Name: Prendere in giro linterazione tra cellule natural killer e neuroni nocicettori (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Scopri il metodo di co-cultura per studiare l'interazione tra neuroni nocicettori e cellule NK nel contesto infiammatorio e anti-tumorale. Questo approccio rivela come i neuroni modulano la funzione delle cellule NK.

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Questo lavoro è stato sostenuto da The New Frontiers in Research Fund (NFRFE201901326), Canadian Institutes of Health Research (162211, 461274, 461275), Canadian Foundation for Innovation (37439), Canada Research Chair program (950-231859), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (RGPIN-2019-06824) e Fonds de Recherche du Québec Nature et technologies (253380).

I comitati istituzionali per la cura e l'uso degli animali dell'Université de Montréal (# 22053, # 22054) hanno approvato tutte le procedure sugli animali. Vedere la Tabella 1 per un elenco delle soluzioni e la loro composizione e la Tabella dei materiali per un elenco dei materiali, delle attrezzature e dei reagenti utilizzati in questo protocollo.
1. Isolamento, coltura e stimolazione delle cellule NK
<ol><li>Generare neuroni nocicettori intatti (controllo della cucciolata; TRPV1wt::D TA fl/wt) e topi ablati (TRPV1 cre::D TA fl/wt) incrociando topi con tossina lox-stop-lox-difterite (DTA fl/fl) con topi TRPV1cre/wt.</li>
	<li>Utilizzando l'inalazione di CO2, eutanasia di un topo naïve di controllo dei compagni di cucciolata (TRPV1 wt::D TAfl/wt).</li>
	<li>Raccogliere la milza in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml contenente 500 μL di soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS).</li>
	<li>Omogeneizzare la milza usando un pestello.</li>
	<li>Diluire le cellule con 1 mL di PBS sterile.</li>
	<li>Filtrare la miscela attraverso un filtro cellulare da 50 μm in un tubo conico da 15 ml.</li>
	<li>Ricarica il volume (10 ml) con PBS sterile.</li>
	<li>Raccogliere 10 μL e contare le cellule utilizzando un emocitometro.</li>
	<li>Centrifugare le cellule (500 × g, 5 min) e rimuovere il surnatante.</li>
	<li>Risospendere le cellule ad una concentrazione di 108 cellule/ml in mezzo RPMI 1640 integrato.</li>
	<li>Seguire le istruzioni del produttore per purificare magneticamente le cellule NK della milza utilizzando un kit di isolamento delle cellule NK del topo. Confermare la purezza delle cellule NK utilizzando la citometria a flusso11.</li>
	<li>Raccogliere 10 μL e contare le cellule utilizzando un emocitometro.</li>
	<li>Centrifugare le cellule (500 × g, 5 min) e rimuovere il surnatante.</li>
	<li>Risospendere le cellule NK in terreno di coltura RPMI 1640 integrato (contenente IL-2 e IL-15).</li>
	<li>Coltura 2 × 106 cellule NK/ml in una piastra inferiore a U a 96 pozzetti per 48 ore.</li>
</ol>2. Isolamento e coltura dei neuroni DRG
<ol><li>A 24 ore prima della fine della stimolazione delle cellule NK (fase 1.15), rivestire una piastra da 96 pozzetti con 100 μL/pozzetto di laminina (1 ng/ml) e incubare per 45 minuti (37 °C).</li>
	<li>Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione e lasciare asciugare i pozzetti all'aria in un armadio di biosicurezza.</li>
	<li>Utilizzando l'inalazione di CO2, eutanasia neurone nocicettore intatto (controllo della cucciolata; TRPV1wt::D TA fl/wt) o ablato (TRPV1cre::D TAfl/wt) topi. NOTA: l'inalazione di CO2 è preferibile alla lussazione cervicale in quanto evita di interrompere i nervi spinali collegati al DRG.</li>
	<li>Fissare il mouse sulla tavola in posizione prona, sollevare la pelle e incidere la pelle lungo la colonna dorsale. Fare riferimento a Perner et al. per un video dettagliato12.</li>
