Chip glomerulo renale isogenico ingegnerizzato da cellule staminali pluripotenti indotte umane

Il chip glomerulo isogenico consentirà la modellazione della malattia specifica del paziente e test di nefrotossicità e applicazioni avanzate di medicina di precisione. L'epitelio glomerulare e l'endotelio derivano da una singola popolazione di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo, o IPSC. Gli IPSC possiedono un auto-rinnovamento illimitato e possono differenziarsi in quasi tutti i tipi di cellule.

Questa tecnica può essere utilizzata per valutare fenotipi cellulari patologici e malattie. Il chip dell'organo specifico del paziente può anche servire come piattaforma per lo screening dei farmaci e gli studi meccanicistici. Questo modello può essere applicato allo sviluppo di un sistema body on chip personalizzato per un paziente specifico.

Questo sistema ha il potenziale per prevedere le risposte specifiche del paziente prima dei test clinici. Iniziare aggiungendo delicatamente 25 microlitri di soluzione di matrice di membrana basale 2 al canale urinario e 20 microlitri nel canale capillare del chip. Prendi due tappi conici sterili da 15 millilitri e riempili con 500 microlitri di acqua distillata sterile.

Posizionare il tappo nella capsula di Petri per evitare l'essiccazione e posizionare il coperchio sul piatto. Incubarlo a 37 gradi Celsius durante la notte. Procedere, aspirare il terreno da palloni T75 contenenti una coltura di 15 giorni di cellule endoteliali vascolari al 90% di confluenza.

Aggiungere cinque millilitri di tampone di distacco cellulare e incubare a 37 gradi Celsius per cinque-sette minuti. Quindi trasferire le celle in un tubo conico da 15 millilitri e aggiungere cinque millilitri di DMEM / F-12. Centrifugare a 200 volte G per cinque minuti.

Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 300 microlitri di terreno di mantenimento endoteliale. Contare le cellule con un emocitometro per ottenere circa 2 milioni di cellule. Utilizzando una punta barriera P200, lavare entrambi i canali superiore e inferiore del chip microfluidico con 200 microlitri di DMEM / F-12 aspirando contemporaneamente dalla periferia della presa.

Tenere saldamente il chip con la punta di barriera P200 fissata all'aspiratore lontano dall'uscita del canale inferiore. Iniettare con decisione 20 microlitri della sospensione di cellule endoteliali vascolari nel canale capillare del chip e aspirare accuratamente il mezzo dalla periferia della presa. Controllare al microscopio la presenza di bolle o di una densità di semina irregolare.

Capovolgere delicatamente il chip in modo che le cellule possano aderire al lato basale della membrana PDMS flessibile. Inserire il chip nella cartuccia del supporto e aggiungere tre millilitri di PBS nella cartuccia per evitare che la membrana si asciughi. Incubare il chip a 37 gradi Celsius per tre ore.

Controllare il canale inferiore sotto il microscopio per uno strato confluente di cellule attaccate alla membrana flessibile PDMS. Lavare le cellule non attaccate aggiungendo 200 microlitri di mezzo di mantenimento endoteliale sull'ingresso del canale inferiore mentre si aspira dalla periferia dell'uscita del canale capillare. Rimettere il chip nella cartuccia del supporto e incubare a 37 gradi Celsius durante la notte.

Il giorno successivo, lavare delicatamente il canale capillare con 200 microlitri di mezzo di mantenimento endoteliale. Lavare il canale urinario con 200 microlitri di DMEM/F-12 e far cadere 50 microlitri di DMEM/F-12 sulle porte di ingresso e di uscita. Procedendo cellule mesodermiche intermedie, sostituire il mezzo intermedio di induzione del mesoderma da ciascun pozzetto della piastra a 12 pozzetti con un millilitro di Trypsin EDTA e incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti.

Raschiare delicatamente le cellule usando un sollevatore cellulare e dissociare le cellule usando il pipettaggio. Aggiungere due millilitri di soluzione di neutralizzazione della tripsina a ciascun pozzetto e trasferire le cellule in un tubo conico da 50 millilitri. Portare il volume della sospensione cellulare a 50 millilitri con DMEM / F-12 e centrifugare a 200 volte G per cinque minuti.

Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 500 microlitri di mezzo intermedio di induzione del mesoderma per ottenere circa 3 milioni di cellule. Contare le cellule con un emocitometro. Tenere il chip e iniettare saldamente 25 microlitri di sospensione cellulare nel canale urinario del chip aspirando attentamente il terreno dalla periferia dell'uscita.

Verificare la presenza di bolle o densità di semina delle celle non uniforme. Aggiungere tre millilitri di PBS nella cartuccia portachip e incubare a 37 gradi Celsius per tre ore. Dopo l'incubazione, lavare entrambi i canali con 200 microlitri dei rispettivi terreni di coltura cellulare.

