li>
	<li>Il giorno 11, cambiare il supporto a 450 μL di NbActiv4. Continuare a cambiare il supporto ogni 2 giorni fino a quando i motoneuroni non sono seminati (Passaggio 7).</li>
</ol>6. Differenziazione del motoneurone (giorni 0-14)
NOTA: Il nostro protocollo di differenziazione dei motoneuroni è stato adattato da Maury et al8.
<ol><li>Il giorno 0, trasferire 4 x 106 ChR2- hiPSC su una capsula di Petri ad attacco ultra-basso con 15 mL di terreno di coltura di sospensione del motoneurone (MSCM, Tabella 1). Integrare MSCM con 3 μM CHIR99021, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 idrato e 5 μM Y-27632 dicloridrato.</li>
	<li>Il giorno 2, isolare le neurosfere (NS) con un filtro reversibile da 37 μM e riplazionare in 15 mL di MSCM con 3 μM CHIR99021, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 idrato e 0,1 μM di acido retinoico. NS dovrebbe essere visibile nella capsula di Petri senza usare un microscopio dopo il giorno 2.</li>
	<li>Il giorno 4, trasferire le cellule e i mezzi in un tubo da 50 ml e consentire alle neurosfere di depositarsi sul fondo (5 minuti). Aspirare il surnatante e risospesare le cellule in 15 ml di MSCM integrati con 0,5 μM SAG, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431541 e 0,1 μM di acido retinoico.</li>
	<li>Il giorno 7, ripetere il passaggio 6.3. ma risospese le cellule in 15 mL di MSCM integrati con 0,5 μM SAG e 0,1μM di acido retinoico.</li>
	<li>Il giorno 9, ripetere il passaggio 6.3. ma le cellule risospese in 15 mL di MSCM integrate con 10 μM DAPT.</li>
	<li>Il giorno 11, ripetere il passaggio 6.3. ma risospese le cellule in 15 mL di MSCM integrate con 20 ng/mL BDNF e 10 ng/mL GDNF.</li>
	<li>Il giorno 14, semina i motoneuroni nella piattaforma.</li>
</ol>7. Semina di aggregati di motoneuroni in bioreattore (giorno 14)
<ol><li>Preparare una miscela di gel 4:1 di 2 mg/mL di collagene I e Matrigel (800 μL di miscela di collagene + 200 μL di Matrigel per raggiungere un volume finale di 1 mL). Per il componente collagene, aggiungere l'agente neutralizzante di accompagnamento (miscela 9:1 di collagene all'agente neutralizzante) e diluire la miscela con 1x PBS per ottenere un volume finale di 800 μL.</li>
	<li>Utilizzare un filtro cellulare da 400 nm per selezionare grandi neurosfere e risospescerle nella miscela di gel.</li>
	<li>Aspirare i mezzi dal serbatoio e con attenzione dal pozzo della neurosfera (Figura 2).</li>
	<li>Aggiungere 15 μL di miscela di gel nel canale della neurosfera.</li>
	<li>Caricare una pipetta da 10 μL con 10 μL di gel e quindi scegliere una neurosfera.</li>
	<li>Depositare la NS nel canale della neurosfera e assicurarsi che la NS sia nella camera. Sollevare lentamente la pipetta rilasciando il gel rimanente una volta depositato l'NS. Se non sei sicuro che l'NS sia stato depositato correttamente, controlla la sua posizione usando un microscopio.</li>
	<li>Lasciare polimerizzare il gel per 30 minuti a 37 °C.</li>
	<li>Aggiungere 450 μL di NbActiv4 integrati con 20 ng/mL BDNF e 10 ng/mL GDNF ai serbatoi.</li>
	<li>Cambia i media a giorni alterni per consentire la crescita assonale dalla NS al tessuto muscolare.</li>
</ol>8. Stimolazione ottica simultanea e registrazione video della funzione NMJ (giorno 24+)
<ol><li>Per l'imaging, utilizzare un microscopio fluorescente invertito con una fotocamera scientifica complementare metallo-ossido-semiconduttore (sCMOS).</li>
	<li>Impostare il binning del software della fotocamera su 2x2, esposizione a 20 ms, rolling shutter ON, velocità di lettura a 540 MHz, gamma dinamica: 12 bit e guadagno 1 e modalità sensore: sovrapposizione.</li>
	<li>Usa l'obiettivo 2x sul microscopio per visualizzare i microtissu.</li>
	<li>Collegare una camera a cellule vive (37 °C, 5% CO2) allo stadio del microscopio.</li>
	<li>Selezionare la regione di interesse (ROI) che contiene il tessuto dei tessuti scheletrici innervati per ridurre al minimo le dimensioni del file e il tempo di elaborazione.</li>
	<li>Posizionare un filtro di emissione passa-lungo da 594 nm tra il campione e l'obiettivo di imaging per filtrare gli impulsi di luce blu dalla fotocamera.</li>
	<li>Posizionare una piastra rettangolare a 4 pozzetti contenente 4 bioreattori (24 tessuti) nella camera delle cellule vive.</li>
	<li>Fare clic su Live View. Centra e focalizza l'immagine con il ROI desiderato.</li>
	<li>Carica il codice macro personalizzato dalla cartella GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis) per controllare la posizione dello stage, la scheda Arduino e l'acquisizione video.</li>
	<li>Impostare il filmato di output come segue: day_tissue group_tissue name_experiment.nd2.</li>
	<li>Esegui il codice macro con le coordinate X,Y desiderate impostate sullo stage e acquisisci un time lapse veloce con 1700 fotogrammi a 50 fotogrammi/s.</li>
	<li>Sostituire il supporto dopo l'imaging e restituire i campioni all'incubatore. Consentire almeno 24 ore tra le sessioni di acquisizione delle immagini per evitare l'affaticamento dei tessuti.</li>
</ol>9. Elaborazione e analisi dei lotti (giorno 24+)
<ol><li>Elaborazione filmati<ol>
<li>Utilizza il codice MATLAB personalizzato per elaborare i video in analisi batch. I file possono essere scaricati dalla cartella GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis). Le funzioni sono elencate e spiegate nella Tabella 2. NOTA: il codice è compatibile con i formati .nd2 e .czi. Richiede l'elaborazione parallela per essere attivato in MATLAB e ha bisogno del pacchetto bioformati.</li>
		<li>Eseguire lo script recursiveOSAnalysis per analizzare i filmati tramite elaborazione parallela. Avere tutti i video acquisiti nella stessa cartella e selezionare quella cartella durante l'esecuzione del codice.</li>
		<li>Regolate i parametri post-analisi in base alle esigenze.<ol>
<li>Modificare baselineTime (opzione 1) se la contrazione spontanea viene rilevata all'inizio della registrazione. Questo mostrerà una lettura iniziale superiore a 0 e avrà bisogno che il fotogramma venga spostato per compensare.</li>
			<li>Modificare peakThreshold (opzione 2) se le contrazioni non vengono registrate. Il codice rileverà le contrazioni superiori al 25% del picco più alto per impostazione predefinita in modo che questo valore possa essere modificato.</li>
			<li>Modificare minMinProminence e minMinWidth per regolare la sensibilità quando si rileva l'inizio di ogni picco.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Genera output video e grafico.<ol>
<li>Eseguire recursiveOSMovie per generare un file video per ogni tessuto con la rispettiva traccia di contrattilità.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>10. Perturbazione della funzione NMJ (giorno 24+)
<ol><li>Preparare i mezzi di trattamento aggiungendo un effettore esterno al mezzo basale NbActiv4 integrato con 20 ng/mL BDNF e 10 ng/mL GDNF.<ol>
<li>Per l'esperimento MG sera, utilizzare il 20% di sieri del paziente MG in NbActiv4 + BDNF + GDNF.</li>
		<li>Per l'esperimento BTX, utilizzare 5 μg/mL BTX in NbActiv4 + BDNF + GDNF.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stimolare/visualizzare utilizzando il passaggio 3.2. per registrare la linea di base.</li>
	<li>Sostituire il mezzo nei tessuti con mezzi di trattamento (450 μL/tessuto).</li>
	<li>Incubare per il tempo desiderato (48 ore per i sieri del paziente, 20 minuti per BTX).</li>
	<li>Stimolare/visualizzare di nuovo utilizzando il passaggio 3.2. per registrare la funzione dopo il trattamento.</li>
	<li>Rimuovere il mezzo di trattamento e lasciare riposare i tessuti per il tempo desiderato (48 ore dopo la rimozione dei sieri) NOTA: consentire almeno 24 ore tra la stimolazione e l'imaging per evitare l'affaticamento dei tessuti</li>
</ol>

