Dimostrazione dell'innervazione della pelle pelosa e glabra in un modello 3D utilizzando più approcci fluorescenti di colorazione e pulizia dei tessuti
20 maggio 2022
Lo spessore delle sezioni tissutali limitava lo studio morfologico dell'innervazione cutanea. Il presente protocollo descrive una tecnica unica di pulizia dei tessuti per visualizzare le fibre nervose cutanee in sezioni di tessuto spesse 300 μm sotto microscopia confocale.
Il nostro protocollo ha fornito un metodo fattibile per osservare la sezione di sincronizzazione utilizzando il microscopio confocale, che potrebbe garantire precisione nell'osservazione delle fibre nervose. Il protocollo di pulizia dei tessuti semplice e facile è uno dei principali vantaggi di questa tecnica. Il processo di pulizia dei tessuti è efficiente e richiede da circa 30 minuti a un'ora.
Condurre la perfusione sul ratto eutanasizzato come menzionato nel manoscritto del testo. Utilizzare un bisturi per rimuovere la pelle del dorso e la suola dalla zampa posteriore. Per i campioni che richiedono una sezione congelata, post fissare i tessuti in 4% da aldeide in 0,1 PB molare per due ore.
Dopo il lavaggio, incorporare i tessuti della pelle in 2% di agarosio a 37 gradi Celsius e posizionarli all'interno della ghiacciaia per il raffreddamento. Fissare il tessuto montato sul microtono vibrante con acqua ghiacciata e affettarli ad uno spessore di 500 micrometri in direzione trasversale. Dopo l'affettamento, rimuovere l'agarosio dalle sezioni e conservarle in una piastra a sei pozzetti con 1x PBS.
Incubare le sezioni di tessuto in una soluzione di 2% tritone X-100 in 1x PBS durante la notte a quattro gradi Celsius. Posizionare le sezioni di tessuto nel tampone di blocco e ruotare a 72 rotazioni al minuto sullo shaker durante la notte a quattro gradi Celsius. Trasferire le sezioni tissutali nella soluzione contenente gli anticorpi primari dell'anticorpo monoclonale di topo anti-CGRP e dell'anticorpo policlonale anti-LYVE-1 di pecora nel tampone di diluizione nel tubo della micro centrifuga.
Quindi ruotare sullo shaker per due giorni a quattro gradi Celsius. Lavare le sezioni di tessuto due volte con tampone di lavaggio a temperatura ambiente, quindi tenerle sullo shaker durante la notte a quattro gradi Celsius nel tampone di lavaggio. Il giorno successivo, trasferire le sezioni di tessuto nella soluzione mista contenente gli anticorpi secondari in un tubo di micro centrifuga e ruotare a 72 rotazioni al minuto sullo shaker per cinque ore a quattro gradi Celsius.
Lavare le sezioni di tessuto in una piastra a sei pozzetti con tampone di lavaggio due volte per un'ora a temperatura ambiente. Mantenere le sezioni di tessuto nel tampone di lavaggio sullo shaker durante la notte a quattro gradi Celsius. Trasferire le sezioni di tessuto nel reagente di compensazione dei tessuti e ruotare delicatamente a 60 rotazioni al minuto sullo shaker per un'ora a temperatura ambiente.
Montare i tessuti trasparenti sul vetrino, quindi circondare i tessuti con un distanziatore e incollare lo spazio con il reagente di pulizia del tessuto fresco e coprire lo scivolamento. Il modello 3D ha dimostrato che le fibre nervose positive CGRP passavano attraverso il tessuto sottocutaneo e il derma fino all'epidermide. Queste fibre nervose correvano in fasci nel tessuto sottocutaneo ramificato all'interno del derma e terminato nell'epidermide.
Al contrario, la falloidina nei vasi sanguigni positivi e i vasi linfatici positivi LYVE-1 sono distribuiti nel tessuto sottocutaneo e nel derma. Generalmente le fibre nervose positive CGRP correvano parallele o circondate dai vasi sanguigni e dai vasi linfatici formando una rete 3D nella pelle pelosa e glabra. Con l'approccio convenzionale, sebbene i vasi sanguigni delle fibre nervose e i vasi linfatici fossero chiaramente etichettati con CGRP falloidina e LYVE-1 nelle sezioni sottili, l'osservazione di queste strutture era limitata dallo spessore della fetta e non può essere osservata completamente.
Nella sezione con uno spessore di 30 micrometri, non c'era differenza tra pelle pelosa e pelle glabra nella superficie delle fibre nervose positive CGRP. Nelle sezioni di tessuto spesse 300 micrometri, rispetto alla pelle pelosa, la superficie delle fibre nervose positive CGRP della pelle glabra è stata significativamente aumentata. È importante utilizzare il tampone di pulizia con un'elevata pressione osmotica dopo l'incubazione degli anticorpi.
Più volte, è necessario il tempo di pulizia richiesto per la colorazione immunofluorescenza. Seguendo questa procedura, riteniamo che esista anche la possibilità di colorazione e osservazione di altri tessuti e organi in sei sezioni. Questa tecnica potrebbe aiutare i ricercatori di neuroscienze a incontrare la superficie e lo stato delle fibre neurologiche.
Ci aiuta anche a osservare l'innovazione di tessuti e organi.
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Panoramica
Questo studio presenta una nuova tecnica di chiarificazione tissutale per la visualizzazione delle fibre nervose cutanee in sezioni tissutali spesse di 300 µm mediante microscopia confocale. Il metodo migliora lo studio morfologico dell'innervazione cutanea, superando i limiti della classica sezionatura sottile.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Imaging dei tessuti
- Microscopia confocale
Sfondo
- Lo studio dell'innervazione cutanea è fondamentale per comprendere i percorsi sensoriali.
