Un approccio basato sulla spettrometria di massa per identificare le fosfatasi delle fosfoproteine e i loro interattori

PIB-MS è una nuova tecnica utilizzata per arricchire le fosforproteine fosfatasi endogene e sono proteine interagenti da cellule e tessuti. Implica l'identificazione e la quantificazione di queste proteine utilizzando la proteomica basata sulla spettrometria di massa. Questa tecnica non richiede l'espressione esogena di versioni marcate di fosforproteina fosfatasi che potrebbero alterare l'attività o la localizzazione delle proteine.

Inoltre, non utilizza anticorpi che potrebbero essere non specifici o incapaci di distinguere tra isoforme specifiche. Questo metodo per studiare il PPPM può essere scalato per l'uso su tutto, dalle cellule ai campioni clinici. Per iniziare, raccogliere il pellet cellulare mediante centrifugazione a 277 volte g per due minuti a temperatura ambiente.

Rimuovere i fluidi e lavare le celle con cinque millilitri di PBS. Preparare il buffer di lisi come descritto nel protocollo di testo e mantenere il ghiaccio. Aggiungere un millilitro di tampone di lisi refrigerato ai campioni, quindi omogeneizzare i campioni per sonificazione e mantenere le cellule sul ghiaccio tra gli impulsi.

Trasferire i lisati in tubi freschi da 1,5 millilitri. Centrifugare il campione sonicato a 21, 130 volte g per 15 minuti a 4 gradi Celsius. Utilizzare un'aliquota del lisato per quantificare la concentrazione totale di proteine utilizzando un test dell'acido bicinchoninico.

Questo passaggio è essenziale per garantire la stessa concentrazione proteica in ciascun campione. Per un controllo dell'inibitore della fosfoproteina fosfatasi, preparare due aliquote di uguale concentrazione proteica per ciascun campione. Il tampone di lisi può essere utilizzato per diluire i campioni in modo che ogni tubo abbia la stessa concentrazione proteica.

Aggiungere un micromolare di microcistina-LR libera a un'aliquota e un volume uguale di DMSO all'altra. Vortice i campioni e incubarli sul ghiaccio per 15 minuti. La preparazione delle perle inibitrici della fosfatasi deve essere effettuata in anticipo o durante le fasi di incubazione descritte nella sezione di preparazione del campione.

Utilizzare 10 microlitri di perle inibitrici della fosfatasi solida, o resina PIB, per un milligrammo di proteine e aggiungerli a un tubo da 1,5 millilitri. Lavare i PIB tre volte con 0,5 millilitri di tampone di lisi mediante vortice seguito da centrifugazione a 376 volte g per 30 secondi a temperatura ambiente. Aggiungere una quantità appropriata di tampone di lisi ai PIB lavati per ottenere una soluzione tampone PIB al 50% in volume.

Mescolare delicatamente il pipettaggio e ruotare la punta della pipetta e il liquame per risospescere i PIB. Trasferire 20 microlitri del liquame in un tubo da 1,5 millilitri contenente 0,5 millilitri di tampone di lisi. Ruotare i tubi a 376 volte g per 30 secondi.

Ogni tubo contiene volumi uguali di PIB in esso. Scartare il surnatante lasciando solo la resina solida e fino a 50 microlitri di tampone di lisi in ciascun tubo. Trasferire i lisati nei tubi opportunamente etichettati contenenti PIB.

Incubare il lisato con i PIB per un'ora a 4 gradi Celsius con rotazione a 8 rpm. Dopo l'incubazione con il lisato, centrifugare i PIB a 376 volte g per 30 secondi a 4 gradi Celsius e rimuovere il surnatante. Lavare le perline aggiungendo 0,5 millilitri di tampone di lisi e invertendo i tubi Raccogliere le perline per centrifugazione e rimuovere il surnatante.

Ripeti questo passaggio per un totale di tre lavaggi. Dopo il lavaggio finale, rimuovere il più possibile il tampone di lisi senza pipettare i PIB. Preparare il tampone di eluizione contenente il 2% di SDS e aggiungere il buffer di eluizione da quattro a cinque volte il volume dei PIB.