<ol><li>Al-bassam, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics%2C+incidence%2C+and+outcome+of+patients+admitted+to+the+intensive+care+unit+with+myasthenia+gravis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Characteristics, incidence, and outcome of patients admitted to the intensive care unit with myasthenia gravis.</a> Journal of Critical Care. 45, 90-94 (2018).</li>
<li>Vila, O. F., Qu, Y., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+neuromuscular+junctions+and+their+potential+for+novel+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">In vitro models of neuromuscular junctions and their potential for novel drug discovery and development.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 15 (3), 307-317 (2020).</li>
<li>Webster, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+the+neuromuscular+junction%2C+vitally+informative+for+understanding+function+and+the+molecular+mechanisms+of+congenital+myasthenic+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Animal models of the neuromuscular junction, vitally informative for understanding function and the molecular mechanisms of congenital myasthenic syndromes.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), 1326(2018).</li>
<li>Jones, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+anatomy+of+the+human+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular anatomy of the human neuromuscular junction.</a> Cell Reports. 21 (9), 2348-2356 (2017).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+human+pluripotent+stem+cells+into+a+functional+skeletal+muscle+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue.</a> Nature Communications. 9 (1), 126(2018).</li>
<li>Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+human+myobundles+mimic+clinical+responses+of+skeletal+muscle+to+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs.</a> eLife. 4, 04885(2015).</li>
<li>Maury, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+analysis+of+developmental+cues+efficiently+converts+human+pluripotent+stem+cells+into+multiple+neuronal+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes.</a> Nature Biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).</li>
<li>Bianchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+differentiation+of+functional+motor+neurons+from+human+iPSC+for+neural+injury+modelling%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient differentiation of functional motor neurons from human iPSC for neural injury modelling.</a> Stem Cell Research. 32, 126-134 (2018).</li>
<li>Turan, S., Farruggio, A. P., Srifa, W., Day, J. W., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+correction+of+disease+mutations+in+induced+pluripotent+stem+cells+derived+from+patients+with+limb+girdle+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Precise correction of disease mutations in induced pluripotent stem cells derived from patients with limb girdle muscular dystrophy.</a> Molecular Therapy. 24 (4), 685-696 (2016).</li>
<li>Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+as+a+disease+modeling+and+drug+screening+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).</li>
<li>Lin, C. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPSC-derived+functional+human+neuromuscular+junctions+model+the+pathophysiology+of+neuromuscular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">iPSC-derived functional human neuromuscular junctions model the pathophysiology of neuromuscular diseases.</a> JCI Insight. 4 (18), (2021).</li>
<li>Centeno, E. G. Z., Cimarosti, H., Bithell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2D+versus+3D+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cultures+for+neurodegenerative+disease+modelling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">2D versus 3D human induced pluripotent stem cell-derived cultures for neurodegenerative disease modelling.</a> Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 27(2018).</li>
<li>Okano, T., Matsuda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineered+skeletal+muscle%3A+preparation+of+highly+dense%2C+highly+oriented+hybrid+muscular+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Tissue engineered skeletal muscle: preparation of highly dense, highly oriented hybrid muscular tissues.</a> Cell Transplantation. 7 (1), 71-82 (1998).</li>
<li>Powell, C. A., Smiley, B. L., Mills, J., Vandenburgh, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stimulation+improves+tissue-engineered+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanical stimulation improves tissue-engineered human skeletal muscle.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 283 (5), 1557-1565 (2002).</li>
<li>Ronaldson-Bouchard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+maturation+of+human+cardiac+tissue+grown+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells.</a> Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).</li>
<li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human-based+functional+NMJ+system+for+personalized+ALS+modeling+and+drug+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">A human-based functional NMJ system for personalized ALS modeling and drug testing.</a> Advanced Therapeutics. 3 (11), 2000133(2020).</li>
<li>Vila, O. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+optogenetic+model+of+human+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Bioengineered optogenetic model of human neuromuscular junction.</a> Biomaterials. 276, 121033(2021).</li>
<li>Vila, O. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+human+neuromuscular+function+through+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Quantification of human neuromuscular function through optogenetics.</a> Theranostics. 9 (5), 1232-1246 (2019).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2%2C+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).</li>
<li>Steinbeck, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+connectivity+under+optogenetic+control+allows+modeling+of+human+neuromuscular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional connectivity under optogenetic control allows modeling of human neuromuscular disease.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 134-143 (2016).</li>
<li>Santhanam, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+derived+phenotypic+human+neuromuscular+junction+model+for+dose+response+evaluation+of+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Stem cell derived phenotypic human neuromuscular junction model for dose response evaluation of therapeutics.</a> Biomaterials. 166, 64-78 (2018).</li>
<li>Phillips Ii, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidemiology+of+myasthenia+gravis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The epidemiology of myasthenia gravis.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 998 (1), 407-412 (2003).</li>
<li>Sanders, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+change+in+acetylcholine+receptor+antibody+level+correlate+with+clinical+change+in+myasthenia+gravis%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+%26+Nerve%22%5BJournal%5D)">Does change in acetylcholine receptor antibody level correlate with clinical change in myasthenia gravis.</a> Muscle & Nerve. 49 (4), 483-486 (2014).</li>
<li>Vernino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+enigma+of+seronegative+myasthenia+gravis%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Neurology%22%5BJournal%5D)">Unraveling the enigma of seronegative myasthenia gravis.</a> JAMA Neurology. 72 (6), 630-631 (2015).</li>
<li>Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microphysiological+3D+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+%28ALS%29+from+human+iPS-derived+muscle+cells+and+optogenetic+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons.</a> Science Advances. , (2018).</li>
<li>Paredes-Redondo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+modeling+of+human+neuromuscular+circuits+in+Duchenne+muscular+dystrophy+with+CRISPR+and+pharmacological+corrections%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Optogenetic modeling of human neuromuscular circuits in Duchenne muscular dystrophy with CRISPR and pharmacological corrections.</a> Science Advances. 7 (37), (2021).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Questo sistema è un modello di tessuto umano 3D ingegnerizzato che combina optogenetica ed elaborazione video per consentire una valutazione automatizzata e imparziale della funzione NMJ. Utilizzando un protocollo standardizzato, abbiamo dimostrato la capacità di misurare i cambiamenti nella funzione NMJ durante lo sviluppo fisiologico e caratterizzare gli effetti dannosi di patologie come l'esposizione alle neurotossine e la miastenia gravis dei sieri dei pazienti.
Studi precedenti hanno ripo...