	<li>Tagliare l'articolazione lombosacrale e separare l'osso sacro dalla colonna lombare con le forbici.</li>
	<li>Separare la colonna vertebrale tagliando i muscoli e le costole su entrambi i lati della colonna vertebrale nella direzione cranica fino a raggiungere la base del cranio.</li>
	<li>Usando le forbici, tagliare la colonna vertebrale all'articolazione atlanto-occipitale.</li>
	<li>Rimuovere il muscolo e il tessuto adiposo dalla colonna vertebrale.</li>
	<li>Pin e aprire la colonna vertebrale per rimuovere il midollo spinale e accedere al DRG. Cerca il DRG nei forami intervertebrali collegati al midollo spinale attraverso la radice dorsale ma separati dalle meningi.</li>
	<li>Raccogliere i DRG in un tubo conico da 15 ml riempito con 10 ml di DMEM integrato ghiacciato.</li>
	<li>Centrifugare il preparato (200 × g, 5 min, temperatura ambiente) e rimuovere il surnatante.</li>
	<li>Aggiungere 250 μL di PBS contenente collagenasi IV (1 mg/ml) e dispasi II (2,4 U/ml).</li>
	<li>Incubare il DRG con la soluzione di collagenasi IV/Dispasi II (C/D) (80 min, 37 °C, lieve agitazione). Quando si raggruppano i gangli di diversi topi, mantenere un rapporto di 125 μL di soluzione C / D per gantaglio.</li>
	<li>Per inattivare gli enzimi, aggiungere 5 ml di mezzo DMEM integrato.</li>
	<li>Centrifugare la soluzione (200 × g, 5 min) e rimuovere delicatamente il surnatante usando una pipetta.</li>
	<li>Per evitare perdite cellulari indesiderate, lasciare ~ 100 μL del surnatante.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di mezzo DMEM integrato.</li>
	<li>Utilizzando una pistola per pipette e tre pipette Pasteur in vetro di dimensioni decrescenti, triturare delicatamente (~10 su/giù per pipetta Pasteur) il DRG in una preparazione a cella singola.</li>
	<li>In un armadio di biosicurezza, diluire l'albumina sierica bovina (BSA) in PBS sterile fino a una concentrazione finale del 15%. Conservare 1 mL di aliquote a -20 °C.</li>
	<li>Creare un gradiente BSA in un tubo conico da 15 mL aggiungendo 2 mL di PBS sterile ed erogando lentamente 1 mL di soluzione BSA al 15% sul fondo del tubo. Evitare di interrompere la sfumatura rimuovendo delicatamente la pipetta.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta P200, pipettare lentamente la sospensione di gangli triturati (che contiene i neuroni) sul lato del tubo nel gradiente.</li>
	<li>Centrifugare il gradiente BSA contenente neuroni (200 × g, 12 min, temperatura ambiente). Impostare l'accelerazione e la decelerazione della centrifuga alla velocità minima. NOTA: Dopo la centrifugazione, i neuroni saranno sul fondo del tubo mentre i detriti cellulari saranno intrappolati nel gradiente BSA.</li>
	<li>Rimuovere delicatamente tutto il surnatante con una pipetta.</li>
	<li>Risospendere le cellule in 500 μL di Neurobasale.</li>
	<li>Piastra 104 neuroni per pozzetto (200 μL di neurobasale/pozzetto) in una piastra a 96 pozzetti rivestita di laminina, fondo piatto. NOTA: In media, un investigatore sarà in grado di riempire ~ 8 pozzi per topo.</li>
	<li>Coltivare i neuroni (37 °C, durante la notte) per consentire l'attaccamento.</li>
</ol>3. Co-coltura e citometria a flusso
<ol><li>Rimuovere lentamente il neurobasale dalla coltura neuronale.</li>
	<li>Dopo 48 ore di stimolazione con IL-2 e IL-15 (vedere punti 1.14-1.15), risospendere le cellule NK e aggiungere 105 cellule NK/pozzetto alla coltura neuronale (piastra inferiore piatta a 96 pozzetti). NOTA: In media, l'investigatore sarà in grado di riempire ~ 6 pozzi per topo.</li>
	<li>Co-coltura delle cellule in MX neurobasale integrato (37 °C, 48 h).</li>
	<li>Raccogliere le cellule, lavare con PBS (3x) e centrifugare (500 × g, 5 min, 4 °C).</li>
	<li>Scartare il surnatante e colorare le cellule con Viability Dye eFlour-780 (1:1.000, 15 min, 4 °C).</li>
