Name: La microscopia a espansione per la conservazione delle etichette (LR-ExM) consente limaging a super-risoluzione e letichettatura ad alta efficienza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Scopri la microscopia a espansione con conservazione delle etichette (LR-ExM) per l'imaging a super-risoluzione cellulare utilizzando ancore trifunzionali. Questo metodo migliora l'efficienza di etichettatura e il segnale fluorescente.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health degli Stati Uniti (R00 GM126136 a X.S.), dalla National Science Foundation degli Stati Uniti (DMS1763272 a S.P.) e dalla Simons Foundation (da 594598 a S.P.).

1. Coltura cellulare
<ol><li>Utilizzare cellule U2OS coltivate nel mezzo 5A di McCoy integrato con FBS al 10% a 37 °C in CO 2 al 5%.</li>
	<li>Celle di coltura su un vetro di copertura a camera rimovibile a 16 pozzetti (area di coltura 0,4 cm2) per una facile manipolazione.</li>
</ol>2. Fissazione e permeabilizzazione
NOTA: Le condizioni di fissazione e permeabilizzazione dipendono dai protocolli di immunocolorazione ottimizzati. Di seguito è riportato un protocollo di fissazione e permeabilizzazione per microtubuli co-immunostain e pozzi rivestiti di clatrina (CCP).
<ol><li>Una volta che la conta cellulare raggiunge ~0,04 x 10 6, fissare le cellule con 100 μL di paraformaldeide (PFA) al 3,2% in tampone PEM (100 mM PIPES, 1 mM EGTA e 1 mM MgCl2, pH6,9) per 10 minuti a temperatura ambiente (Tabella 1). NOTA: La fissazione mediante PFA viene eseguita in un cappuccio di sicurezza certificato.</li>
	<li>Lavare le celle tre volte per 5 minuti ciascuna con 200 μL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).</li>
	<li>Permeabilizzare le cellule con 100 μL di tampone di permeabilizzazione a temperatura ambiente per 15 minuti (Tabella 1). NOTA: Procedere con l'etichettatura il prima possibile per evitare la degradazione della proteina bersaglio, dell'RNA o del DNA e per ottenere un risultato ottimale. Se necessario, tuttavia, i campioni fissi possono essere conservati per un tempo prolungato (fino a un mese) in un tampone PBS a 4 °C. Sostituire qualsiasi PBS evaporato e proteggere il campione dal fotosbiancamento.</li>
</ol>3. Streptavidina endogena e blocco della biotina
<ol><li>Incubare le cellule con la soluzione di streptavidina diluita in un tampone bloccante cellulare (100 μL) per 15 minuti a temperatura ambiente (Tabella 1).</li>
	<li>Risciacquare brevemente con 200 μL di tampone bloccante cellulare.</li>
	<li>Incubare le cellule con 100 μL di soluzione di biotina diluite in un tampone bloccante cellulare per 15 minuti a temperatura ambiente. NOTA: quando si utilizza un approccio di tagging autoetichettante, ad esempio utilizzando tag SNAP o CLIP, ignorare il passaggio 4 e procedere al passaggio 5.1: approccio di tagging autoetichettante.</li>
</ol>4. Colorazione degli anticorpi primari
<ol><li>Incubare cellule con anticorpo anti-α-tubulina di ratto (diluizione 1:500) e anticorpo anti-lattrina a catena pesante di coniglio (diluizione 1:100) in 100 μL di tampone bloccante cellulare per 16 h a 4 °C o 1 h a temperatura ambiente. Raddoppiare il tempo di incubazione dei campioni di tessuto.</li>
	<li>Lavare i campioni quattro volte con 200 μL di PBS per 5 minuti ciascuno.</li>
</ol>5. Colorazione anticorpale secondaria specifica LR-ExM
<ol><li>Coniugare gli anticorpi IgG con i linker trifunzionali come N-idrossisuccinimide (NHS) - metacrilammide (MA) -Biotina o NHS-MA-Digoxigenina (Dig) (Figura 1B). La sintesi di ancore trifunzionali e la coniugazione degli anticorpi secondari sono state precedentemente introdotte in Shi et al.1. Approccio di tagging auto-etichettante: coniugare gli anticorpi IgG con i linker trifunzionali, come MA- benzilguanina (BG)-biotina o MA- benzilcitosina (BC)-Dig (Figura 1B). La sintesi di ancore trifunzionali e una coniugazione degli anticorpi secondari sono state precedentemente introdotte in Shi et al.1.</li>
	<li>Incubare le cellule con gli anticorpi secondari anti-coniglio-Dig-MA (diluizione 1:100) e anti-ratto-biotina-MA dell'asino (diluizione 1:100) in 100 μL di tampone bloccante cellulare per 1 ora a temperatura ambiente. Raddoppia questo tempo di incubazione per i campioni di tessuto.</li>
	<li>Lavare i campioni quattro volte in 200 μL di PBS per 5 minuti ciascuno.</li>
</ol>6. Ancoraggio aggiuntivo