La giunzione neuromuscolare (NMJ) è la sinapsi chimica tra motoneuroni (MN) e cellule muscolari scheletriche (SkM) che consente la contrazione muscolare. Le tossine, come la neurotossina α-bungarotossina (BTX), o le malattie neuromuscolari (NMD) come la miastenia grave (MG) possono portare alla degenerazione del NMJ e alla riduzione del controllo muscolare1. I modelli di tessuto umano bioingegnerizzati ricapitolano meglio i meccanismi funzionali e fisiologici degli NMJ umani e offrono un maggiore potenziale traslazionale rispetto ai modelli animali.
Mentre i modelli animali hanno avanzato la comprensione della formazione e della funzione del NMJ, ci sono differenze significative tra sinapsi umane e animali che limitano la traduzione dei risultati all'uomo e rendono la caratterizzazione in vivo del NMJ impegnativo 2,3,4. Gli studi hanno mostrato differenze fisiologiche distinte tra NMJ di topo e umani. I topi hanno NMJ più grandi e densità di zone attive più piccole rispetto agli NMJ umani4. Inoltre, gli studi farmacologici condotti su modelli animali non sempre riflettono gli effetti riscontrati negli studi clinici sull'uomo. I modelli di tessuto umano ingegnerizzati offrono l'opportunità di studiare lo sviluppo sano del NMJ e la patologia delle malattie neuromuscolari e consentono screening farmacologici. Le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSCs)5 possono essere differenziate in una varietà di tipi di cellule, comprese le cellule muscolari scheletriche 6,7 e i motoneuroni 8,9. Le hiPSC possono essere generate facilmente dalle cellule del paziente, consentendo una migliore modellazione della malattia10 e lo screening farmacologico 11,12 attraverso modelli tissutali specifici per il paziente.
Le co-colture monostrato bidimensionali (2D) di SkM e MN mancano della morfologia, del fenotipo, dell'organizzazione e del comportamento funzionale degli NMJ fisiologici. Gli NMJ si formano casualmente in coltura 2D, il che inibisce l'isolamento delle unità motorie per l'analisi, limita le misurazioni funzionali accurate e ne impedisce l'uso per esperimenti ripetuti e sistematici13 . I modelli tissutali tridimensionali (3D) di NMJ superano molte di queste limitazioni, ricapitolando le caratteristiche morfologiche e funzionali delle NMJ fisiologiche 7,14,15,16,17. Utilizzando questo modello, i due tipi di tessuto vengono sviluppati separatamente e quindi integrati dirigendo la crescita assonale, consentendo lo sviluppo di NMJ più organizzati rispetto ai sistemi di coltura 2D.
Il nostro studio precedente ha dimostrato che la combinazione di optogenetica con l'ingegneria tissutale può consentire un'accurata stimolazione non invasiva e la valutazione della funzione NMJ18,19. Attraverso l'ingegneria genetica, le proteine sensibili alla luce possono essere integrate nel genoma delle hiPSC. L'integrazione di channelrhodopsin-2 (ChR2), un canale ionico che si apre in risposta alla luce blu, nella membrana di cellule eccitabili come i neuroni consente il controllo spaziotemporale senza contatto sull'attivazione cellulare 20,21,22. Le hiPSC che trasportano ChR2 possono essere differenziate in motoneuroni optogenetici sensibili alla luce blu, eliminando la necessità di elettrodi invasivi tipici che stimolano i neuroni ed evitando la stimolazione indesiderata delle cellule muscolari da parte degli elettrodi23. Questo sistema utilizza motoneuroni optogenetici per stimolare le contrazioni nelle cellule muscolari scheletriche non optogenetiche. La combinazione di acquisizione video e illuminazione controllata della luce blu consente di stimolare e registrare simultaneamente i tessuti co-coltivati per la funzione NMJ.
MG è causato da autoanticorpi che prendono di mira i recettori nicotinici dell'acetilcolina (AChR), che si traduce in diminuzione della funzione NMJ e debolezza muscolare24. Viene diagnosticata in base ai sintomi presentati, all'elettrodiagnosi e al rilevamento di autoanticorpi tramite esami del sangue sierologici. Tuttavia, non tutti gli autoanticorpi coinvolti nella MG sono stati identificati e ad alcuni pazienti sieronegativi viene diagnosticata la MG ma senza anticorpi riconosciuti25,26. Il nostro sistema consente una valutazione funzionale ripetuta dell'NMJ prima e dopo l'aggiunta di siero da pazienti con MG, fornendo preziose informazioni sui cambiamenti funzionali e biochimici causati dagli anticorpi MG18. Il nostro protocollo illustra come produrre modelli 3D in vitro di NMJ umano funzionale che possono essere utilizzati per diagnosticare e studiare patologie NMJ e testare potenziali terapie. Dimostriamo la versatilità del sistema in due piattaforme, un dispositivo microfluidico e una più grande piattaforma di bioreattore a pozzo aperto.