	<li>Raccogliere le cellule, lavare con PBS (3x) e centrifugare (500 × g, 5 min, 4 °C).</li>
	<li>Bloccare siti non specifici sulle cellule con CD16/32 (1:100, 15 min, 4 °C).</li>
	<li>Raccogliere le celle, lavare con PBS (3x) e centrifugare (500 × g, 5 min, 4 °C).</li>
	<li>Colorare (15 min, 4 °C) le cellule con BV421 anti-NK-1.1 (1:100), fluoresceina isotiocianato (FITC) anti-NKp46 (1:100) e ficoeritrina (PE) anti-GM-CSF (1:100).</li>
	<li>Raccogliere le cellule, lavare con PBS (3x) e centrifugare (500 × g, 5 min, 4 °C).</li>
	<li>Scartare il surnatante, risospendere le cellule nel tampone FACS (500 μL) e immunofenotipo le cellule NK mediante citometria a flusso11. Vedere la Figura 1A per la strategia di gating.</li>
</ol>

<ol><li>Berta, T., Qadri, Y., Tan, P. H., Ji, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+dorsal+root+ganglia+and+primary+sensory+neurons+for+the+treatment+of+chronic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Therapeutic+Targets%22%5BJournal%5D)">Targeting dorsal root ganglia and primary sensory neurons for the treatment of chronic pain.</a> Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21 (7), 695-703 (2017).</li>
<li>Baral, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptor+sensory+neurons+suppress+neutrophil+and+gammadelta+T+cell+responses+in+bacterial+lung+infections+and+lethal+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nociceptor sensory neurons suppress neutrophil and gammadelta T cell responses in bacterial lung infections and lethal pneumonia.</a> Nature Medicine. 24, 417-426 (2018).</li>
<li>Binshtok, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptors+are+interleukin-1beta+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Nociceptors are interleukin-1beta sensors.</a> Journal of Neuroscience. 28 (52), 14062-14073 (2008).</li>
<li>Chesne, J., Cardoso, V., Veiga-Fernandes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuro-immune+regulation+of+mucosal+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neuro-immune regulation of mucosal physiology.</a> Mucosal Immunology. 12 (1), 10-20 (2019).</li>
<li>Samad, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1beta-mediated+induction+of+Cox-2+in+the+CNS+contributes+to+inflammatory+pain+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1beta-mediated induction of Cox-2 in the CNS contributes to inflammatory pain hypersensitivity.</a> Nature. 410 (6827), 471-475 (2001).</li>
<li>Godinho-Silva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-entrained+and+brain-tuned+circadian+circuits+regulate+ILC3s+and+gut+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-entrained and brain-tuned circadian circuits regulate ILC3s and gut homeostasis.</a> Nature. 574, 254-258 (2019).</li>
<li>Talbot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeding-dependent+VIP+neuron-ILC3+circuit+regulates+the+intestinal+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Feeding-dependent VIP neuron-ILC3 circuit regulates the intestinal barrier.</a> Nature. 579, 575-580 (2020).</li>
<li>Raulet, D. H., Gasser, S., Gowen, B. G., Deng, W., Jung, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+ligands+for+the+NKG2D+activating+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation of ligands for the NKG2D activating receptor.</a> Annual Review of Immunology. 31, 413-441 (2013).</li>
<li>Vivier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+or+adaptive+immunity%3F+The+example+of+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells.</a> Science. 331, 44-49 (2011).</li>