<ol><li>Incubare le cellule con lo 0,25% di glutaraldeide (GA) in PBS (100 μL) per 15 minuti a temperatura ambiente per ancorare le proteine sull'idrogel. In alternativa, utilizzare 25 mM di acido metacrilico N-idrossisuccinimide estere (MA-NHS) per l'ancoraggio. È incoraggiata l'incubazione di un'ora a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare i campioni tre volte in PBS per 5 minuti ciascuno.</li>
</ol>7. Gelificazione
NOTA: La velocità di espansione è determinata dal tempo di diffusione del sale e dell'acqua fuori o nel gel; Pertanto, la colata di gel sottili accelera il tempo di espansione.
<ol><li>Rimuovere la struttura superiore della piastra di gel a 16 pozzetti. Aggiungere 40 μL di soluzione monomerica a ciascun pozzetto per condizionare le cellule sul ghiaccio. Incubare su ghiaccio per 5 min.<ol><li>Per preparare una soluzione monomerica, vedere Tabella 2.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparare la soluzione di gelificazione su ghiaccio. Aggiungere acqua bidistillata e un acceleratore al 10% di N,N,N′,N′ Tetrametiletilendiammina (TEMED) alla soluzione monomerica (10% TEMED: soluzione monomerica = 1:47); non aggiungere ancora l'iniziatore (Tabella 3).</li>
	<li>Per una camera di coltura cellulare con un'area di 0,4 cm2, utilizzare un volume di soluzione di gelificazione di circa 40 μL. Preparare 45 μL di soluzione di gelificazione per ciascun pozzetto.</li>
	<li>Aggiungere il 10% di persolfato di ammonio (APS) alla soluzione di gelificazione, incubare su ghiaccio e pipettare immediatamente 40 μL di soluzione di gelificazione in ciascuna guarnizione siliconica bene sul ghiaccio. Incubare su ghiaccio per 3 minuti (10% APS:10% TEMED:soluzione monomerica = 1:1:47).</li>
	<li>Proteggere il campione dalla luce e spostare il vetro di copertura nella capsula di Petri da 10 cm in un incubatore a 37 °C per 1,5 ore per la gelificazione. Per mantenere l'umidità del gel durante l'incubazione a 37 °C, coprire la capsula di Petri con il coperchio e mettere qualche goccia d'acqua nella capsula di Petri.</li>
</ol>8. Digestione
<ol><li>Dopo la gelificazione, rimuovere il vetro per separare il gel e trasferire il gel in 6 pozzetti. Digerire le cellule incorporate con 2 ml di tampone digestivo (Tabella 1) durante la notte a temperatura ambiente o 4 ore a 37 °C. Utilizzare almeno 10 volte il volume in eccesso di tampone di digestione.</li>
	<li>Lavare i gel con un volume d'acqua in eccesso di almeno 10 volte rispetto al volume finale del gel. Ripetere la fase di lavaggio quattro volte per 20-30 minuti ogni volta. Il gel si espande di circa due volte in ogni dimensione. NOTA: I campioni di gel possono essere conservati fino a 1 mese in un tampone PBS a 4 °C. Sostituire l'acqua evaporata per evitare l'essiccazione e proteggere il campione dalla luce durante lo stoccaggio. Per evitare il degrado degli ancoraggi trifunzionali, i campioni devono essere colorati il prima possibile dopo la digestione e il lavaggio.</li>
</ol>9. Colorazione a fluorescenza post-digestione
<ol><li>Incubare gel in 2 mL di volume di tampone colorante streptavidina (STV)/digoxigenina (DIG) con colorante STV da 2 a 5 μM e/o colorante anti-DIG per 24 ore a temperatura ambiente. Conservare i campioni al buio.</li>
</ol>10. Espansione
<ol><li>Lavare ed espandere il gel quattro volte con acqua eccessiva (2-3 ml) per 30 minuti a 1 ora ogni volta.</li>
	<li>Per una più facile visualizzazione delle cellule al microscopio fluorescente, colorare le cellule con DAPI durante il terzo dei cinque lavaggi. Diluire la concentrazione di DAPI (5 mg/ml, conservata a 4 °C) in 1:5.000 diluizioni in acqua di lavaggio. Incubare il gel con una soluzione DAPI-acqua (2 ml) per 30 minuti a 1 ora.</li>
	<li>Lavare altre due volte con 3 ml di acqua.</li>
	<li>Espandi i gel in qualsiasi piatto piatto abbastanza grande da contenere i campioni. I gel espansi che vengono preparati su 0,4 cm2 area coverglass si adattano bene in una piastra di vetro inferiore a 6 pozzetti. NOTA: I campioni colorati post-espansione possono essere conservati fino a 4 mesi in un tampone PBS a 4 ° C. Aggiungere acqua sufficiente per evitare l'essiccazione e proteggere il campione dal fotosbiancamento. Ripetere la fase di espansione e colorazione DAPI prima dell'imaging. Per evitare qualsiasi rischio di degradazione dei fluorofori, i campioni devono essere ripresi il prima possibile.</li>
</ol>11. Imaging
<ol><li>Rivestire la camera di imaging con fondo in vetro a 6 pozzetti con poli-L-lisina allo 0,01% (3 ml ciascuno) per immobilizzare i campioni di gel.</li>
	<li>Trasferire i campioni di gel nella camera di imaging rivestita.</li>
	<li>Immagina i campioni con qualsiasi oscilloscopio a fluorescenza desiderato.</li>
</ol>

