Isolamento, coltura e caratterizzazione di cellule primarie di Schwann, cheratinociti e fibroblasti dal prepuzio umano

La pelle contiene più tipi di cellule tra cui cheratinociti, fibroblasti e cellule nervose di Schwann. Questo protocollo consente l'isolamento di ciascuno di questi tipi di cellule per esperimenti in vitro. L'isolamento e la creazione di singole colture cellulari primarie da un singolo donatore consente solidi confronti ed esperimenti di co-coltura, mitigando al contempo gli effetti della variazione genetica.

Con questo protocollo, l'analisi delle singole cellule e delle loro interazioni consente l'analisi del ruolo delle cellule di Schwann nell'omeostasi cutanea e nella fisiopatologia. Queste distinte popolazioni cellulari possono essere utilizzate per studiare le cellule di Schwann, i fibroblasti o i cheratinociti singolarmente o in combinazione nella normale fisiologia della pelle, nella guarigione delle ferite o negli stati patologici della pelle. Jagadeeshaprasad M G, uno studioso post-dottorato nel mio laboratorio, mi assisterà nella dimostrazione della procedura.

Dopo aver acquisito il prepuzio neonatale seguendo procedure standard di cura, posizionare il prepuzio asportato in un tubo di micro centrifuga contenente da otto a 10 millilitri di mezzo basale DMEM ghiacciato e trasportare immediatamente il prepuzio al laboratorio di coltura cellulare per l'isolamento cellulare. Risciacquare il prepuzio due volte con 20-25 millilitri di Dulbecco Fosfato Tamponato Soluzione Salina o DPBS, contenente antibiotici e antimicotici. Quindi immergere la pelle lavata in 25-30 millilitri di mezzo basale DMEM ghiacciato in un piatto di coltura tissutale di 10 centimetri.

Dopo 15 minuti affettare il prepuzio aperto usando un bisturi per esporre il derma e il tessuto adiposo sottocutaneo. Utilizzare pinze, una lama di bisturi e forbici per rimuovere e scartare il tessuto adiposo sottocutaneo. Quindi tagliare il prepuzio pulito in tre o cinque pezzi più piccoli e incubare i pezzi di pelle in 16-20 millilitri di Dispace un mezzo DMEM in un tubo conico sterile.

Durante i primi 30 minuti di incubazione con Dispace si mescolano a intermittenza i pezzi di pelle nel tubo conico per inversione. Quindi posizionare il tubo conico a quattro gradi Celsius per 16-18 ore. Il giorno dopo rimuovere i pezzi di pelle e metterli su un piatto di coltura sterile asciutto e srotolare ogni pezzo di pelle in modo che lo strato esterno dell'epidermide stia toccando il piatto di coltura.

Partendo dal bordo del tessuto staccare l'epidermide dal derma usando due serie di pinze. Aggiungere i frammenti di epidermide separati a cinque millilitri di HBS in un piatto di coltura di 10 centimetri per incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi raccogliere la soluzione HBS in un tubo conico da 50 millilitri e aggiungere cinque millilitri di tampone di neutralizzazione della tripsina o T e B nel tubo conico.

Mettere da parte il tubo. Ai frammenti epidermici nel piatto di coltura aggiungere tre millilitri di soluzione di tripsina per incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Dopo l'incubazione agitare delicatamente i frammenti epidermici con una pinza fino a quando la soluzione di cheratinociti di tripsina diventa torbida.

Quindi aggiungere la soluzione di cheratinociti di tripsina al tubo HBS T e B. Dopo aver sciolto frammenti epidermici non digeriti con soluzione di TRIPSINA EDTA, aggiungere due millilitri di FBS al tubo HBS T e B contenente tripsina EDTA e centrifugare i due circa 870 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Quindi aspirare il surnatante e risospese il pellet cellulare in tre millilitri di cheratinociti mezzo di crescita completo, seguito dalla filtrazione della sospensione cellulare con un filtro sterile da 100 micrometri in un tubo conico sterile da 50 millilitri.

Una volta quantificati il numero di cellule e la vitalità cellulare, seminare le cellule nelle piastre di coltura per metterle in un incubatore a 37 gradi Celsius nel 5% di anidride carbonica. Dopo due giorni aspirare le cellule non aderenti e aggiornare i terreni di coltura cellulare a giorni alterni fino a quando i cheratinociti raggiungono il 50-80% di confluenza per esperimenti di passaggio o a valle. Preverminare i palloni T25 con poli-l-lisina o PLL, utilizzando cinque millilitri di DPBS e posizionare i palloni precoati a 37 gradi Celsius per tre ore.

