Name: Somministrazione mediata da elettroporazione di ribonucleoproteine Cas9 e mRNA in epatociti primari di topo appena isolati (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T13:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Impara l'editing genico CRISPR-Cas9 mediante elettroporazione di ribonucleoproteine in epatociti primari di topo appena isolati. Questo metodo consente di generare modelli di malattie metaboliche epatiche con alta efficienza.

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RNC ha ricevuto finanziamenti dal South Carolina Bioengineering Center of Regeneration and Formation of Tissues Pilot grant sostenuto dal National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) del National Institutes of Health, dall'American Association for the Study of Liver Diseases Foundation e dall'American Society of Gene & Cell Therapy con i numeri di sovvenzione P30 GM131959, 2021000920, e 2022000099, rispettivamente. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali dell'American Society of Gene & Cell Therapy o dell'American Association for the Study of Liver Diseases Foundation. Lo schema per la Figura 1 è stato creato con BioRender.com.

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Gli autori non hanno interessi concorrenti da divulgare.

I passaggi delineati nel protocollo per l'isolamento degli epatociti sono impegnativi e richiedono pratica per la competenza. Ci sono diversi passaggi chiave per il successo dell'isolamento degli epatociti dal fegato. In primo luogo, una corretta cannulazione della vena cava inferiore è essenziale per la completa perfusione epatica. L'assenza di sbiancamento nel fegato dopo la perfusione indica lo spostamento del catetere (Tabella 1). La vena cava inferiore (perfusione retrograda) è stata cannulata nella...