<ol><li>Shi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-retention+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Label-retention expansion microscopy.</a> The Journal of Cell Biology. 220 (9), 202105067(2021).</li>
<li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543-548 (2015).</li>
<li>Tillberg, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-retention+expansion+microscopy+of+cells+and+tissues+labeled+using+standard+fluorescent+proteins+and+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).</li>
<li>Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+optimization+in+X10+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy.</a> Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+expansion+microscopy+with+structured+illumination+microscopy+for+analyzing+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Combined expansion microscopy with structured illumination microscopy for analyzing protein complexes.</a> Nature Protocols. 13 (8), 1869-1895 (2018).</li>
<li>Chozinski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy+with+conventional+antibodies+and+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).</li>
<li>Ku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+and+scalable+super+resolution+imaging+of+three-dimensional+protein+localization+in+size+adjustable+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiplexed and scalable super resolution imaging of three-dimensional protein localization in size adjustable tissues.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).</li>
<li>Gautier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+engineered+protein+tag+for+multiprotein+labeling+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells.</a> Chemistry & Biology. 15 (2), 128-136 (2008).</li>
<li>Keppler, A., Pick, H., Arrivoli, C., Vogel, H., Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+of+fusion+proteins+with+synthetic+fluorophores+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Labeling of fusion proteins with synthetic fluorophores in live cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (27), 9955-9959 (2004).</li>
<li>Thevathasan, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+pores+as+versatile+reference+standards+for+quantitative+super+resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative super resolution microscopy.</a> Nature Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).</li>
<li>Truckenbrodt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X10+expansion+microscopy+enables+25-nm+resolution+on+conventional+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes.</a> EMBO Reports. 19 (19), 45836(2018).</li>
<li>Damstra, H. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+cellular+and+tissue+ultrastructure+using+Ten-fold+Robust+Expansion+Microscopy+%28TREx%29%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Visualizing cellular and tissue ultrastructure using Ten-fold Robust Expansion Microscopy (TREx).</a> eLife. 11, 73775(2021).</li>
<li>M'Saad, O., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+microscopy+of+proteins+in+their+ultrastructural+context%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Light microscopy of proteins in their ultrastructural context.</a> Nature Communications. 11 (1), 3850(2020).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

L'innovazione chiave di LR-ExM è l'utilizzo di ancoraggi trifunzionali per etichettare efficacemente le proteine bersaglio e migliorare la qualità dell'immagine. Questo metodo è limitato da ancore trifunzionali, che non sono così facilmente disponibili per i ricercatori. Tuttavia, le ancore trifunzionali possono essere condivise con altri ricercatori su richiesta e prodotti simili come le sonde ExM di Chrometa sono ora disponibili in commercio.
In questo protocollo, è stata eseguita un'incubaz...