- I metodi tradizionali sono limitati dalla sottigliezza delle sezioni di tessuto.
- La visualizzazione delle fibre nervose in sezioni più spesse può offrire informazioni più approfondite.
- Il metodo mira a migliorare la precisione e l'efficienza dell'imaging.
Scopo dello studio
- Sviluppare e validare una tecnica di chiarificazione tissutale per sezioni spesse di cute.
- Facilitare l'osservazione delle fibre nervose e del loro rapporto con i vasi sanguigni e linfatici.
- Fornire un metodo adattabile allo studio di altri tessuti e organi.
Metodi Utilizzati
- La microscopia confocale è stata utilizzata per visualizzare le fibre nervose in sezioni di tessuto trasparentizzato.
- Il modello biologico prevedeva ratti sacrificati, osservando in particolare la pelle del dorso e della zampa posteriore.
- I passaggi principali includevano la perfusione del tessuto, l'inclusione, la colorazione con anticorpi e la trasparentizzazione del tessuto.
- L'intero protocollo di preparazione e acquisizione delle immagini richiede tipicamente da 30 minuti a un'ora.
Risultati principali
- La tecnica di chiarificazione ha rivelato con successo le fibre nervose positive per CGRP che formano una rete tridimensionale all'interno della cute.
- I risultati hanno indicato differenze significative nella distribuzione delle fibre nervose tra cute pelosa e cute glabra.
- Il metodo ha permesso un'osservazione dettagliata delle relazioni strutturali con i vasi sanguigni e linfatici.
- Le fibre positive per CGRP si sono dimostrate correre parallele o circondare i vasi sanguigni e linfatici.
Conclusioni
- Questa tecnica migliora la capacità di visualizzare e studiare in modo completo l'innervazione cutanea.
- La visualizzazione migliorata potrebbe fornire informazioni preziose sui meccanismi neurobiologici.
- Le applicazioni potenziali si estendono a diversi tessuti, favorendo ricerche più ampie in neuroscienze.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La visualizzazione tridimensionale dell'innervazione cutanea mediante sezioni di tessuto spesse e colorazione fluorescente multiplex risolve un'importante lacuna nel mappaggio dell'architettura dei nervi periferici. Questo approccio aumenta la fiducia predittiva nella fase iniziale della scoperta, consentendo un'analisi completa delle interazioni tra nervi, vasi sanguigni e vasi linfatici in modelli cutanei rilevanti per la patologia. Il metodo favorisce la continuità traslazionale nei portafogli di ricerca e sviluppo incentrati sulla neurobiologia e sulla dermatologia.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette una mappatura dettagliata della distribuzione delle fibre nervose sensoriali sia nella pelle pelosa che in quella glabra.
- Supporta la riduzione del rischio meccanicistico chiarificando le relazioni spaziali tra nervi e vascolarizzazione.
- Migliora la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi nella ricerca sul sistema nervoso periferico.
Sviluppo di screening e saggi
- Facilita la preparazione di modelli cutanei tridimensionali validati per analisi fenotipiche successive.
- Migliora la riproducibilità dei saggi standardizzando i protocolli di chiarificazione e colorazione dei tessuti.
- Fornisce output quantitativi sull'area superficiale delle fibre nervose e sulla complessità della rete.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a sistemi rilevanti per la malattia modellando l'innervazione della pelle pelosa e glabra.
- Permette una continuità dalla scoperta alla validazione preclinica di bersagli neurocutanei.
- Supporta un avanzamento basato sulla valutazione del rischio rivelando biomarcatori strutturali nel tessuto cutaneo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo di imaging multiplex si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, collegando studi meccanicistici iniziali allo sviluppo di modelli traslazionali.
- Biologia della scoperta: Permette di avanzare nella verifica di ipotesi sulle interazioni nervo-vascolari nella pelle.
- Screening: Fornisce letture quantitative e riproducibili in 3D per lo sviluppo di saggi.
- Analisi: Offre misurazioni della superficie e mappatura delle reti per analisi comparative.
- Ricerca traslazionale: Supporta l'allineamento di biomarcatori in modelli di pelle rilevanti per le malattie.
- Riutilizzo aziendale: Offre un protocollo standardizzato adattabile ad altri tessuti e sistemi organici.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità nella mappatura dei nervi.
- Valore operativo: Ottimizza la lavorazione dei tessuti con protocolli efficienti di chiarificazione e colorazione.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di proseguimento/cessazione fornendo dati tridimensionali solidi per la valutazione degli obiettivi.
- Impatto sul portafoglio: Consente una priorizzazione adeguata ai rischi dei programmi neurocutanei e dermatologici.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in microscopia confocale e immunofluorescenza multiplex.
- Necessita di accesso a reagenti per la trasparenza dei tessuti e a infrastrutture per l'acquisizione di immagini.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per i protocolli di marcatura e di chiarificazione.
- Adattabile a diversi tipi di tessuto mediante ottimizzazione del protocollo.
- Dipende dalla qualità degli anticorpi e dall'efficienza del processo di chiarificazione per ottenere risultati ottimali.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:43
Perfusion, Triple Fluorescent Staining, and Tissue Clearing Treatment
3:10
Results: Enhanced Understanding of the Skin Innervation via Immunofluorescence and a 3D View of the Cutaneous Nerve Fibers in the Hairy and Glabrous Skin
4:31
Conclusion