<table><tbody><tr><td>Cells</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SkMDC</td><td>Cook Myosite</td><td>P01059-14M</td><td></td></tr><tr><td>Media e integratori</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12634-020</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di albumina sierica bovina</td><td>Millipore Sigma</td><td>A9576-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Integratore G-5 (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17503-012</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotico selettivo Geneticin (G418 solfato) (50 mg/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10131-035</td><td></td></tr><tr><td>Insulina, ricombinante Millipore umano</td><td>Sigma</td><td>91077C-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR Plus</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>100-0276</td><td></td></tr><tr><td>Kit di terreni di crescita MyoTonic</td><td>Cook Myosite</td><td>MK-4444</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Integratore</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>NbActiv4 500 mL</td><td>BrainBits LLC</td><td>Nb4-500</td><td></td></tr><tr><td>Medium neurobasale</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal-A Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A13710-01</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5872</td><td></td></tr><tr><td>Plasticware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 mm sistema di cubi a gabbia</td><td>ThorLabs</td><td>CM1-DCH, CP33, ER1-P4 e ER2-P4</td><td></td></tr><tr><td>37 &; m Filtro reversibile, grandi</td><td>cellule staminali Technologies</td><td>27250</td><td></td></tr><tr><td>Filtro di eccitazione passa-corto da 546 nm</td><td>Semrock</td><td>FF01-546/SP-25</td><td></td></tr><tr><td>Specchio dicroico da 573 nm</td><td>Semrock</td><td>FF573-Di01... Filtro di emissione passa-lungo 25x36</td><td></td></tr><tr><td>594 nm</td><td>Semrock</td><td>BLP01-594R-25</td><td></td></tr><tr><td>Filtro di eccitazione passa-lungo 594 nm</td><td>Semrock</td><td>BLP01-594R-25</td><td></td></tr><tr><td>LED ribelle blu (470nm) su base quadrata SinkPAD-II 10mm - 65 lm @ 700mA</td><td>LuxeonStarLEDs</td><td>SP-05-B4</td><td></td></tr><tr><td>Carclo 29.8&deg; Ottica a fascio circolare satinato da 10 mm - Gambe integrate</td><td>LuxeonStarLED</td><td>10413</td><td></td></tr><tr><td>Corning 60 mm Piatto di coltura con attacco ultra-basso</td><td>Corning</td><td>3261</td><td></td></tr><tr><td>Dissipatore di calore</td><td>LuxeonStarLED</td><td>LPD-19-10B</td><td></td></tr><tr><td>Optics</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pluriStrainer 400 &; m, confezione da 25, sterile</td><td>PluriSelect</td><td>43-50400-03</td><td></td></tr><tr><td>pluriStrainer 500 &; micro; m, confezione da 25, sterile</td><td>PluriSelect</td><td>43-50500-03</td><td></td></tr><tr><td>LED Rebel rosso (627nm) su base quadrata SinkPAD-II da 10 mm - 65 lm @ 700mA</td><td>LuxeonStarLEDs</td><td>SP-05-R5</td><td></td></tr><tr><td>diaframma a iride ad anello</td><td>ThorLabs</td><td>SM1D12D</td><td></td></tr><tr><td>driver LED ThorLabs T-Cube</td><td>ThorLabs</td><td>LEDD1B, KPS101</td><td></td></tr><tr><td>Molds</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Distanziatori esagonali filettati femmina,&nbsp; 3 1/2" 10-32, parzialmente filettato 1/2"</td> <td>McMaster</td><td>91920A046</td><td></td></tr><tr><td>a basso profilo&nbsp; C-Clamp</td><td>McMaster</td><td>1705A12</td><td></td></tr><tr><td>Fattori di crescita</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 3&prime;,5&prime;-monofosfato ciclico</td><td>Millipore Sigma</td><td>A9501-1G</td><td></td></tr><tr><td>CHIR 99021, 10 mg</td><td>Tocris</td><td>4423/10</td><td></td></tr><tr><td>DAPT 10 mg</td><td>R& D Systems</td><td>2634/10</td><td></td></tr><tr><td>Human CNTF, grado di ricerca, 5 &; micro; g</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>130-096-336</td><td></td></tr><tr><td>Proteina Vitronectina Umana, CF</td><td>R& D Systems</td><td>2349-VN-100</td><td></td></tr><tr><td>Proteina Vitronectina Umana, CF</td><td>R& D Systems</td><td>2349-VN-100</td><td></td></tr><tr><td>IGF1 Proteina umana ricombinante</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PHG0078</td><td></td></tr><tr><td>Proteina di topo laminina, naturale</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23017015</td><td></td></tr><tr><td>Proteina di agrina umana ricombinante</td><td>R& D Systems</td><td>6624-AG-050</td><td></td></tr><tr><td>Proteina GDNF umana ricombinante, CF 50ug</td><td>R& D Systems</td><td>212-GD-050/CF</td><td></td></tr><tr><td>Neurotrofina umana ricombinante 3&nbsp; 100 ug</td><td>Cell Sciences</td><td>CRN500D</td><td></td></tr><tr><td>Neurotropina umana ricombinante-4</td><td>Cell Sciences</td><td>CRN501B</td><td></td></tr><tr><td>Riccio sonico umano ricombinante / Shh (C24II) N-Terminus</td><td>R & D Systems</td><td>1845-SH-100</td><td></td></tr><tr><td>Ricombinante Umano/Murino/Ratto BDNF 50 ug</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>Acido retinoico, 50 mg</td><td>Millipore Sigma</td><td>R2625-50</td><td></td></tr><tr><td>SAG Agonista levigato</td><td>Millipore Sigma</td><td>566660</td><td></td></tr><tr><td>SB431542 10 mg</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72234</td><td></td></tr><tr><td>StemMACS LDN-193189</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>130-103-925</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectina da plasma umano</td><td>Millipore Sigma</td><td>V8379-50UG</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dicloridrato</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-actinin mAb (Mouse IgG1)</td><td>Abcam</td><td>ab9465</td><td></td></tr><tr><td>Colina acetiltransferasi (ChAT) (Capra)</td><td>Millipore</td><td>AB144P</td><td></td></tr><tr><td>Desmin mAb (Mouse IgG1)</td><td>Dako</td><td>M076029-2</td><td></td></tr><tr><td>Myosin Heavy Chain (MHC) (Mouse IgG2b)</td><td>DSHB</td><td>MF20</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arduino Uno R3</td><td>Arduino</td><td>A000066</td><td></td></tr><tr><td>Tavolino automatizzato</td><td>Strumentazione scientifica applicata</td><td>MS- 2000 XYZ</td><td></td></tr><tr><td>Pulitore al plasma espanso</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001&nbsp;( 115V)</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Countess Contatore di cellule automatizzato</td><td>Marshal</td><td>Scientific I-CACC</td><td></td></tr><tr><td>IX-81 Microscopio a fluorescenza invertita</td><td>Olympus</td><td>IX-ILL100LH</td><td></td></tr><tr><td>Series Stage Top Incubator System</td><td>Tokai Hit STX</td><td>TOKAI-HIT-STXG</td><td></td></tr><tr><td>Zyla 4.2 sCOMS Camera</td><td>Andor Technology</td><td>ZYLA-4.2P-CL10</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arduino Software (IDE)</td><td>Arduino</td><td>IDE 1.8.19</td><td></td></tr><tr><td>Mastercam</td><td>Mastercam Mastercam</td><td>per Solidworks</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Matlab</td><td>R2021b</td><td></td></tr><tr><td>Elementi NIS</td><td>Nikon</td><td>Basic Research</td><td></td></tr><tr><td>Solidworks 3D</td><td>CAD Solidworks</td><td>Solidworks Standard</td><td></td></tr></tbody></table>