Attaccare punte di barriera P200 vuote in entrambe le uscite dei canali urinario e capillare. Pipettare 200 microlitri di mezzo di mantenimento endoteliale e iniettarne metà nell'ingresso del canale capillare. Rilasciare la punta della pipetta all'interno dell'ingresso in modo che sia l'ingresso che l'uscita del canale siano collegati alle punte delle pipette riempite con il fluido.

Ripetere questa procedura per l'ingresso del canale urinario con 200 microlitri di mezzo intermedio di mantenimento del mesoderma. Incubare i chip con punte incorporate a 37 gradi Celsius durante la notte. Per collegare i chip al bioreattore del chip d'organo, in primo luogo, rimuovere le punte P200 dai canali.

Aggiungere goccioline dei rispettivi mezzi all'ingresso e all'uscita dei canali urinario e capillare per prevenire l'essiccazione. Aggiungere tre millilitri di mezzo di induzione del podocita caldo al serbatoio di ingresso urinario e tre millilitri di mezzo di mantenimento endoteliale caldo al serbatoio di ingresso capillare. Aggiungere 300 microlitri dei rispettivi fluidi ai serbatoi di uscita direttamente sopra la porta di uscita.

Far scorrere i baccelli sul vassoio e nel bioreattore del chip dell'organo. Utilizzare la manopola per selezionare e avviare il ciclo primo per due minuti. Ispezionare visivamente la parte inferiore del pod per individuare piccole goccioline in tutte e quattro le porte fluidiche.

Per ottenere un contatto fluido-fluido tra la parte inferiore del pod e le porte del chip microfluidico, far scorrere delicatamente il portachip nel pod. Premere delicatamente la linguetta del portachip verso l'interno e verso l'alto. Aspirare il mezzo in eccesso dalla superficie del chip.

Impostare la portata del bioreattore del chip d'organo a 60 microlitri all'ora. Impostare la deformazione ciclica su 10% a 0,4 hertz. Utilizzare il quadrante rotante sul bioreattore del chip dell'organo per selezionare il ciclo di regolazione e funzionare per due ore.

Ispezionare visivamente i serbatoi di uscita per un aumento del livello del mezzo. Utilizzare il quadrante rotante sul bioreattore del chip dell'organo per selezionare il ciclo di regolazione. Dopo il giorno 17 di coltura, aspirare quotidianamente il terreno dai serbatoi di uscita del canale urinario in diagonale lontano dal porto, ma mantenere un po 'di terreno nel serbatoio.

Ricostituire il serbatoio di ingresso del canale urinario con un massimo di tre millilitri di terreno di induzione del podocita ogni due giorni per cinque giorni. Dopo cinque giorni, aspirare il mezzo dal canale urinario ma mantenere un po 'di terreno nel serbatoio. Ricostituire quotidianamente il serbatoio di ingresso del canale urinario con tre millilitri di mezzo di mantenimento del podocita.

Allo stesso modo, aspirare il mezzo dall'uscita del canale capillare e ricostituire quotidianamente i serbatoi di ingresso con il mezzo di mantenimento endoteliale. Utilizzando questo protocollo sono state utilizzate cellule staminali pluripotenti indotte umane per sviluppare un modello funzionale in vitro del glomerulo propagando cellule endoteliali vascolari e podociti. Il giorno 21 dopo l'induzione del podocita e la propagazione dell'endotelio vascolare, le cellule all'interno dei chip hanno espresso marcatori di identificazione della linea come Podocin e Nefrina per i podociti, VE Cadherin e PECAM-1 per le cellule endoteliali vascolari.

Sia il podocita che gli strati cellulari endoteliali vascolari esprimevano collagene IV che è la proteina GBM più abbondante nel glomerulo renale. I chip del glomerulo filtrano selettivamente piccole molecole come l'inulina dal capillare nel canale urinario, impedendo al contempo alle proteine di grandi dimensioni come l'albumina di lasciare il canale capillare, mostrando una funzione di filtrazione molecolare selettiva. Durante l'induzione endoteliale nei giorni da quattro a sette, un aumento del numero di cellule può provocare uno strato secondario di cellule, ma l'eccessiva semina può causare aggregazione che può impedire la differenziazione.

Un flusso incrociato inaspettato del fluido tra i canali urinario e capillare può essere osservato in caso di legame inadeguato dei componenti del chip PDMS, blocco nel percorso del flusso del fluido o barriera di filtrazione compromessa. Quando si seminano endotelio ed epitelio e si mantengono i trucioli dai giorni 15 in poi, è importante ispezionare visivamente le bolle d'aria nei canali in ogni fase. Nel chip del glomerulo isogenico, possono essere somministrati farmaci candidati clinicamente rilevanti per testare il loro potenziale terapeutico o i livelli di tossicità.

Questa tecnica offre ora opportunità per comprendere le basi genetiche della malattia renale umana e sviluppare terapie personalizzate.