La microscopia ad espansione (ExM) è stata utilizzata dai ricercatori sin da quando è stata introdotta per la prima volta come approccio conveniente per ottenere immagini a super risoluzione con microscopi convenzionali, come l'epifluorescenza e i microscopi confocali 1,2,3,4,5,6,7 . Utilizzando ExM, è possibile raggiungere una risoluzione laterale di ~ 70 nm anche con normali microscopi confocali. Quando ExM è combinato con l'imaging a super-risoluzione, la risoluzione viene ulteriormente migliorata. Ad esempio, si può ottenere una risoluzione di circa 30 nm con la microscopia a illuminazione strutturata (SIM) e una risoluzione di circa 4 nm con la microscopia a ricostruzione ottica stocastica (STORM)1,5.
Tuttavia, la bassa efficienza dell'etichettatura è un problema critico con i metodi ExM standard. La perdita di fluorescenza può variare in base al tipo di gruppi fluorescenti e al tempo di digestione. In media, tuttavia, è stato riportato che oltre il 50% dei fluorofori viene perso dopo la polimerizzazione e le fasi di digestione delle proteine di ExM, il che è dannoso per la qualità dell'imaging 3,4.
Pertanto, è stata sviluppata la microscopia ad espansione per la conservazione delle etichette (LR-ExM), che può conservare in modo efficiente le etichette e ridurre la perdita di segnale1. L'innovazione chiave di LR-ExM è l'uso di una serie di ancoraggi trifunzionali invece di utilizzare semplicemente coloranti fluorescenti - come nella procedura standard ExM - per colorare le proteine di interesse. Questi linker trifunzionali sono costituiti da tre parti: (1) il connettore (ad esempio, N-idrossisuccinimide (NHS)) per connettersi all'anticorpo, (2) l'ancora (ad esempio, metacrilammide (MA)) per ancorare le proteine al polimero e (3) il reporter (ad esempio, biotina o digossigenina (DIG)) per coniugare a un colorante organico. Le ancore trifunzionali sopravvivono alle fasi di polimerizzazione e digestione delle proteine, e quindi prevengono la perdita di fluorofori.
Inoltre, questo metodo ha un grande potenziale poiché è compatibile con tag enzimatici auto-etichettanti come SNAP o CLIP. Gli approcci di tag enzimatici hanno alcuni vantaggi rispetto all'approccio immunocolorante per quanto riguarda l'elevata specificità e l'efficienza di etichettatura 8,9,10.
In questo manoscritto viene dimostrata una procedura dettagliata di LR-ExM. LR-ExM è un metodo altamente efficace e flessibile per ottenere un'elevata risoluzione spaziale con una maggiore efficienza di etichettatura.