ingegnerizzazione e caratterizzazione di un modello optogenetico della giunzione neuromuscolare umana

Engineering and Characterization of an Optogenetic Model of the Human Neuromuscular Junction

Molte malattie neuromuscolari, come la miastenia grave (MG), sono associate a disfunzione della giunzione neuromuscolare (NMJ), che è difficile da caratterizzare nei modelli animali a causa delle differenze fisiologiche tra animali e umani. L'ingegneria tissutale offre l'opportunità di fornire modelli in vitro di NMJ umani funzionali che possono essere utilizzati per diagnosticare e studiare patologie NMJ e testare potenziali terapie. Incorporando proteine optogenetiche in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), abbiamo generato neuroni che possono essere stimolati con specifiche lunghezze d'onda della luce. Se l'NMJ è sano e funzionale, un segnale neurochimico dal motoneurone provoca la contrazione muscolare. Attraverso l'integrazione dell'optogenetica e della microfabbricazione con l'ingegneria tissutale, abbiamo stabilito una metodologia imparziale e automatizzata per caratterizzare la funzione NMJ utilizzando l'analisi video. È stato sviluppato un protocollo standardizzato per la formazione di NMJ, la stimolazione ottica con registrazione video simultanea e l'analisi video della contrattilità tissutale. La stimolazione dei motoneuroni optogenetici da parte della luce per indurre contrazioni muscolari scheletriche ricapitola la fisiologia NMJ umana e consente ripetute misurazioni funzionali di NMJ nel tempo e in risposta a vari input. Dimostriamo la capacità di questa piattaforma di mostrare miglioramenti funzionali nella connettività neuromuscolare nel tempo e caratterizzare gli effetti dannosi degli anticorpi MG del paziente o delle neurotossine sulla funzione NMJ.

Le giunzioni neuromuscolari sono state generate dalla co-coltura di motoneuroni optogenetici derivati da hiPSC con tessuto muscolare scheletrico non optogenetico. I mioblasti scheletrici primari umani (SkM) sono stati seminati nelle piattaforme e differenziati in miotubi multinucleati utilizzando il protocollo di 2 settimane. I motoneuroni optogenetici sono stati differenziati separatamente, ma in parallelo con la differenziazione del miotubo, e quindi seminati nella piattaforma (Figura 1). ...

Descriviamo un sistema di imaging riproducibile, automatizzato e imparziale per caratterizzare la funzione di giunzione neuromuscolare utilizzando tessuto muscolare scheletrico ingegnerizzato umano e motoneuroni optogenetici. Questo sistema consente la quantificazione funzionale della connettività neuromuscolare nel tempo e rileva una diminuzione della funzione neuromuscolare causata da neurotossine e miastenia grave del siero del paziente.

Ingegnerizzazione e caratterizzazione di un modello optogenetico della giunzione neuromuscolare umana

Many neuromuscular diseases, such as myasthenia gravis (MG), are associated with dysfunction of the neuromuscular junction (NMJ), which is difficult to ...