Le IMD del fegato sono malattie genetiche caratterizzate dalla carenza di un enzima epatico cruciale coinvolto nel metabolismo che porta all'accumulo di metaboliti tossici. Senza trattamento, le IMD del fegato provocano insufficienza d'organo o morte prematura 1,2. L'unica opzione curativa per i pazienti con IMD del fegato è il trapianto di fegato ortotopico, che è limitato a causa della scarsa disponibilità di organi donatori e delle complicanze della terapia immunosoppressiva a seguito della procedura 3,4. Secondo i recenti dati raccolti dall'Organ Procurement and Transplantation Network, solo il 40%-46% dei pazienti adulti in lista d'attesa per il trapianto di fegato riceve un organo, mentre il 12,3% di questi pazienti muore mentre è in lista d'attesa5. Inoltre, solo il 5% di tutte le malattie rare del fegato ha un trattamento approvato dalla FDA6. È chiaro che c'è un bisogno critico di nuovi trattamenti per gli IMD del fegato. Tuttavia, sono necessari modelli di malattia appropriati per sviluppare nuove opzioni terapeutiche.
La modellazione delle malattie umane utilizzando sistemi in vitro e in vivo rimane un ostacolo per lo sviluppo di terapie efficaci e lo studio della patologia delle IMD del fegato. Gli epatociti provenienti da pazienti con malattie rare del fegato sono difficili da ottenere7. I modelli animali sono cruciali per sviluppare una comprensione della patologia della malattia e per testare strategie terapeutiche. Tuttavia, un ostacolo è la generazione di modelli da embrioni portatori di mutazioni letali. Ad esempio, i tentativi di creare modelli murini della sindrome di Alagille (ALGS) con embrioni contenenti delezioni omozigoti di una sequenza di 5 kb vicino alla fine 5′-end del gene Jag1 hanno provocato la morte precoce degli embrioni8. Inoltre, la generazione di modelli murini mediante modifica genetica in cellule staminali embrionali può richiedere molto tempo e risorse9. Infine, le mutazioni appariranno al di fuori del tessuto bersaglio, portando a variabili confondenti che possono impedire lo studio della malattia9. L'editing genetico somatico consentirebbe una modifica più semplice nel tessuto epatico e bypasserebbe le sfide associate alla generazione di modelli che utilizzano cellule staminali embrionali.
L'elettroporazione consente la consegna di CRISPR-Cas9 direttamente nel nucleo applicando correnti ad alta tensione per permeabilizzare la membrana cellulare ed è compatibile con molti tipi di cellule, comprese quelle che sono intransigenti alle tecniche di trasfezione, come le cellule staminali embrionali umane, le cellule staminali pluripotenti e i neuroni 10,11,12 . Tuttavia, la bassa redditività è un potenziale svantaggio dell'elettroporazione; l'ottimizzazione della procedura può produrre alti livelli di consegna limitando la tossicità13. Un recente studio dimostra la fattibilità dell'elettroporazione dei componenti CRISPR-Cas9 in epatociti primari di topo e umani come approccio altamente efficiente14. L'elettroporazione ex vivo negli epatociti ha il potenziale per essere applicata per generare nuovi modelli murini per imD umani del fegato.
Questo protocollo fornisce una procedura dettagliata passo-passo per isolare gli epatociti di topo dal fegato e successivamente elettroporare CRISPR-Cas9 come complessi RNP, costituiti da proteina Cas9 e RNA sintetico a guida singola (sgRNA), o mRNA Cas9 combinato con sgRNA per ottenere alti livelli di editing genico on-target. Inoltre, il protocollo fornisce metodi per quantificare l'efficienza, la vitalità e la funzionalità dell'editing genetico dopo l'elettroporazione di CRISPR-Cas9 in epatociti di topo appena isolati.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,2 mL PCR Striscia FLEX-FREE a 8 provette, cappucci piatti trasparenti attaccati, naturale</td><td>USA Scientific</td><td>1402-4700</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di collagene a 6 pozzetti</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5073</td><td></td></tr><tr><td>accuSpin Micro 17R</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-675</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente all-in-one</td><td>Keyence</td><td>BZ-X810</td><td></td></tr><tr><td>Miscelatore a vortice analogico</td><td>VWR</td><td>97043-562</td><td></td></tr><tr><td>ART Punte filtrate a foro largo 1.000 &; L</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2079GPK</td><td></td></tr><tr><td>Contatore cellulare automatizzato</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>TC20</td><td></td></tr><tr><td>Vassoio di dissezione in cera blu</td><td>Braintree Scientific Inc.</td><td>DTW1</td><td>9" x 6,5" x 1/2"+F21</td></tr><tr><td>Raschietto/sollevatore cellulare</td><td>Argos Technologies</td><td>UX-04396-53</td><td>Provette coniche sterili e apirogene</td></tr><tr><td>(15 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche (50 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Applicatori in cotone</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-170</td><td></td></tr><tr><td>Curvo forbici</td><td>Cooper Surgical</td><td>62131</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri monouso</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td>100mm, sterili</td></tr><tr><td>Piastre di Petri monouso</td><td>VWR</td><td>25373-100</td><td>35mm, sterili</td></tr><tr><td>Spettrofotometro per micropiastre Epoch</td><td>BioTek Instruments</td><td>250082</td><td></td></tr><tr><td>Filtro cellulare Falcon (70 &; m)</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Pinze</td><td>Cooper Surgical</td><td>61864</td><td>Euro-Med Adson Pinze tissutali</td></tr><tr><td>Cateteri IV&nbsp;</td><td>BD</td><td>382612</td><td>24 G x 0,75 in</td></tr><tr><td>set di infusione endovenosa</td><td>Baxter</td><td>2C6401</td><td></td></tr><tr><td>MyFuge 12 Mini Centrifuge</td><td>Benchmark Scientific</td><td>1220P38</td><td></td></tr><tr><td>Aghi</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-561-20</td><td>25 G</td></tr><tr><td>Nucleofector 2b Dispositivo</td><td>Lonza</td><td>AAB-1001</td><td>Programma T-028 è stato utilizzato per l'elettroporazione negli epatociti di topo</td></tr><tr><td>Pompa peristaltica</td><td>Masterflex</td><td>&nbsp; HV-77120-42</td><td>da 10 a 60 giri/min; da 90 a 260 V c.a.