Uno screening multiplexed ad alto rendimento per diabete di tipo 1, celiachia e COVID-19
5 luglio 2022
In linea con l'urgente necessità di screening per il diabete di tipo 1, la celiachia e la malattia da coronavirus 2019, abbiamo sviluppato un test di elettrochemiluminescenza 6-Plex ad alta produttività per rilevare simultaneamente tutti e quattro gli autoanticorpi delle isole, gli autoanticorpi della transglutaminasi tissutale e gli anticorpi contro il dominio di legame del recettore della sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2.
Il nuovo test ECL 6-Plex è il primo test multiplex convalidato e ora applicato in studi clinici per lo screening della popolazione generale. Combina contemporaneamente sei test autoanticorpali adatti per lo screening del diabete di tipo 1, della celiachia e del COVID-19 in una vasta popolazione. Rispetto all'attuale test standard sugli autocorpi, questa tecnica può esaminare in modo più efficiente più autoanticorpi per più malattie autoimmuni contemporaneamente.
L'implicazione di questa tecnica renderà lo screening su larga scala più fattibile e specifico per la malattia, portando a una previsione precoce della malattia per la prevenzione e a una diagnosi più precisa per la terapia. Per iniziare, aggiungere quattro microlitri di GAD65 biotinilato, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 e proteina dell'antigene proinsulina in una provetta contenente 156 microlitri di 1% BSA e mescolare con 240 microlitri di corrispondenti linker coniugati con streptavidina, 1, 2, 3, 8, 9 e 10. Quindi, incubare la miscela per 30 minuti a temperatura ambiente.
Aliquot 160 microlitri di soluzione di arresto in ciascun tubo e incubare la miscela a temperatura ambiente per 30 minuti. Ora, prendi 400 microlitri della soluzione di miscela da ciascun tubo e combinali insieme. Aggiungere quattro microlitri di GAD65 marcato con rutenio, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 e antigene proinsulinico alla miscela.
Quindi, aggiungere 1,6 millilitri di soluzione di arresto e 3,2 millilitri di PBS. Mescolare accuratamente tutti i componenti. E ora, la soluzione dell'antigene è pronta per l'uso nel test.
Per una piastra PCR a 96 pozzetti, aliquote sette microlitri di siero per pozzetto e coprire la piastra con una pellicola sigillante. Quindi, preriscaldare i sieri a 56 gradi Celsius per 30 minuti su una macchina PCR e centrifugare brevemente la piastra a 100 volte G per un minuto. Aggiungere 63 microlitri di soluzione di antigene preparata per pozzetto, mescolare con il siero e coprire la piastra PCR con un foglio sigillante per evitare la luce.
Agitare la piastra su uno shaker ad una velocità di 450 giri / min per due ore a temperatura ambiente. E poi, incubare la piastra a quattro gradi Celsius per 18-24 ore. Prendi una piastra 6-Plex dal frigorifero a quattro gradi Celsius, consentendo alla piastra di arrivare a temperatura ambiente.
Quindi, aggiungere 150 microlitri di 3% Blocker A a ciascun pozzetto della piastra 6-Plex. Coprire la piastra con un foglio per evitare la luce. Rimettere la piastra in un frigorifero a quattro gradi Celsius e incubare durante la notte.
Al termine dell'incubazione, una volta tolta la piastra dal frigorifero, rimuovere tutto il tampone dalla piastra. Picchiettare la piastra sui tovaglioli di carta per asciugarla e lavarla tre volte con 150 microlitri di tampone di lavaggio per pozzetto ogni volta. Asciugare la piastra sul tovagliolo di carta e aliquote 30 microlitri di siero antigene incubato da ciascun pozzetto della piastra PCR di incubazione notturna in due pozzetti della piastra 6-Plex.
Coprire la piastra con un foglio, quindi mettere la piastra su uno shaker e agitare con una velocità di 450 giri / min a temperatura ambiente per un'ora. Scaricare la soluzione presente nella piastra 6-Plex e lavare la piastra tre volte con 150 microlitri di tampone di lavaggio al cloruro di sodio 0,4 M per pozzetto. Al termine del terzo lavaggio, asciugare la piastra contro il tovagliolo di carta e aggiungere 150 microlitri di tampone di lettura in ciascun pozzetto.
I livelli di sei autoanticorpi per GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A, TGA e COVID-19A dal test 6-Plex ECL erano ben correlati con i corrispondenti sei test ECL singoli e l'attuale test standard di radio-binding. I valori dell'indice per ciascun campione per tutti e sei gli anticorpi sono stati calcolati rispetto ai corrispondenti controlli positivi e negativi. È stato osservato un valore indice superiore al valore limite, che ha indicato un risultato positivo.
Gli autoanticorpi nel siero hanno violato l'antigene marcato con rutenio all'antigene biotinilato, formando un complesso con un linker specifico per costruire una piattaforma di multiplexing. Questa tattica rende lo screening su larga scala più fattibile e più efficiente nella popolazione generale per il diabete di tipo uno e le malattie concomitanti, portando alla previsione precoce e alla prevenzione delle malattie.
Panoramica
Questo studio presenta un nuovo saggio elettrochemiluminescente 6-Plex progettato per la rilevazione simultanea di autoanticorpi associati al diabete di tipo 1, alla malattia celiaca e al COVID-19. Il saggio ha lo scopo di migliorare l'efficienza dello screening su larga scala per queste malattie autoimmuni.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Autoimmunità
- Diagnostica clinica
- Saggi di elettrochemiluminescenza
Sfondo
- Il diabete di tipo 1 e la malattia celiaca sono disturbi autoimmuni che richiedono un rilevamento precoce.
- La COVID-19 ha introdotto nuove sfide nel rilevamento delle malattie autoimmuni.