<li>Davies, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+Killer+Cells+Degenerate+Intact+Sensory+Afferents+following+Nerve+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Natural Killer Cells Degenerate Intact Sensory Afferents following Nerve Injury.</a> Cell. 176, 716-728 (2019).</li>
<li>Perner, C., Sokol, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+dissection+and+culture+of+murine+dorsal+root+ganglia+neurons+to+study+neuropeptide+release%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release.</a> STAR Protocols. 2, 100333(2021).</li>
<li>Goswami, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+signatures+of+mouse+TRPV1-lineage+neurons+revealed+by+RNA-Seq+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pain%22%5BJournal%5D)">Molecular signatures of mouse TRPV1-lineage neurons revealed by RNA-Seq transcriptome analysis.</a> Journal of Pain. 15, 1338-1359 (2014).</li>
<li>Mishra, S. K., Tisel, S. M., Orestes, P., Bhangoo, S. K., Hoon, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1-lineage+neurons+are+required+for+thermal+sensation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">TRPV1-lineage neurons are required for thermal sensation.</a> EMBO J. 30, 582-593 (2011).</li>
<li>Kim, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+natural+killer+cell+functions+by+capsaicin+through+a+direct+and+TRPV1-independent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Attenuation of natural killer cell functions by capsaicin through a direct and TRPV1-independent mechanism.</a> Carcinogenesis. 35, 1652-1660 (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Davies et al.11 hanno scoperto che i neuroni feriti sovraregolano RAE1. Attraverso il contatto cellula-cellula, le cellule NK che esprimono NKG2D sono state quindi in grado di identificare ed eliminare i neuroni RAE1+ , che a loro volta limitano il dolore cronico11. Dato che le cellule NK esprimono anche vari recettori neuropeptidici e che questi neuropeptidi sono noti per le loro capacità immunomodulatorie, appare sempre più importante studiare l'intera...

I corpi cellulari dei neuroni sensoriali hanno origine nei gangli della radice dorsale (DRG). I DRG si trovano nel sistema nervoso periferico (PNS), tra il corno dorsale del midollo spinale e i terminali nervosi periferici. La natura pseudo-unipolare dei neuroni DRG consente il trasferimento di informazioni dal ramo periferico, che innerva il tessuto bersaglio, al ramo centrale, che trasporta le informazioni somatosensoriali al midollo spinale1. Utilizzando recettori dei canali ionici specializzati, i neuroni del primo ordine percepiscono le minacce poste da agenti patogeni, allergeni e inquinanti2, portando all'afflusso di cationi (Na+, Ca2+) e alla generazione di un potenziale d'azione 3,4,5.
Questi neuroni inviano anche il potenziale d'azione antidromica verso la periferia, dove si era verificato il rilevamento iniziale del pericolo, che porta al rilascio locale di neuropeptidi 1,4. Pertanto, i neuroni nocicettori fungono da meccanismo protettivo, avvisando l'ospite del pericolo ambientale 4,5,6,7.
Per comunicare con i neuroni di secondo ordine, i nocicettori rilasciano vari neurotrasmettitori (ad esempio, glutammato) e neuropeptidi (ad esempio, peptide correlato al gene della calcitonina (CGRP), sostanza P (SP) e peptide intestinale vasoattivo (VIP)6,7. Questi peptidi agiscono sui capillari e promuovono lo stravaso plasmatico, l'edema e l'afflusso locale e la modulazione delle cellule immunitarie 2,4,7.
Il sistema somatosensoriale e immunitario utilizza un sistema di comunicazione condiviso composto da citochine e neuropeptidi e dai rispettivi recettori affini4. Mentre questa comunicazione bidirezionale aiuta a proteggere dal pericolo e preservare l'omeostasi, può anche contribuire alla fisiopatologia della malattia4.