</td></tr><tr><td>Tubo per pompa</td><td>di precisione Masterflex</td><td>HV-96410-14</td> Piastre per colture primarie in <td>silicone da 25 piedi</td></tr><tr><td></td><td>Corning Life Sciences</td><td>353846</td><td>Piastre per colture tissutali contenenti azoto</td></tr><tr><td>Pipette sierologiche (25 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-567-604</td><td></td></tr><tr><td>Siringhe</td><td>BD</td><td>329464</td><td>1 mL, sterili</td></tr><tr><td>Termociclatore T100</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Bagno d'acqua</td><td>ALT</td><td>27577</td><td>Thermo Scientific Precision Controllato da microprocessore serie 280, 2,5 L</td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3</td><td>IDT</td><td>1081058</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter AMPure XP, 5 mL</td><td>Fisher Scientific NC9959336</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CleanCap Cas9 mRNA</td><td>Trilink Biotechnologies</td><td>L-7606-100</td><td></td></tr><tr><td>CleanCap&nbsp; EGFP mRNA</td><td>Trilink Biotechnologies</td><td>L-7201-100</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Matrix</td><td>Corning Life Sciences</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher Scientific 11885076</td><td></td><td>Basso glucosio, piruvato</td></tr><tr><td>Etanolo 70%</td><td>VWR</td><td>71001-652</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Thermoscientific</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Mantenimento degli epatociti Medium (MM)</td><td>Lonza</td><td>MM250</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di placcatura degli epatociti (PM)</td><td>Lonza</td><td>MP100</td><td></td></tr><tr><td>Kit ELISA per albumina di topo</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0010653</td><td></td></tr><tr><td>Kit per nucleocarcinoma di epatociti di topo/ratto</td><td>Lonza</td><td>VPL-1004</td><td></td></tr><tr><td>OneTaq HotStart DNA polimerasi</td><td>New England Biolabs</td><td>M0481L</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x pH 7.4&nbsp;</td><td>Thermoscientific</td><td>70011-044</td><td>Senza cloruro di calcio o magnesio</td></tr><tr><td>Percoll (soluzione PVP)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-500790A</td><td></td></tr><tr><td>Acido periodico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7875-25G</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio Permount</td><td>VWR</td><td>100496-550</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di estrazione del DNA QuickExtract</td><td>Lucigen Corporation</td><td>QE05090</td><td></td></tr><tr><td>Schiff' s reagente fucsina-solfito</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5133</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200056</td><td>Fenolo rosso</td></tr><tr><td>Vybrant MTT Cell Viability Assay</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V13154</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion Solution 1 (pH 7,4, filtro sterilizzato)&nbsp; </forte></td><td></td><td></td><td>Stabile a 4 gradi C per 2 mesi</td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Fisher Scientific</td><td>14155063</td><td>Completo a 200 mL</td></tr><tr><td>EGTA (0,5 M)</td><td>Bioworld</td><td>40520008-1</td><td>200 &micro; L</td></tr><tr><td>HEPES (pH 7,3, 1 M)</td><td>ThermoFisher Scientific AAJ16924AE</td><td></td><td>2 mL&nbsp;</td></tr><tr><td>Soluzione di perfusione 2 (pH 7,4, filtro sterilizzato)&nbsp; </forte></td><td></td><td></td><td>Stabile a 4 gradi C per 2 mesi</td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H20 (1,8 mM)</td><td>Sigma</td><td>C7902-500G</td><td>360 &; L di 1 M di magazzino&nbsp;</td></tr><tr><td>EBSS (senza calcio, senza magnesio, senza rosso fenolo)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-155-063</td><td>Completo fino a 200 mL</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AAJ16924AE</td><td>2 mL&nbsp;</td></tr><tr><td>MgSO4&middot; 7H20 (0,8 mM)</td><td>Sigma</td><td>30391-25G</td><td>160 &; L di 1 M</td></tr> <tr><td>stockPerfusion Solution 3&nbsp; </td><td></td><td></td><td>Preparato fresco prima dell'uso</td></tr><tr><td>Soluzione 2</td><td></td><td></td><td>50 mL</td></tr><tr><td>Liberase</td><td>Roche</td><td>5401127001</td><td>0,094 unità Wunsch/mL</td></tr><tr><td>Cocktail anestetico per topi&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acepromzine</td><td></td><td></td><td>0,25 mg/mL concentrazione finale</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td></td><td></td><td>7,5 mg/mL concentrazione finale</td></tr><tr><td>Xilazina</td><td></td><td></td><td>1,5 mg/mL concentrazione finale</td></tr><tr><td>Software</td><td>URL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benchling</td><td>https://www.benchling.com/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ImageJ</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>TIDE: Tracciamento di Indels mediante decomposizione</td><td>https://tide.nki.nl/</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