Incubare a 65 gradi Celsius per un'ora per eluire le fosfoproteine fosfatasi dalle perline. Centrifugare i tubi a 376 volte g per 30 secondi a temperatura ambiente. Raccogliere l'eluato in un tubo separato e procedere per le analisi di spettrometria di massa o western blotting.

Per rigenerare i PIB, incubarli in soluzione 2%SDS con rotazione a 8 rpm per un'ora a temperatura ambiente. Lavare le perline da tre a cinque volte in Tris-HCl 25 millimolari pH 7,5 con rotazione per 30 minuti per lavaggio. Conservare i PIB in Tris HCL 25 millimolari pH 7,5 con azide di sodio.

Per l'analisi della spettrometria di massa, i metodi di filtraggio e analisi dei dati variano e possono essere eseguiti dal ricercatore o da una struttura centrale. Dopo aver cercato i dati grezzi in un database di proteoma specifico per specie, filtrare i risultati della ricerca ed esportarli come foglio di lavoro di Microsoft Excel. Analizzare i dati in triplice copia.

Per una quantificazione senza etichetta, utilizzare le misurazioni dell'area di picco MS1 per quantificare i dati. Per identificare le subunità PPP e i loro interattori de novo, confrontare i triplicati biologici di campioni inibiti da microcistina-LR e dmSO trattati. Filtrare i dati in modo che siano presenti solo proteine con un numero totale di peptidi superiore a uno in almeno due dei tre campioni trattati con controllo DMSO.

Per filtrare le proteine che non si legano specificamente alla resina, rimuovere le proteine in cui la conta peptidica totale nella condizione trattata con microcistina-LR è superiore a quella di qualsiasi subunità catalitica PPP. Escludere dall'analisi contaminanti comuni come cheratina, collagene, proteine ribosomiali e ribonucleoproteine nucleari eterogenee. Un file CSV è essenziale per importare i dati in Perseo.

Importa i dati filtrati in Perseus facendo clic su Caricamento matrice generica nella sezione Carica. Trasformare i dati andando su Trasformazione di base, selezionando i dati e specificando la funzione di trasformazione come log base 2 di x. Imputa i valori mancanti da una distribuzione normale andando su Imputazione, Sostituisci valori mancanti dalla distribuzione normale, selezionando i dati e specificando la larghezza e il downshift per il calcolo.

Eseguire la normalizzazione quantile andando a Normalizzare, Normalizzazione quantile. Annotare i dati passando a Righe Annot, Righe di annotazione categoriche. Esegui il test T dello studente andando su Test, Test a due campioni, selezionando i gruppi, il test da eseguire e il metodo per la correzione di test di ipotesi multiple come utilizzato per il troncamento.

Questa funzione calcola anche i rapporti log 2. I fosfoproteici fosfofati e i loro interattori sono stati identificati nelle cellule HeLa utilizzando un esperimento di pull-down PIB, seguito da una quantificazione senza etichetta dell'abbondanza proteica in campioni trattati con DMSO e microcistina-LR. Il grafico del vulcano dell'analisi della spettrometria di massa ha identificato specifici leganti PIB mostrati in rosso, subunità catalitiche in blu e nuove subunità PPP candidate, o proteine interagenti, in bianco.

I leganti non specifici sono stati mostrati in grigio. Il grafico a dispersione dell'area log2 dal lisato di cellule HeLa trattato con DMSO ha mostrato che le abbondanze erano altamente correlate, indicando la riproducibilità dei dati. L'analisi di rete di tutte le subunità della fosforproteina fosfatasi e delle proteine interagenti ha mostrato che queste proteine erano interattori specifici nel pull-down del PIB.

Le analisi proteomiche globali potrebbero essere eseguite e i risultati confrontati con l'analisi PIB per determinare se la composizione del PPPome è guidata dall'abbondanza di PPP o regolata da meccanismi post-traduzionali. PIB-MS è uno strumento ampiamente applicabile che ci ha permesso di identificare le differenze nei modelli di espressione PPP in varie condizioni come l'interfase rispetto ai campioni mitotici o le differenze tra le linee cellulari tumorali.