Le cellule NK sono classificate come cellule linfoidi innate e sono specializzate per eliminare le cellule infettate viralmente. La funzione delle cellule NK è governata da un equilibrio di recettori stimolatori e inibitori, incluso il recettore attivante NKG2D8. Il ligando endogeno di NKG2D, acido retinoico inducibile precocemente1 (RAE1), è espresso da cellule sottoposte a stress come tumorigenesi e infezione 8,9.
Recenti indagini hanno dimostrato che la lesione dei nervi periferici spinge i neuroni sensoriali ad esprimere molecole disadattive come la statina 2 (STMN2) e RAE1. Pertanto, tramite il contatto cellula-cellula, le cellule NK che esprimono NKG2D sono state attivate dall'interazione con i neuroni che esprimono RAE1. A loro volta, le cellule NK sono state in grado di eliminare i neuroni nocicettori feriti e l'ipersensibilità al dolore contundente normalmente associata a lesioni nervose10. Oltre all'asse NKG2D-RAE1, le cellule NK esprimono i recettori affini per vari mediatori prodotti dai nocicettori. È quindi possibile che questi mediatori modulano l'attività delle cellule NK. Questo articolo presenta un metodo di co-coltura per studiare la biologia dell'interazione neurone-cellule NK nocicettori. Questo approccio aiuterà a far progredire la comprensione di come i neuroni nocicettori modulano le risposte delle cellule immunitarie innate a lesioni, infezioni o tumori maligni.

<table><tbody><tr><td>Anti-topo CD16/32</td><td>Jackson Laboratory</td><td>Cat no: 017769</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>Jackson Laboratory</td><td>Cat no: 009669</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA) grado di coltura</td><td>World Precision Instruments</td><td>Cat no: 504167</td><td></td></tr><tr><td>BV421 anti-topo NK-1.1</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat no: 12430112</td><td></td></tr><tr><td>Filtro cellulare (50 &mu; m)</td><td>Fisher Scientific</td><td>Gatto n.: A3160702</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi IV</td><td>Fisher</td><td>Scientific Gatto n.: 15140148</td><td></td></tr><tr><td>Diphteria toxinfl/fl</td><td>Fisher Scientific</td><td>Gatto n.: SH3057402</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Fisher Scientific</td><td>Gatto n.: 13-678-20B</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>Gatto n.: 07-200-95</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Mouse NK Cell Isolation Kit</td><td>Sigma</td><td>Cat no: CLS2595</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>Cat no: C0130</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria III</td><td>Sigma</td><td>Cat no: 04942078001</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Sigma</td><td>Cat no: 806552</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-topo NKp46</td><td>Sigma</td><td>Cat no: L2020</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti a fondo piatto</td><td>Sigma</td><td>Cat no: 03690</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta Pasteur in vetro</td><td>Sigma</td><td>Cat no: 470236-274</td><td></td></tr><tr><td>Fattore neurotrofico derivato da linea cellulare gliale (GDNF)</td><td>VWR</td><td>Cat no: 02-0131</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Cedarlane</td><td>Cat no: 03-50/31</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Gibco</td><td>Cat no: A14867-01</td><td></td></tr><tr><td>Topo ricombinante IL-15</td><td>Gibco</td><td>Codice di fabbrica: 22400-089</td><td></td></tr><tr><td>IL-2 ricombinante di topo</td><td>Gibco</td><td>Numero di gatto: 21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Nerve Growth Factor (NGF)</td><td>Life Technologies</td><td>Codice di fabbrica: 13257-019</td><td></td></tr><tr><td>Terreni neurobasali</td><td>PeproTech</td><td>Numero di gatto: 450-51-10</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-topo GM-CSF</td><td>PeproTech</td><td>Numero di gatto: 212-12</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina e Streptomicina</td><td>PeproTech</td><td>Gatto no: 210-15</td><td></td></tr><tr><td>Pestles</td><td>Stem Cell Technology</td><td>Gatto no: 19855</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Biolegend</td><td>Cat no: 108732</td><td>Clone PK136</td></tr><tr><td>RPMI 1640 media</td><td>Biolegend</td><td>Cat no: 137606</td><td>Clone 29A1.4</td></tr><tr><td>TRPV1Cre</td><td>Biolegend</td><td>Cat no: 505406</td><td>Clone MP1-22E9</td></tr><tr><td>Pinzette e strumenti di dissezione.