Successivamente lavare la matrice di rivestimento PLL due volte con DPBS. Dopo aver lavato i pezzi isolati del derma con cinque millilitri di mezzo basale DMEM, tritare il derma in piccoli pezzi con le forbici. Digerire il derma tritato con cinque millilitri di collagenasi a 37 gradi Celsius per due ore e mezza, con una titolazione delicata usando una punta di pipetta ogni 30 minuti fino a quando il derma si dissocia completamente.

Una volta digerito, filtrare la sospensione cellulare con un filtro cellulare da 70 micrometri, seguito dalla diluizione della sospensione cellulare filtrata con cinque millilitri di mezzo DMEM completo per fermare l'attività enzimatica della collagenasi. Successivamente centrifugare la sospensione cellulare a 870 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente e risospesere il voto cellulare in due millilitri di mezzo completo DMEM per dividere le cellule. Dopo aver ripetuto il processo di centrificazione come descritto, aspirare il surnatante per utilizzare il pellet cellulare per isolare le cellule di Schwann o i fibroblasti.

Per isolare le cellule di Schwan, risospese il pellet cellulare in cinque millilitri di mezzo completo DMEM fresco e quantificare il numero di cellule e la vitalità prima di seminare cinque millilitri delle celle risospese in palloni T25 precodificati ad una densità di 4,0 volte 10 alle tre celle per millilitro. Incubare il pallone a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Dopo 16 ore confermare l'adesione cellulare al microscopio con ingrandimento 10X.

Quindi rimuovere le cellule non aderenza e lavare il pallone tre volte con cinque millilitri di DPBS. Successivamente incubare le cellule con cinque millilitri di 10 citosina arabinoside micromolare in un mezzo completo DMEM. Dopo 24 ore aspirare il mezzo contenente citosina arabinoside prima di risciacquare il matraccio come dimostrato in precedenza.

Riempire il pallone di coltura con cinque millilitri di cellule schwann completa il terreno di coltura per incubare 48 ore, mentre rinfrescare il mezzo a giorni alterni fino a quando le cellule di Schwann raggiungono l'80% di confluenza. Per isolare i fibroblasti, risospesso il pellet raccolto in cinque millilitri di fibroblasti mezzo completo. Coltivare le cellule in palloni di coltura T25 non codificati per 24 ore, come dimostrato per le cellule di Schwann.

Dopo aver aspirato le cellule non aderenza e lavato il pallone, incubare le cellule con cinque millilitri di fibroblasti freschi mezzo completo a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 48 ore. Poiché le cellule primarie isolate sono state coltivate nei rispettivi terreni di coltura cellulare, i cheratinociti primari hanno raggiunto l'85% di confluenza entro il settimo giorno e hanno mostrato una morfologia cellulare caratteristica con una forma di ciottoli. Le cellule di Schwann hanno raggiunto il 95% di confluenza entro il quinto giorno e sono apparse di forma bipolare o tripolare.

Le colture di fibroblasti hanno raggiunto il 95% di confluenza entro il quarto giorno e la maggior parte delle cellule ha mostrato una morfologia a forma di fuso. La colorazione di immunofluorescenza ha confermato l'espressione proteica specifica del tipo cellulare nelle colture cellulari. I cheratinociti erano positivi per le proteine K10 e K14.

Le immagini unite dell'immunofluorescenza della cheratina e della colorazione nucleare DAPI indicavano una purezza del 97,8% delle colture cellulari. Allo stesso modo, le cellule di Schwann erano positive per S100 e P75 NTR e avevano una purezza del 95,2% nella coltura. I fibroblasti hanno espresso positivamente la vimentina, ma non hanno espresso l'actina alfa della muscolatura liscia, un marcatore di miofibroblasti.

La purezza della cultura era di circa il 97,2% Per migliorare le prove di Shanse, è possibile utilizzare un piatto di poli-l-lisina pre-rivestito. E per mitigare ulteriormente la contaminazione fibrosa, la citosina arabinoside e l'agente antimicotico sono stati aggiunti dopo che le cellule avevano aggiunto per un breve periodo. Questa è una semplice procedura sperimentale economica per stabilire le tre cellule primarie, come le cellule shwann, i cheratinociti e i fibroblasti, da una singola pelle anteriore umana.

Questo protocollo è ideale per esperimenti in vitro che coinvolgono la comunicazione cellulare o crosstalk tra tipi di cellule.