Questo protocollo descrive come progettare giunzioni neuromuscolari umane 3D funzionali in vitro che possono essere utilizzate per studiare patologie neuromuscolari e testare potenziali terapie. Questa tecnica utilizza la stimolazione optogenetica simultanea e l'elaborazione video. Sono cambiamenti quantificati nella funzione di giunzione neuromuscolare durante lo sviluppo e a causa di fattori esterni, come neurotossine e siero da pazienti con miastenia grave.I passaggi che coinvolgono la cellula muscolare e il motoneurone che seminano nel bioreattore possono essere impegnativi all'inizio. Mantenere la miscela di gel di collagene sul ghiaccio può aiutare a prolungare il tempo disponibile per seminare tutte le cellule prima che il gel si solidifichi. Iniziare mescolando una base 10 a 1 alla miscela di agenti polimerizzanti di polidimetilsilossano o PDMS e posizionare la miscela in una camera a vuoto.Chiudere tutte le valvole e accendere il vuoto per degassare la miscela per almeno 30 minuti fino a quando non rimangono bolle d'aria. Versare la miscela negli stampi e degassare gli stampi nella camera a vuoto per 1 ora, quindi chiudere gli stampi con la metà superiore dello stampo nel corretto orientamento. Posizionare un'asta di acciaio esagonale sopra il centro e bloccare su entrambi i lati.Quindi, riempire la parte superiore con PDMS e polimerizzare gli stampi in un forno a 65 gradi Celsius per almeno 4 ore. Dopo che gli stampi si sono raffreddati a temperatura ambiente, rimuovere le piattaforme dagli stampi. Nel frattempo, il coperchio di vetro scivola in poliolo tensioattivo non ionico all'1% per 30 minuti, assicurandosi che gli scivoli di copertura non si impilano e siano tutti adeguatamente rivestiti, quindi sciacquarli bene con acqua distillata e asciugarli durante la notte a 65 gradi Celsius.Trattare gli scivoli del coperchio in vetro e la piattaforma PDMS utilizzando un detergente al plasma in alto con 6 litri al minuto di ossigeno per 1 o 2 minuti. Una volta trattati, legare i due insieme premendo il PDMS verso il basso sul coperchio scivolare per almeno 30 secondi. Preparare una miscela 4 a 1 di 3 milligrammi per millilitro di collagene 1 e matrice di membrana basale solubilizzata, quindi risospesciare i mioblasti in questa miscela di collagene appena preparata.Quindi, aggiungere 15 microlitri di questa sospensione di collagene cellulare a ciascuna camera muscolare del bioreattore, assicurandosi di distribuire la sospensione su entrambi i pilastri utilizzando la punta della pipetta. Lasciare polimerizzare la miscela di gel cellulare a 37 gradi Celsius per 30 minuti, quindi riempire bene ogni bioreattore con 450 microlitri di mezzi di crescita miotonici. Il giorno 11 della differenziazione del motoneurone, trasferire le cellule e i mezzi in un tubo da 50 millilitri e consentire alle neurosfere di depositarsi sul fondo per 5 minuti.Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 15 millilitri di terreno di coltura di sospensione di motoneurone integrato con 20 nanogrammi per millilitro di fattore neurotrofico derivato dal cervello e 10 nanogrammi per millilitro di fattore neurotrofico derivato da cellule gliali. Il giorno 14 dei protocolli di differenziazione, semina i motoneuroni nella piattaforma. Preparare una miscela di gel 4 a 1 di 2 milligrammi per millilitro di collagene 1 e matrice di membrana basale solubilizzata.Utilizzare un filtro cellulare a 400 nanometri per selezionare grandi neurosfere e risospenderle nella miscela di gel preparata. Aspirare accuratamente i mezzi dal serbatoio e dalla neurosfera bene, quindi aggiungere 15 microlitri della miscela di gel nel canale della neurosfera. Carica una pipetta da 10 microliti con 10 microlitri di gel e scegli una neurosfera.Depositare la neurosfera nel canale della neurosfera, assicurandosi che sia nella camera, quindi sollevare lentamente la pipetta mentre si rilascia il gel rimanente una volta depositata la neurosfera. Lasciare polimerizzare il gel per 30 minuti a 37 gradi Celsius, quindi aggiungere 450 microlitri di NbActiv4 integrati con 20 nanogrammi per millilitro di fattore neurotrofico derivato dal cervello e 10 nanogrammi per millilitro di fattore neurotrofico derivato dalle cellule gliali ai serbatoi. Per l'imaging, utilizzare un microscopio fluorescente invertito con un software scientifico complementare per fotocamere a semiconduttore di ossido di metallo.Impostare Binning su 2 per 2, Esposizione a 20 millisecondi, Rolling shutter acceso, Velocità di lettura a 540 megahertz, Gamma dinamica