<table><tbody><tr><td>Acrilammide&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A9099&nbsp;</td><td>ExM Gel</td></tr><tr><td>AffiniPure Donkey Anti-coniglio IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>H+L, 711&ndash; 005-152</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>H+L, 712&ndash; 005-153</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-Streptavidina</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>016-540-084</td><td>Sonde fluorescenti&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Streptavidina</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>016-580-084</td><td>Sonde fluorescenti&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Streptavidina</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>016-600-084</td><td>Sonde fluorescenti&nbsp;</td></tr><tr><td>Persolfato di ammonio&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A3678&nbsp;</td><td>ExM Gel</td></tr><tr><td>anti-H3K4me3</td><td>Abcam</td><td>ab8580</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>anti-H3K9me3</td><td>Abcam</td><td>ab176916</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>DAPI dilacetato</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>D3571</td><td>Sonde fluorescenti&nbsp;</td></tr><tr><td>DyLight 488 Marcato Anti-Digossigenina/Digossina (DIG)</td><td>Vector Laboratories</td><td>DI-7488</td><td>Sonde fluorescenti&nbsp;</td></tr><tr><td>DyLight 594 Marcato Anti-Digossigenina/Digossina (DIG)</td><td>Vector Laboratories</td><td>DI-7594</td><td>Sonde fluorescenti&nbsp;</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>EMD Millipore Corp.</td><td>324626-25GM</td><td>Tampone di fissazione</td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>EDTA</td><td>Tampone di digestione</td></tr><tr><td>Glutaraldeide 10% Microscopia elettronica di grado EM</td><td>Scienze</td><td>50-262-13</td><td>Ancoraggio</td></tr><tr><td>Grace Bio-Labs CultureWell vetro di copertura a camera rimovibile</td><td>Grace Bio-Labs&nbsp;</td><td>GBL112358-8EA</td><td>Camera di coltura cellulare</td></tr><tr><td>Strumento di rimozione Grace Bio-Labs CultureWell</td><td>Grace Bio-Labs&nbsp;</td><td>GBL103259</td><td>Strumento di rimozione</td></tr><tr><td>Guanidina HCl&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>G3272&nbsp;</td><td>Tampone per la digestione</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Sigma</td><td>M8266-1KG</td><td>Tampone di fissaggio</td></tr><tr><td>McCoy's 5a</td><td>ATCC</td><td>30&ndash; 2007</td><td>Terreno di coltura Celll</td></tr><tr><td>Estere di acido metacrilico N-idrossisuccinimide, 98% (MA-NHS)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>730300-1G</td><td>Ancoraggio</td></tr><tr><td>monoclonale di topo anti-Nup153 Anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab24700</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>N,N&prime; Metilenebisacrilammide&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>M7279&nbsp;</td><td>ExM Gel</td></tr><tr><td>N,N,N&primo;,N&primo; Tetrametiletilendiammina&nbsp; (TEMED)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>T7024&nbsp;</td><td>ExM Gel</td></tr><tr><td>16% Paraformaldeide Soluzioni acquose Microscopia</td><td>elettronica</td><td>Scienze 50-980-487</td><td>Tampone di fissazione</td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma</td><td>P6757-25G</td><td>Tampone di fissazione</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P8920-100ML</td><td>Rivestimento della camera</td></tr><tr><td>Proteinasi K&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4850-5ML</td><td>Tampone di digestione</td></tr><tr><td>Coniglio anticorpo anti-clatrina a catena pesante</td><td>Abcam</td><td>ab21679</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>ratto anti&ndash; &alfa;-tubulina anticorpo, tirosinato, clone YL1/2</td><td>Millipore Sigma</td><td>MAB1864-I</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>Sodio Acrilato&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>408220</td><td>Kit</td></tr><tr><td>di blocco della streptavidina / biotina</td> ExM <td>Gel Vector Laboratories</td><td>SP-2002</td><td>Tampone di blocco</td></tr><tr><td>Tris-HCl&nbsp;</td><td>Tecnologie per la vita&nbsp;</td><td>AM9855&nbsp;</td><td>Tampone per la digestione</td></tr><tr><td>U2OS</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td>Linea cellulare</td></tr><tr><td>Piastre con fondo in vetro a 6 pozzetti</td> Piastra <td>di imaging</td> <td>Cellvis</td><td>P06-1.5H-N</td></tr></tbody></table>

la microscopia a espansione per la conservazione delle etichette (lr-exm) consente l'imaging a super-risoluzione e l'etichettatura ad alta efficienza

Label-Retention Expansion Microscopy (LR-ExM) Enables Super-Resolution Imaging and High-Efficiency Labeling

La microscopia ad espansione (ExM) è una tecnica di preparazione del campione che può essere combinata con la maggior parte dei metodi di microscopia ottica per aumentare la risoluzione. Dopo aver incorporato cellule o tessuti in idrogel gonfiabile, i campioni possono essere fisicamente espansi da tre a sedici volte (dimensione lineare) rispetto alla dimensione originale. Pertanto, la risoluzione effettiva di qualsiasi microscopio è aumentata dal fattore di espansione. Una delle principali limitazioni dell'ExM precedentemente introdotto è la fluorescenza ridotta dopo la polimerizzazione e la procedura di digestione. Per superare questa limitazione, è stata sviluppata la microscopia a espansione per la conservazione delle etichette (LR-ExM), che previene la perdita di segnale e migliora notevolmente l'efficienza dell'etichettatura utilizzando una serie di nuovi ancoraggi trifunzionali. Questa tecnica consente di ottenere una risoluzione più elevata quando si studiano strutture cellulari o subcellulari su scala nanometrica con una minima perdita di segnale fluorescente. LR-ExM può essere utilizzato non solo per la marcatura con immunofluorescenza, ma anche con tag proteici auto-etichettanti, come i tag SNAP e CLIP, ottenendo così una maggiore efficienza di etichettatura. Questo lavoro presenta la procedura e la risoluzione dei problemi per questo approccio basato sull'immunocolorazione, nonché la discussione degli approcci di etichettatura automatica di LR-ExM come alternativa.

