Dimostrazione dell'innervazione della pelle pelosa e glabra in un modello 3D utilizzando più approcci fluorescenti di colorazione e pulizia dei tessuti
May 20th, 2022
Lo spessore delle sezioni tissutali limitava lo studio morfologico dell'innervazione cutanea. Il presente protocollo descrive una tecnica unica di pulizia dei tessuti per visualizzare le fibre nervose cutanee in sezioni di tessuto spesse 300 μm sotto microscopia confocale.
Il nostro protocollo ha fornito un metodo fattibile per osservare la sezione di sincronizzazione utilizzando il microscopio confocale, che potrebbe garantire precisione nell'osservazione delle fibre nervose. Il protocollo di pulizia dei tessuti semplice e facile è uno dei principali vantaggi di questa tecnica. Il processo di pulizia dei tessuti è efficiente e richiede da circa 30 minuti a un'ora.
Condurre la perfusione sul ratto eutanasizzato come menzionato nel manoscritto del testo. Utilizzare un bisturi per rimuovere la pelle del dorso e la suola dalla zampa posteriore. Per i campioni che richiedono una sezione congelata, post fissare i tessuti in 4% da aldeide in 0,1 PB molare per due ore.
Dopo il lavaggio, incorporare i tessuti della pelle in 2% di agarosio a 37 gradi Celsius e posizionarli all'interno della ghiacciaia per il raffreddamento. Fissare il tessuto montato sul microtono vibrante con acqua ghiacciata e affettarli ad uno spessore di 500 micrometri in direzione trasversale. Dopo l'affettamento, rimuovere l'agarosio dalle sezioni e conservarle in una piastra a sei pozzetti con 1x PBS.
Incubare le sezioni di tessuto in una soluzione di 2% tritone X-100 in 1x PBS durante la notte a quattro gradi Celsius. Posizionare le sezioni di tessuto nel tampone di blocco e ruotare a 72 rotazioni al minuto sullo shaker durante la notte a quattro gradi Celsius. Trasferire le sezioni tissutali nella soluzione contenente gli anticorpi primari dell'anticorpo monoclonale di topo anti-CGRP e dell'anticorpo policlonale anti-LYVE-1 di pecora nel tampone di diluizione nel tubo della micro centrifuga.
Quindi ruotare sullo shaker per due giorni a quattro gradi Celsius. Lavare le sezioni di tessuto due volte con tampone di lavaggio a temperatura ambiente, quindi tenerle sullo shaker durante la notte a quattro gradi Celsius nel tampone di lavaggio. Il giorno successivo, trasferire le sezioni di tessuto nella soluzione mista contenente gli anticorpi secondari in un tubo di micro centrifuga e ruotare a 72 rotazioni al minuto sullo shaker per cinque ore a quattro gradi Celsius.
Lavare le sezioni di tessuto in una piastra a sei pozzetti con tampone di lavaggio due volte per un'ora a temperatura ambiente. Mantenere le sezioni di tessuto nel tampone di lavaggio sullo shaker durante la notte a quattro gradi Celsius. Trasferire le sezioni di tessuto nel reagente di compensazione dei tessuti e ruotare delicatamente a 60 rotazioni al minuto sullo shaker per un'ora a temperatura ambiente.
Montare i tessuti trasparenti sul vetrino, quindi circondare i tessuti con un distanziatore e incollare lo spazio con il reagente di pulizia del tessuto fresco e coprire lo scivolamento. Il modello 3D ha dimostrato che le fibre nervose positive CGRP passavano attraverso il tessuto sottocutaneo e il derma fino all'epidermide. Queste fibre nervose correvano in fasci nel tessuto sottocutaneo ramificato all'interno del derma e terminato nell'epidermide.
Al contrario, la falloidina nei vasi sanguigni positivi e i vasi linfatici positivi LYVE-1 sono distribuiti nel tessuto sottocutaneo e nel derma. Generalmente le fibre nervose positive CGRP correvano parallele o circondate dai vasi sanguigni e dai vasi linfatici formando una rete 3D nella pelle pelosa e glabra. Con l'approccio convenzionale, sebbene i vasi sanguigni delle fibre nervose e i vasi linfatici fossero chiaramente etichettati con CGRP falloidina e LYVE-1 nelle sezioni sottili, l'osservazione di queste strutture era limitata dallo spessore della fetta e non può essere osservata completamente.
Nella sezione con uno spessore di 30 micrometri, non c'era differenza tra pelle pelosa e pelle glabra nella superficie delle fibre nervose positive CGRP. Nelle sezioni di tessuto spesse 300 micrometri, rispetto alla pelle pelosa, la superficie delle fibre nervose positive CGRP della pelle glabra è stata significativamente aumentata. È importante utilizzare il tampone di pulizia con un'elevata pressione osmotica dopo l'incubazione degli anticorpi.