a 12 bit e Guadagno 1 e Modalità sensore su Sovrapposizione. Utilizzare un obiettivo 2x sul microscopio per visualizzare i microtessuti e collegare una camera a cellule vive allo stadio del microscopio. Selezionare la regione di interesse che contiene i tessuti scheletrici innervati per ridurre al minimo le dimensioni del file e il tempo di elaborazione, quindi posizionare un filtro di emissione a lungo passaggio di 594 nanometri tra il campione e l'obiettivo di imaging per filtrare gli impulsi di luce blu dalla fotocamera.Quindi, posizionare una piastra rettangolare a 4 pozzetti contenente quattro bioreattori nella camera delle cellule vive, quindi fare clic su live view e centrare e mettere a fuoco l'immagine con il ROI desiderato. Scarica il codice macro personalizzato dalla cartella GitHub per controllare la posizione dello stage, la scheda Arduino e l'acquisizione video, quindi imposta il filmato di output come day underscore tissue group underscore tissue name underscore experiment dot ND2. Esegui il codice macro con le coordinate X e Y desiderate impostate sullo stage e acquisisci un time lapse veloce con 1700 fotogrammi a 50 fotogrammi al secondo.Dopo l'imaging, sostituire il supporto e restituire i campioni all'incubatore. Attendere almeno 24 ore tra le sessioni di acquisizione delle immagini per evitare l'affaticamento dei tessuti. Per l'elaborazione dei filmati, scarica i file dalla cartella GitHub e utilizza il codice MATLAB personalizzato per elaborare i video in analisi batch.Apri lo script di analisi ricorsiva del sistema operativo per avere tutti i video acquisiti nella stessa cartella. Regolare i parametri di pre-analisi ed eseguire lo script recursiveOSAnalysis per analizzare i filmati tramite elaborazione parallela. Regola i parametri post-analisi come il tempo di base, la soglia di picco, la prominenza min-min e la larghezza min-min in base alle esigenze.Infine, genera output video e grafico eseguendo recursiveOSMovie per generare un file video per ogni tessuto con la rispettiva traccia di contrattilità. Questo protocollo è stato testato utilizzando due sistemi con scale diverse, un dispositivo microfluidico che produce tessuti muscolari scheletrici lunghi 1 millimetro che comprendono circa 20.000 mioblasti e il sistema di bioreattori a pozzo aperto che produce tessuti muscolari lunghi 4 millimetri che comprendono circa 450 mioblasti. È stata costruita una configurazione ottica per consentire la stimolazione controllata dei motoneuroni con luce blu e la funzione NMJ è stata elevata utilizzando uno script macro del microscopio personalizzato abbinato a un codice Arduino personalizzato.Questo codice include parametri regolabili sintonizzabili e determina se viene attivata una contrazione in base al tempo tra un impulso luminoso e l'inizio del picco di contrattilità. Il sistema ha catturato il miglioramento della funzione NMJ nei tessuti mostrando un aumento delle risposte innescate una settimana dopo la fabbricazione dei tessuti, seguito da una funzione stabile per un'ulteriore settimana. L'alfa-bungarotossina ha fermato tutte le contrazioni innescate e spontanee con conseguente completa interruzione della funzione NMJ, dimostrando che la stimolazione leggera dei tessuti richiede un NMJ funzionale.L'analisi dei tessuti trattati con il 20% di miastenia grave per 48 ore ha mostrato una diminuzione della funzione rispetto ai tessuti di controllo trattati con siero di donatori sani. 48 ore dopo aver rimosso e lavato il siero, gli NMJ ingegnerizzati hanno mostrato un recupero della funzione. Assicurarsi che tutti i bioreattori siano in forno per lo stesso tempo per evitare la variabilità di rigidità tra i lotti.Inoltre, assicurati di verificare la semina del motoneurone usando il microscopio. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire metabalomica, proteomica e screening CRISPR per raccogliere ulteriori informazioni e comprendere meglio i cambiamenti meccanicistici causati dal siero malato.

engineering-characterization-an-optogenetic-model-human-neuromuscular

Research

Ricerca

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingegneria

Il video mostra la formazione di giunzioni neuromuscolari utilizzando un dispositivo microfluidico. Le cellule precursori neurali e le cellule progenitrici muscolari vengono seminate in diversi pozzetti all'interno del dispositivo e lasciate maturare rispettivamente in motoneuroni e miotubi. La creazione di un gradiente volumetrico e chimico porta allo sviluppo di giunzioni neuromuscolari attive.