I pozzi rivestiti di clatrina (CCP) sono immunocolorati utilizzando ancore trifunzionali (Figura 1B) e LR-ExM viene eseguito come descritto nella Figura 1A. LR-ExM (Figura 2C,E) mostra un'intensità di fluorescenza molto più elevata rispetto alla microscopia ad espansione di ritenzione proteica (proExM, Figura 2A) o biotina-ExM (Figura 2B); il segnale per LR...

Viene dimostrato un protocollo di microscopia ad espansione di ritenzione dell'etichetta (LR-ExM). LR-ExM utilizza un nuovo set di ancoraggi trifunzionali, che fornisce una migliore efficienza di etichettatura rispetto alle microscopie di espansione introdotte in precedenza.

La microscopia a espansione per la conservazione delle etichette (LR-ExM) consente l'imaging a super-risoluzione e l'etichettatura ad alta efficienza

Expansion microscopy (ExM) is a sample preparation technique that can be combined with most light microscopy methods to increase the resolution. After ...

Uno dei principali limiti della microscopia ad espansione è che la fluorescenza rallenta dopo la polimerizzazione e la digestione. La microscopia ad espansione di ritenzione delle etichette, che chiamiamo LR-ExM, utilizza ancore trifunzionali, che sono in ordine alla polimerizzazione e alla digestione. Dopo aver utilizzato l'ancoraggio trifunzione, introduciamo la fluorescenza dopo la fase di espansione.Quindi manteniamo un buon rapporto segnale/rumore pur avendo un'alta risoluzione. La microscopia a espansione per la ritenzione delle etichette può essere combinata con qualsiasi altra microscopia a espansione introdotta in precedenza e anche con le microscopie fluorescenti. È molto robusto nel metodo versatile.E per l'imaging ad alta regolazione, è davvero importante avere un segnale migliorato. Per iniziare, cellule di coltura su un vetro di copertura a camera rimovibile da 16 pozzetti con mezzo completo a 37 gradi Celsius e anidride carbonica al 5%. Una volta che il conteggio delle cellule raggiunge circa 40.000, fissare le cellule con 100 microlitri di 3,2% PFA in tampone PEM per 10 minuti a temperatura ambiente.Quindi permeabilizzare le cellule con i 100 microlitri di tampone di permeablizzazione a temperatura ambiente per 15 minuti. Incubare le cellule con la soluzione di streptavidina diluita in un tampone bloccante cellulare per 15 minuti a temperatura ambiente, quindi risciacquare brevemente con 200 microlitri di tampone bloccante cellulare. Successivamente, incubare le cellule con 100 microlitri di soluzione di biotina diluita in un tampone di blocco cellulare per 15 minuti a temperatura ambiente.Successivamente, incubare le cellule con 100 microlitri di soluzione anticorpale primaria contenente anticorpo anti alfa tubulina di ratto e anticorpo a catena pesante anti clatrina di coniglio per 16 ore a quattro gradi Celsius o un'ora a temperatura ambiente. Quindi incubare le cellule con 100 microlitri di soluzione anticorpale secondaria contenente ancore trifunzionali, asini anti coniglio scavare MA e asino anti ratto biotina MA per un'ora a temperatura ambiente. Incubare le cellule con 100 microlitri di glutaraldeide allo 0,25% per 15 minuti a temperatura ambiente per ancorare le proteine all'idrogel.Rimuovere la struttura superiore della piastra a 16 pozzetti con la lametta o qualsiasi strumento di rimozione preferito e mantenere il vetro del coperchio inferiore. Posizionare il vetro di copertura in una capsula di Petri e metterli sul ghiaccio. Aggiungere 45 microlitri di una soluzione monomerica a ciascun pozzetto per condizionare le cellule.Incubare sul ghiaccio per cinque minuti. Per preparare la soluzione di gelificazione, preparare un tubo da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Mescolare monomero, acqua bidistillata e 10% T med.Non aggiungere ancora l'ammonio per solfato. Nel frattempo, tenere il tubo della soluzione di gelificazione sul ghiaccio. Aggiungere il 10% di persolfato di ammonio alla soluzione di gelificazione.Pipettare immediatamente 