</td><td>Biolegend</td><td>Codice prodotto: 65-0865-14</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti con fondo a U</td><td>Biolegend</td><td>Codice prodotto: 101319</td><td></td></tr><tr><td>Viability Dye eFlour-780</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

prendere in giro l'interazione tra cellule natural killer e neuroni nocicettori

Teasing Out the Interplay Between Natural Killer Cells and Nociceptor Neurons

I neuroni somatosensoriali si sono evoluti per rilevare stimoli nocivi e attivare riflessi difensivi. Condividendo i mezzi di comunicazione, i neuroni nocicettori sintonizzano anche le difese dell'ospite controllando l'attività del sistema immunitario. La comunicazione tra questi sistemi è per lo più adattiva, contribuendo a proteggere l'omeostasi, può anche portare a, o promuovere, l'insorgenza di malattie croniche. Entrambi i sistemi si sono co-evoluti per consentire tale interazione locale, come si trova nei tessuti linfoidi primari e secondari e nelle mucose. Studi recenti hanno dimostrato che i nocicettori rilevano e rispondono direttamente agli antigeni estranei, alle citochine derivate dalle cellule immunitarie e ai microbi.
L'attivazione dei nocicettori non solo provoca ipersensibilità al dolore e prurito, ma abbassa la soglia di attivazione del nocicettore, portando al rilascio locale di neuropeptidi. I peptidi prodotti e rilasciati dai terminali periferici dei nocicettori possono bloccare la chemiotassi e la polarizzazione dei linfociti, controllando la localizzazione, la durata e il tipo di infiammazione. Prove recenti mostrano che i neuroni sensoriali interagiscono con le cellule immunitarie innate attraverso il contatto cellula-cellula, ad esempio, coinvolgendo i recettori di gruppo 2D (NKG2D) sulle cellule natural killer (NK).
Dato che le cellule NK esprimono i recettori affini per vari mediatori prodotti dai nocicettori, è concepibile che i nocicettori utilizzino neuropeptidi per controllare l'attività delle cellule NK. Qui, abbiamo ideato un metodo di co-coltura per studiare le interazioni delle cellule neuron-NK dei nocicettori in un piatto. Utilizzando questo approccio, abbiamo scoperto che i neuroni nocicettori lombari riducono l'espressione delle citochine delle cellule NK. Nel complesso, un tale metodo riduzionista potrebbe essere utile per studiare come i neuroni innervanti del tumore controllano la funzione antitumorale delle cellule NK e come le cellule NK controllano l'eliminazione dei neuroni danneggiati.

Le cellule NK sono state purificate magneticamente dal controllo della cucciolata (TRPV1 wt::D TAfl/wt) splenociti di topi e stimolate (48 h) con IL-2 e IL-15. Le cellule NK sono state quindi coltivate da sole o co-coltivate con neuroni DRG raccolti dal neurone nocicettore intatto (controllo della cucciolata; TRPV1wt::D TA fl/wt) o ablato (TRPV1cre::D TAfl/wt) topi. Le cellule sono state quindi esposte alla capsaicina agonista TRPV1 (1 μM) o al suo veicolo...

I neuroni nocicettori e le cellule NK interagiscono attivamente in un contesto infiammatorio. Un approccio di co-cultura consente di studiare questa interazione.

Prendere in giro l'interazione tra cellule natural killer e neuroni nocicettori

Somatosensory neurons have evolved to detect noxious stimuli and activate defensive reflexes. By sharing means of communication, nociceptor neurons also ...