somministrazione mediata da elettroporazione di ribonucleoproteine cas9 e mrna in epatociti primari di topo appena isolati

Electroporation-Mediated Delivery of Cas9 Ribonucleoproteins and mRNA into Freshly Isolated Primary Mouse Hepatocytes

Questo protocollo descrive un metodo rapido ed efficace per isolare gli epatociti primari del topo seguito dalla somministrazione mediata dall'elettroporazione di CRISPR-Cas9 come ribonucleoproteine (RNP) e mRNA. Gli epatociti primari di topo sono stati isolati utilizzando un metodo di perfusione retrograda in tre fasi con conseguenti rese elevate fino a 50 × 106 cellule per fegato e vitalità cellulare di >85%. Questo protocollo fornisce istruzioni dettagliate per la placcatura, la colorazione e la coltura degli epatociti. I risultati indicano che l'elettroporazione fornisce un'elevata efficienza di trasfezione dell'89%, misurata dalla percentuale di cellule positive alla proteina fluorescente verde (GFP) e dalla modesta vitalità cellulare di >35% negli epatociti di topo.
Per dimostrare l'utilità di questo approccio, CRISPR-Cas9 mirato al gene dell'idrossifenilpiruvato diossigenasi è stato elettroporato in epatociti primari di topo come modifica genetica proof-of-principle per interrompere un gene terapeutico correlato a una malattia metabolica ereditaria (IMD) del fegato. Un editing on-target più elevato del 78% è stato osservato per gli RNP rispetto al 47% di efficienza di editing con mRNA. La funzionalità degli epatociti è stata valutata in vitro utilizzando un test dell'albumina che ha indicato che la somministrazione di CRISPR-Cas9 come RNP e mRNA si traduce in una vitalità cellulare comparabile negli epatociti primari di topo. Un'applicazione promettente per questo protocollo è la generazione di modelli murini per le malattie genetiche umane che colpiscono il fegato.

Isolamento degli epatociti primari piastrizzabili dal fegato Il processo complessivo di perfusione epatica e isolamento degli epatociti è illustrato nella Figura 1. In questo esperimento sono stati utilizzati topi C57BL6/6J di tipo selvatico di 8-10 settimane. La procedura dovrebbe produrre 20-50 × 106 cellule per topo con una vitalità compresa tra l'85% e il 95%. Se la vitalità è &lt;70%, deve essere seguito il trattamento percoll per rimuovere le cellule mort...

Questo protocollo descrive le tecniche per isolare gli epatociti primari di topo dal fegato e l'elettroporazione di CRISPR-Cas9 come ribonucleoproteine e mRNA per interrompere un gene bersaglio terapeutico associato a una malattia metabolica ereditaria del fegato. I metodi descritti determinano un'elevata vitalità e alti livelli di modificazione genica dopo l'elettroporazione.

Somministrazione mediata da elettroporazione di ribonucleoproteine Cas9 e mRNA in epatociti primari di topo appena isolati

This protocol describes a fast and effective method for isolating primary mouse hepatocytes followed by electroporation-mediated delivery of CRISPR-Cas9 ...