40 microlitri di soluzione di gelificazione su ciascun pozzetto mentre si conserva una provetta di soluzione di gelificazione su ghiaccio. Posizionare la piastra del pozzo sul ghiaccio per altri tre minuti. Per mantenere l'umidità del gel durante l'incubazione a 37 gradi Celsius, coprire la piastra di Petri con il coperchio e mettere alcune gocce d'acqua nella capsula di Petri.Proteggendo il campione dalla luce, spostare il vetro di copertura e la capsula di Petri da 10 centimetri su un'incubatrice a 37 gradi Celsius per 1,5 ore per la gelificazione. Dopo la gelificazione, tagliare il vetro di copertura per separare ogni gel. Trasferire i gel in sei piastre del pozzetto.Aggiungere due millilitri di tampone di digestione a ciascun pozzetto. Lasciare i campioni durante la notte a temperatura ambiente o per quattro ore a 37 gradi Celsius. Quindi lavare i gel con almeno 10 volte il volume d'acqua in eccesso rispetto al volume finale del gel ripetendo la fase di lavaggio quattro volte per 20-30 minuti ogni volta e il gel si espande di circa quattro volte in ciascuna dimensione.Incubare gel in due millilitri di volume di tampone colorante streptavidina digoxigenina con colorante streptavidina da due a cinque micromolari e / o colorante anti digoxigenina per 24 ore a temperatura ambiente mantenendo i campioni al buio. Quindi lavare ed espandere il gel da due a quattro volte con acqua eccessiva. Ogni lavaggio dura da 30 minuti a un'ora.Per una più facile visualizzazione delle cellule al microscopio fluorescente, colorare le cellule con DAPI durante il terzo lavaggio. Diluire le scorte DAPI in uno a 5.000 deliri in acqua di lavaggio. Incubare il gel con una soluzione DAPI per 30 minuti a un'ora.Quindi lavare altre due volte con tre millilitri di acqua. Rivestire la camera di imaging inferiore in vetro a sei pozzetti con tre millilitri di polilisina allo 0,01% per immobilizzare i campioni di gel. Quindi trasferire i campioni di gel nella camera di imaging codificata e visualizzare i campioni con qualsiasi oscilloscopio di fluorescenza desiderato.La microscopia a espansione della ritenzione dell'etichetta mostra una maggiore etichettatura a fluorescenza rispetto alla microscopia a espansione della ritenzione proteica o alla microscopia a espansione della biotina. La microscopia ad espansione della ritenzione dell'etichetta mostra un segnale di fluorescenza circa sei volte superiore rispetto alla microscopia a espansione della ritenzione proteica. LR-ExM può catturare efficacemente piccole strutture, come pozzi rivestiti di clatrina con risoluzione del limite di subdefrazione.Microtubuli e pozzi rivestiti di clatrina erano coloranti co-immuno che utilizzavano ancoraggi funzionali, scavo NHS MA e biotina NHS MA. Allo stesso modo, i pozzi rivestiti di clatrina e i mitocondri sono stati etichettati utilizzando un approccio enzimatico di tag proteico con ancore trifunzionali, come la biotina BG MA e lo scavo BC MA. Inoltre, l'approccio basato sulla colorazione immunologica e l'approccio enzimatico del tag proteico sono combinati per mostrare la struttura della lamina A / C e del complesso nucleopore.La microscopia ad espansione di ritenzione dell'etichetta è stata eseguita sul tessuto cerebrale del topo colorando co-immuno il marcatore presinaptico, il fagotto, e il marcatore postsinaptico, Homer 1. Le due etichette erano chiare e ben separate, il che supporta l'alta risoluzione e l'efficienza dell'etichettatura. La microscopia a espansione per la ritenzione del lavoro è un metodo versatile e robusto, che può essere combinato con qualsiasi altra microscopia di espansione introdotta in precedenza.Per l'imaging ad alta risoluzione, è importante ottenere una buona efficienza di etichettatura per catturare meglio la struttura della scala molecolare. La microscopia a espansione della ritenzione del lavoro è un metodo efficace e robusto per migliorare il segnale.

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