Dato che i neuroni nocicettori secernono vari neuropeptidi e che le cellule NK esprimono il recettore per questi neuropeptidi, abbiamo deciso di ideare un metodo di co-coltura per studiare l'interazione tra la cellula NK e i neuroni nocicettori. Tale metodo riduzionista potrebbe essere utile per studiare come i neuroni nocicettori controllano la funzione antitumorale delle cellule NK, e potrebbe anche essere interessante studiare come le cellule NK controllano l'eliminazione dei neuroni feriti. A dimostrare la procedura sarà Ali Ahmadi, un ex studente di master del mio laboratorio.Per iniziare l'isolamento e la coltura del natural killer o delle cellule NK, raccogliere la milza del topo in un tubo di microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente 500 microlitri di PBS sterile, quindi omogeneizzare la milza usando un pestello. Quindi, diluire le cellule con un millilitro di PBS sterile e filtrare la miscela attraverso un filtro cellulare da 50 micron in un tubo conico da 50 millilitri. Riempire il volume omogenato filtrato a 10 millilitri utilizzando PBS sterile.Contare le cellule in 10 microlitri di omogenato diluito usando un emocitometro. Centrifugare le cellule rimanenti per cinque minuti a 500 G e rimuovere il surnatante. Quindi risospendere le celle da 10 all'ottava cella per millilitro nel mezzo RPMI 1640 integrato.Purificare magneticamente le cellule NK della milza utilizzando un kit di isolamento delle cellule NK del topo e confermare la purezza delle cellule NK utilizzando la citometria a flusso. Contare le cellule utilizzando un emocitometro, seguito da centrifugazione a cinque minuti a 500 G, quindi rimuovere il surnatante. Per stimolare le cellule NK pellettizzate, risospendere queste cellule in terreno di coltura RPMI 1640 integrato con IL-2 e IL-15.Coltura due volte 10 alla sesta cellula NK per millilitro in una piastra inferiore a U a 96 pozzetti per 48 ore. 24 ore prima della stimolazione delle cellule NK, rivestire la piastra a 96 pozzetti con 100 microlitri per pozzetto di laminina e incubarla per 45 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione e lasciare asciugare i pozzetti all'aria nell'armadio di biosicurezza.Quindi, fissare il mouse eutanasia sulla lavagna in posizione prona. Sollevare la pelle e incidere la pelle lungo la colonna dorsale. Tagliare l'articolazione lombosacrale e separare l'osso sacro dalla colonna lombare con le forbici.Quindi separare la colonna vertebrale tagliando i muscoli e le costole su entrambi i lati nella direzione cranica fino a raggiungere la base del cranio. Usa le forbici per tagliare la colonna vertebrale all'articolazione atlantooccipitale. Quindi, rimuovere il muscolo e il tessuto adiposo dalla colonna vertebrale.Pin e aprire la colonna vertebrale per rimuovere il midollo spinale prima di accedere al ganglio della radice dorsale o DRG nei forami intervertebrali collegati al midollo spinale attraverso la radice dorsale. Quindi, raccogliere i DRG in un tubo conico da 15 millilitri riempito con 10 millilitri di DMEM integrato ghiacciato. Quindi centrifugare il preparato per cinque minuti a 200 G a temperatura ambiente e rimuovere il surnatante.Aggiungere un 250 microlitri di PBS contenente un milligrammo per millilitro di collagenasi IV e 2,4 unità per millilitro di dispasi II.Incubare questo DRG con soluzione di collagenasi-dispasi per 80 minuti con lieve agitazione. Per inattivare gli enzimi, aggiungere cinque millilitri di mezzo DMEM integrato e centrifugare la soluzione a 200 G.Dopo cinque minuti, rimuovere delicatamente il surnatante usando una pipetta e lasciare circa 100 microlitri di surnatante per evitare perdite cellulari indesiderate. Quindi, aggiungere un mezzo DMEM integrato in millilitro alle celle e