- I metodi di rilevamento attuali sono spesso inefficienti e richiedono molto tempo.
- I saggi multiplex possono migliorare le capacità di rilevamento analizzando contemporaneamente più anticorpi.
Scopo dello studio
- Sviluppare un saggio ad alto rendimento per il rilevamento simultaneo di multipli autoanticorpi.
- Convalidare il saggio per l'uso in studi clinici.
- Facilitare la predizione precoce e la prevenzione della malattia.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di soluzioni di antigene mediante proteine biotinilate e marcate con rutenio.
- Incubazione dei campioni di siero con le soluzioni di antigene preparate.
- Utilizzo di una piastra PCR da 96 pozzetti per l'elaborazione dei campioni.
- Correlazione dei risultati con saggi standard per convalidare l'approccio multiplex.
Risultati principali
- L'analisi ECL 6-Plex ha dimostrato una forte correlazione con le analisi tradizionali singole.
- I valori dell'indice hanno indicato risultati positivi per autoanticorpi nei campioni di siero.
- L'analisi consente uno screening efficiente di molteplici malattie autoimmuni.
- I risultati supportano la fattibilità dello screening su larga scala della popolazione.
Conclusioni
- Il saggio ECL 6-Plex è uno strumento promettente per la diagnosi precoce delle malattie autoimmuni.
- Questo metodo migliora l'efficienza dei processi di screening.
- Presenta un potenziale per il miglioramento degli esiti nei pazienti grazie all'intervento precoce.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Esecutiva
Il saggio ECL 6-Plex validato consente il rilevamento multiplo ad alto rendimento di autoanticorpi per il diabete di tipo 1, la malattia celiaca e il COVID-19, soddisfacendo la necessità di uno screening di popolazione efficiente e specifico per ciascuna patologia. Questa piattaforma aumenta la sicurezza predittiva nel primo punto di svolta della fase che va dalla scoperta alla diagnosi, supportando decisioni di portafoglio basate sul rischio nella ricerca sulle malattie autoimmuni e infettive. L'adozione di questo strumento come test primario di screening dimostra un impatto a livello aziendale sui flussi di lavoro traslazionali e preclinici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Consente l'analisi simultanea di multipli bersagli autoimmuni e virali in un singolo formato di saggio.
- Migliora la riduzione del rischio biologico distinguendo i profili di autoanticorpi specifici per la malattia.
- Supporta una previsione affidabile per strategie di diagnosi precoce e prevenzione della malattia.
- Facilita la selezione del portafoglio fornendo letture quantitative multiplex per la validazione dei bersagli.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara sistemi multiplex validati per analisi a valle e flussi di lavoro relativi a biomarcatori.
- Standardizza le condizioni del saggio per garantire riproducibilità e confrontabilità quantitativa tra i campioni.
- Consente analisi scalabili ad alto rendimento con richieste minime di volume di siero.
- Permette una valutazione affidabile degli effetti di composti o interventi su più biomarcatori rilevanti per la malattia.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a strategie di biomarcatori pertinenti alle malattie per garantire continuità traslazionale dalla scoperta alla validazione clinica.
- Fornisce output quantitativi che informano decisioni di avanzamento corrette per il rischio nei percorsi preclinici.
- Migliora la riduzione del rischio predittiva correlando profili multiplex di autoanticorpi con l'insorgenza e la progressione della malattia.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il saggio ECL 6-Plex si integra all'interfaccia tra la fase iniziale della scoperta, l'identificazione dei composti promettenti e la ricerca traslazionale, consentendo un passaggio fluido dalla verifica delle ipotesi alla validazione preclinica.
- Biologia della scoperta: Supporta test di ipotesi robusti e la chiarificazione dei percorsi mediante la rilevazione multiplex di autoanticorpi.
- Screening: Fornisce risultati quantitativi e riproducibili, adatti per ambienti di screening ad alto rendimento.
- Analisi: Fornisce valori indice e punti decisionali basati su soglie per il confronto tra diverse condizioni e per l'analisi statistica.
- Ricerca traslazionale: Collega la scoperta alla validazione clinica allineando il rilevamento di biomarcatori con endpoint rilevanti per la malattia.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile e scalabile per future iniziative di screening multiplex.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella ricerca precoce sulle malattie autoimmuni e infettive.
- Valore operativo: Ottimizza i flussi di lavoro attraverso standardizzazione, riproducibilità e scalabilità ad alto rendimento.
- Valore strategico: Permette decisioni informate di prosecuzione o interruzione e una gestione efficiente del portafoglio grazie a dati multiplex e immediatamente utilizzabili.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e l'avanzamento di candidati basati su evidenze robuste e multiplex di biomarcatori, adeguati al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nello sviluppo di saggi immunoanalitici multiplex e nella rilevazione mediante elettrochemiluminescenza.
- Richiede l'accesso a strumentazione specializzata per la lettura ECL e la gestione di piastre ad alto rendimento.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per i protocolli analitici e le procedure di analisi dei dati.
- Potrebbe richiedere adattamenti per l'utilizzo con diversi tipi di campioni o modelli di malattia, in base all'evoluzione delle esigenze del portafoglio.
- I limiti pratici includono la necessità di una rigorosa validazione rispetto ai saggi consolidati mono-plex e ai saggi di legame radioattivo.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:06
Create Linker‐Coupled Antigen Solution
2:36
Preparation of Antigen Labeled Serum and the 6‐Plex Plate
3:54
Serum/Antigen Incubates Transfer into the 6‐Plex Plate
4:42
Washing the 6‐Plex Plate and Reading Buffer Addition
5:11
Results: Comparison of Antibody Levels Study Between the Single and the 6‐Plex ECL Assay
5:59
Conclusion