Più volte, è necessario il tempo di pulizia richiesto per la colorazione immunofluorescenza. Seguendo questa procedura, riteniamo che esista anche la possibilità di colorazione e osservazione di altri tessuti e organi in sei sezioni. Questa tecnica potrebbe aiutare i ricercatori di neuroscienze a incontrare la superficie e lo stato delle fibre neurologiche.
Ci aiuta anche a osservare l'innovazione di tessuti e organi.
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Panoramica
Questo studio presenta una nuova tecnica di clearing dei tessuti per la visualizzazione delle fibre nervose cutanee in sezioni di tessuto spesse 300 µm utilizzando la microscopia confocale. Il metodo migliora lo studio morfologico dell'innervazione cutanea, affrontando i limiti del sectioning convenzionale a sezioni sottili.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Neuroscienza
- Imaging dei tessuti
- Microscopia confocale
Sfondo
- Studiare l'innervazione cutanea è cruciale per comprendere le vie sensoriali.
- I metodi tradizionali sono limitati dalla sottigliezza delle sezioni di tessuto.
- Visualizzare le fibre nervose in sezioni più spesse può offrire approfondimenti più profondi.
- Il metodo mira a migliorare la precisione e l'efficienza dell'imaging.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare e validare una tecnica di clearing dei tessuti per sezioni di pelle spesse.
- Facilitare l'osservazione delle fibre nervose e la loro relazione con i vasi sanguigni e linfatici.
- Fornire un metodo che possa essere adattato per studiare altri tessuti e organi.
Metodi utilizzati
- La microscopia confocale è stata utilizzata per visualizzare le fibre nervose in sezioni di tessuto clearing.
- Il modello biologico ha coinvolto ratti eutanasizzati, osservando specificamente la pelle dal dorso e dall'arto posteriore.
- I passaggi chiave hanno incluso la perfusione del tessuto, l'incorporazione, la colorazione con anticorpi e il clearing del tessuto.
- L'intero protocollo di cleaning e imaging tipicamente richiede da 30 minuti a un'ora.
Risultati principali
- La tecnica di clearing ha rivelato con successo fibre nervose positive per CGRP che formano una rete 3D all'interno della pelle.
- I risultati hanno indicato differenze significative nella distribuzione delle fibre nervose tra la pelle pelosa e glabra.
- Il metodo ha permesso un'osservazione dettagliata delle relazioni strutturali con i vasi sanguigni e linfatici.
- Le fibre positive per CGRP sono state trovate a correre parallele o circondare i vasi sanguigni e linfatici.
Conclusioni
- Questa tecnica migliora la capacità di visualizzare e studiare l'innervazione cutanea in modo completo.
- La migliore visualizzazione potrebbe contribuire con preziose intuizioni sui meccanismi neurobiologici.
- Le potenziali applicazioni si estendono a vari tessuti, promuovendo una più ampia ricerca in neuroscienze.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Three-dimensional visualization of skin innervation using thick tissue sections and multiplex fluorescent staining addresses a critical gap in mapping peripheral nerve architecture. This approach enhances predictive confidence in early discovery by enabling comprehensive analysis of nerve, blood, and lymphatic vessel interactions in disease-relevant skin models. The method supports translational continuity for neurobiology and dermatology-focused R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables detailed mapping of sensory nerve fiber distribution in both hairy and glabrous skin.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying spatial relationships between nerves and vasculature.
- Improves predictive confidence for target validation in peripheral nervous system research.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated 3D skin models for downstream phenotypic screening.
- Enhances assay reproducibility by standardizing tissue clearing and staining protocols.
- Provides quantitative outputs on nerve fiber surface area and network complexity.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by modeling both hairy and glabrous skin innervation.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation of neurocutaneous targets.
- Supports risk-adjusted advancement by revealing structural biomarkers in skin tissue.
Pipeline & Workflow Integration
This multiplexed imaging method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early mechanistic studies with translational model development.
- Discovery Biology: Advances hypothesis testing on nerve-vasculature interactions in skin.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative 3D readouts for assay development.
- Analytics: Provides surface area measurements and network mapping for comparative analysis.
- Translational Research: Supports biomarker alignment in disease-relevant skin models.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized protocol adaptable to other tissues and organ systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in nerve mapping.
- Operational Value: Streamlines tissue processing with efficient clearing and staining workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing robust 3D data for target evaluation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurocutaneous and dermatological programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and multiplex immunofluorescence.
- Demands access to tissue clearing reagents and imaging infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of staining and clearing protocols.
- Adaptable to various tissue types with protocol optimization.
- Dependent on antibody quality and clearing efficiency for optimal results.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:43
Perfusion, Triple Fluorescent Staining, and Tissue Clearing Treatment
3:10
Results: Enhanced Understanding of the Skin Innervation via Immunofluorescence and a 3D View of the Cutaneous Nerve Fibers in the Hairy and Glabrous Skin
4:31
Conclusion