utilizzare una pistola per pipette e tre pipette Pasteur in vetro di dimensioni decrescenti per triturare delicatamente il DRG in una preparazione a cella singola.Mentre si lavora in un armadio di biosicurezza, diluire l'albumina sierica bovina o BSA in PBS sterile a una concentrazione finale del 15% e conservare aliquote di un millilitro a meno 20 gradi Celsius. Per creare un gradiente BSA in un tubo conico da 15 millilitri, aggiungere due millilitri di PBS sterile e quindi erogare lentamente un millilitro di soluzione BSA al 15% sul fondo del tubo. Evitare di interrompere la sfumatura rimuovendo delicatamente la pipetta.Utilizzando una pipetta P200, aggiungere la sospensione di gangli triturati contenente i neuroni sul lato del tubo nel gradiente. Quindi impostare l'accelerazione e la decelerazione al minimo per centrifugare il neurone contenente il gradiente BSA per 12 minuti a 200 G.Dopo la centrifugazione, rimuovere tutto il surnatante usando una pipetta e risospendere le cellule in 500 microlitri di Neurobasale. Piastra 10.000 neuroni per pozzetto in una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti rivestita di aminina.Per consentire l'attaccamento dei neuroni, incubare la piastra a 96 pozzetti durante la notte a 37 gradi Celsius. Per iniziare la co-coltura, rimuovere lentamente il neurobasale dalla coltura neuronale. Dopo 48 ore di stimolazione con IL-2 e IL-15, risospendere le cellule NK e aggiungere 10 alla quinta cellula NK per pozzetto alla coltura neuronale.Co-coltura delle cellule in MX neurobasale integrato a 37 gradi Celsius. Dopo 48 ore, raccogliere e lavare le cellule tre volte con PBS e centrifugarle per cinque minuti a 500 G a quattro gradi Celsius. Scartare il surnatante prima di colorare le cellule con uno a 1.000 colorante vitalità diluito eFluor 780 per 15 minuti a quattro gradi Celsius.Lavare e centrifugare le cellule come dimostrato, quindi trattare con CD 1632 per 15 minuti a quattro gradi Celsius per bloccare siti non specifici sulle cellule, seguito dalla raccolta e dal lavaggio delle cellule con PBS tre volte. Dopo il successivo ciclo di lavaggio e centrifugazione, colorare le cellule con BV421, anti-NK-1.1, fluoresceina isotiocianato anti-NKp46 e ficoeritrina anti-GM-CSF per 15 minuti. Ancora una volta, raccogliere e lavare le cellule tre volte con PBS, centrifugarle e scartare il surnatante, quindi risospendere le cellule in 500 microlitri di tampone FACS e immunofenotipo le cellule NK utilizzando la citometria a flusso.Quando coltivate da sole, le cellule NK hanno espresso livelli basali di fattore stimolante le colonie di macrofagi granulocitari o GM-CSF e NKp46. Quando co-coltivato con neuroni DRG raccolti da topi nocicettori intatti, la stimolazione della capsaicina ha diminuito l'espressione delle cellule NK del GM-CSF. La capsaicina non ha avuto alcun impatto sulle attivazioni delle cellule NK quando co-coltivata con neuroni DRG raccolti da topi ablati con nocicettori.Il livello di NKp46 non è stato influenzato. I passaggi chiave di questo protocollo sono la dissociazione e l'isolamento DRG. L'idea è quella di mantenere la massima vitalità neuronale evitando di fare bolle e usando la giusta pipetta.Dopo il protocollo, lo sperimentatore può utilizzare il sequenziamento dell'RNA o la qPCR per misurare il cambiamento della trascrizione nelle cellule purificate FACS, oppure può utilizzare ELISA per misurare la secrezione di citochine o neuropeptidi. Tale interazione rivela che la funzione delle cellule NK è probabilmente sintonizzata dal neurone nocicettore. E questa diafonia può essere importante nei processi biologici che vanno dalle lesioni nervose, alle infezioni batteriche e virali, fino ai tumori maligni.

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