Generazione di giunzioni neuromuscolari utilizzando un dispositivo microfluidico

Questo video mostra un metodo per valutare le giunzioni neuromuscolari funzionali. Utilizzando un bioreattore contenente tessuto muscolare e motoneuroni, insieme alla microscopia a fluorescenza, i canali sensibili alla luce nei neuroni vengono stimolati per generare segnali elettrici, causando contrazioni delle fibre muscolari.

Valutazione di una giunzione neuromuscolare funzionale tramite stimolazione ottica simultanea e registrazione video

Fonte: Marinello, M., et al. Caratterizzazione delle giunzioni neuromuscolari nei topi mediante microscopia combinata confocale e a super-risoluzione. J. Vis. Exp. (2021)Questo video mostra la preparazione, l'immunocolorazione e l'imaging delle giunzioni neuromuscolari nel tessuto muscolare di ratto utilizzando la microscopia confocale e a super-risoluzione per visualizzare e analizzare le strutture presinaptiche e postsinaptiche.

Caratterizzazione delle giunzioni neuromuscolari nei topi mediante microscopia combinata confocale e a super-risoluzione

Una valutazione funzionale della giunzione neuromuscolare (NMJ) può fornire informazioni essenziali sulla comunicazione tra nervo e del muscolo. Qui descriviamo un protocollo per valutare globalmente la giunzione neuromuscolare e il muscolo funzionalità utilizzando due preparazioni diverse del nervo-muscolo, cioè Soleo-sciatic e diaframma-frenico.

Funzionalità di misurazione della giunzione neuromuscolare

Qui forniamo un protocollo per generare NMJ in vitro da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (IPSC). Questo metodo può indurre NMJ con morfologia e funzione mature in 1 mese in un unico pozzo. Gli NMJ risultanti potrebbero potenzialmente essere utilizzati per modellare malattie correlate, per studiare meccanismi patologici o per migliorare i composti farmacologici per la terapia.

Giunzione neuromuscolare in vitro indotta da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo

La capacità di rilevare con precisione i componenti della giunzione neuromuscolare è fondamentale per valutare le modifiche nella sua architettura a causa di processi patologici o di sviluppo. Qui presentiamo una descrizione completa di un metodo semplice per ottenere immagini di alta qualità di giunzioni neuromuscolari a montaggio intero che possono essere utilizzate per eseguire misurazioni quantitative.

Dissezione di fibre muscolari scheletriche singole per analisi immunofluorescenti e morfometriche di giunzioni neuromuscolari a montaggio intero

Descriviamo un metodo per generare unità motorie umane in dispositivi microfluidici disponibili in commercio co-coltivando motoneuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane con miotubi primari derivati da mesoangioblasti umani con conseguente formazione di giunzioni neuromuscolari funzionalmente attive.

Generazione di unità motorie umane con giunzioni neuromuscolari funzionali in dispositivi microfluidici

Questo protocollo descrive un metodo per l'analisi morfometrica delle giunzioni neuromuscolari mediante microscopia combinata confocale e STED che viene utilizzata per quantificare i cambiamenti patologici in modelli murini di SMA e CMS correlati a ColQ.

Caratterizzazione delle giunzioni neuromuscolari nei topi mediante microscopia combinata confocale e super-risoluzione

Il protocollo mostra un metodo per esaminare la correlazione spaziale tra i terminali pre-sinaptici, i recettori post-sinaptici e le cellule di Schwann peri-sinaptiche nel muscolo gastrocnemio mediale del ratto utilizzando immunoistochimica fluorescente con diversi biomarcatori, vale a dire, neurofilamento 200, trasportatore vescicolare dell'acetilcolina, alfa-bungarotossina e S100.

Visualizzazione delle caratteristiche morfologiche della giunzione neuromuscolare nel muscolo gastrocnemio mediale di ratto

In questo studio, dimostriamo un raffinato protocollo di elettromiografia a fibra singola (SFEMG) per consentire la misurazione in vivo della trasmissione della giunzione neuromuscolare (NMJ) in modelli di roditori. Viene descritto un approccio graduale alla tecnica SFEMG per consentire la quantificazione della variabilità e del fallimento della trasmissione NMJ nel muscolo gastrocnemio di ratto.

Elettromiografia a fibra singola stimolata (SFEMG) per la valutazione della trasmissione della giunzione neuromuscolare in modelli di roditori

Qui, presentiamo un protocollo che combina l'elettroporazione e la denervazione in vivo del muscolo elevatore cranico auris longus (LAL). Questa procedura consente lo studio del potenziale ruolo delle proteine di derivazione muscolare nella rigenerazione della sinapsi neuromuscolare.

Elettroporazione combinata in vivo e reinnervazione a breve termine del muscolo scheletrico elevatore cranico Auris Longus

Scopri come ingegnerizzare giunzioni neuromuscolari umane 3D in vitro con stimolazione optogenetica e analisi video. Questo metodo permette di quantificare la connettività neuromuscolare e valutare l'impatto di neurotossine e siero di pazienti con miastenia gravis.

Ingegnerizzazione e caratterizzazione di un modello optogenetico della giunzione neuromuscolare umana

Esplora altri video