Uno screening multiplexed ad alto rendimento per diabete di tipo 1, celiachia e COVID-19

In linea con l'urgente necessità di screening per il diabete di tipo 1, la celiachia e la malattia da coronavirus 2019, abbiamo sviluppato un test di elettrochemiluminescenza 6-Plex ad alta produttività per rilevare simultaneamente tutti e quattro gli autoanticorpi delle isole, gli autoanticorpi della transglutaminasi tissutale e gli anticorpi contro il dominio di legame del recettore della sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2.

Il nuovo test ECL 6-Plex è il primo test multiplex convalidato e ora applicato in studi clinici per lo screening della popolazione generale. Combina contemporaneamente sei test autoanticorpali adatti per lo screening del diabete di tipo 1, della celiachia e del COVID-19 in una vasta popolazione. Rispetto all'attuale test standard sugli autocorpi, questa tecnica può esaminare in modo più efficiente più autoanticorpi per più malattie autoimmuni contemporaneamente.

L'implicazione di questa tecnica renderà lo screening su larga scala più fattibile e specifico per la malattia, portando a una previsione precoce della malattia per la prevenzione e a una diagnosi più precisa per la terapia. Per iniziare, aggiungere quattro microlitri di GAD65 biotinilato, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 e proteina dell'antigene proinsulina in una provetta contenente 156 microlitri di 1% BSA e mescolare con 240 microlitri di corrispondenti linker coniugati con streptavidina, 1, 2, 3, 8, 9 e 10. Quindi, incubare la miscela per 30 minuti a temperatura ambiente.

Aliquot 160 microlitri di soluzione di arresto in ciascun tubo e incubare la miscela a temperatura ambiente per 30 minuti. Ora, prendi 400 microlitri della soluzione di miscela da ciascun tubo e combinali insieme. Aggiungere quattro microlitri di GAD65 marcato con rutenio, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 e antigene proinsulinico alla miscela.

Quindi, aggiungere 1,6 millilitri di soluzione di arresto e 3,2 millilitri di PBS. Mescolare accuratamente tutti i componenti. E ora, la soluzione dell'antigene è pronta per l'uso nel test.

Per una piastra PCR a 96 pozzetti, aliquote sette microlitri di siero per pozzetto e coprire la piastra con una pellicola sigillante. Quindi, preriscaldare i sieri a 56 gradi Celsius per 30 minuti su una macchina PCR e centrifugare brevemente la piastra a 100 volte G per un minuto. Aggiungere 63 microlitri di soluzione di antigene preparata per pozzetto, mescolare con il siero e coprire la piastra PCR con un foglio sigillante per evitare la luce.

Agitare la piastra su uno shaker ad una velocità di 450 giri / min per due ore a temperatura ambiente. E poi, incubare la piastra a quattro gradi Celsius per 18-24 ore. Prendi una piastra 6-Plex dal frigorifero a quattro gradi Celsius, consentendo alla piastra di arrivare a temperatura ambiente.

Quindi, aggiungere 150 microlitri di 3% Blocker A a ciascun pozzetto della piastra 6-Plex. Coprire la piastra con un foglio per evitare la luce. Rimettere la piastra in un frigorifero a quattro gradi Celsius e incubare durante la notte.

Al termine dell'incubazione, una volta tolta la piastra dal frigorifero, rimuovere tutto il tampone dalla piastra. Picchiettare la piastra sui tovaglioli di carta per asciugarla e lavarla tre volte con 150 microlitri di tampone di lavaggio per pozzetto ogni volta. Asciugare la piastra sul tovagliolo di carta e aliquote 30 microlitri di siero antigene incubato da ciascun pozzetto della piastra PCR di incubazione notturna in due pozzetti della piastra 6-Plex.

Coprire la piastra con un foglio, quindi mettere la piastra su uno shaker e agitare con una velocità di 450 giri / min a temperatura ambiente per un'ora. Scaricare la soluzione presente nella piastra 6-Plex e lavare la piastra tre volte con 150 microlitri di tampone di lavaggio al cloruro di sodio 0,4 M per pozzetto. Al termine del terzo lavaggio, asciugare la piastra contro il tovagliolo di carta e aggiungere 150 microlitri di tampone di lettura in ciascun pozzetto.

I livelli di sei autoanticorpi per GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A, TGA e COVID-19A dal test 6-Plex ECL erano ben correlati con i corrispondenti sei test ECL singoli e l'attuale test standard di radio-binding. I valori dell'indice per ciascun campione per tutti e sei gli anticorpi sono stati calcolati rispetto ai corrispondenti controlli positivi e negativi. È stato osservato un valore indice superiore al valore limite, che ha indicato un risultato positivo.

Gli autoanticorpi nel siero hanno violato l'antigene marcato con rutenio all'antigene biotinilato, formando un complesso con un linker specifico per costruire una piattaforma di multiplexing. Questa tattica rende lo screening su larga scala più fattibile e più efficiente nella popolazione generale per il diabete di tipo uno e le malattie concomitanti, portando alla previsione precoce e alla prevenzione delle malattie.