Il vantaggio principale della nostra tecnica è che si tratta di un approccio facile, veloce e riproducibile per la modifica dei geni negli epatociti primari di topo come un modo per generare modelli di malattia in vitro e in vivo. Utilizzando la nostra tecnica, potrebbe essere possibile abbattere un gene bersaglio in epatociti isolati e quindi trapiantarli di nuovo nel paziente, per sostituire le cellule malate con epatociti geneticamente modificati I ricercatori inesperti potrebbero lottare con l'incannulamento e mantenere il catetere stabile durante la perfusione. Si consiglia agli utenti di leggere attentamente e praticare la procedura e i metodi di risoluzione dei problemi prima di iniziare.A dimostrare la perfusione epatica e l'isolamento degli epatociti saranno Tina Parker, responsabile della struttura clinica, e Ilayda Ates, assistente di ricerca laureata. La procedura di elettroporazione sarà dimostrata da Callie Stuart, un'assistente di ricerca laureata del mio laboratorio. Sotto un piano chirurgico di anestesia.Iniziare la perfusione epatica facendo un'incisione laterale a forma di U nella pelle dell'addome usando le forbici ed espandere il foro attraverso i lati. Continuare ad aprire la pelle alla gabbia toracica. Usando le forbici, tagliare il peritoneo per esporre la cavità addominale fino alla gabbia toracica.Fare attenzione a non intaccare alcun organo. Sposta l'intestino sul lato destro usando il dorso del forcipe o la superficie smussata delle forbici. Identificare la vena porta e la vena cava inferiore.Avviare la pompa per lavare la soluzione di perfusione preriscaldata attraverso il catetere. Arrestare la pompa e rimuovere il catetere. Quindi inserire la punta dell'ago collegata al catetere nella vena cava inferiore con un angolo da 10 a 20 gradi rispetto alla vena, rimuovere l'ago dal catetere.Quindi spingere delicatamente il catetere nella vena in un movimento parallelo alla vena. Collegare il tubo al catetere senza spostare ulteriormente il catetere nella vena. Avviare la pompa con una portata di due millilitri al minuto.Cerca che il fegato diventi immediatamente pallido come segno che la perfusione ha successo. Taglia la vena porta usando le forbici. Aumentare gradualmente la portata a cinque millilitri al minuto.Una volta che la soluzione di perfusione tre scorre attraverso monitorare attentamente l'elasticità del fegato. Per determinare se il fegato si è ammorbidito, premere delicatamente il fegato con un batuffolo di cotone o una pinza e verificare se si formano rientranze sul fegato. Fare attenzione a non perfondere eccessivamente per evitare la perdita di vitalità cellulare.Una volta che il fegato si ammorbidisce dopo 30-50 millilitri di soluzione di perfusione, tre è fluito attraverso, fermare la pompa, rimuovere il catetere e la cistifellea. Attenzione a non rovesciare il suo contenuto. Quindi sezionare attentamente il fegato.Posizionare il fegato in una capsula di Petri da 100 millimetri contenente DME M ghiacciato con mezzo FBS al 10%. Ruotare delicatamente la piastra di Petri per rimuovere eventuali coaguli di sangue. Trasferire il fegato in una nuova capsula di Petri contenente DME M ghiacciato e mezzo FBS al 10%.Per liberare le cellule dalla capsula epatica, posizionare la capsula di Petri sul ghiaccio, quindi utilizzando due paia di pinze sterili, strappare delicatamente la capsula epatica su tutti i lobi. Ruotare delicatamente il fegato nel mezzo usando un sollevatore cellulare per rilasciare gli epatociti. Continuare questo movimento fino a quando il fegato diventa molto piccolo e la sospensione diventa marrone e opaca.Rimuovere i resti di tessuto epatico dalla piastra e utilizzando una pipetta sierologica da 25 millilitri impostata a bassa velocità, trasferire con cautela la sospensione cellulare in un tubo conico da 50 millilitri pre-raffreddato su ghiaccio e dotato di un filtro cellulare da 100 micrometri. Aggiungere DMEM ghiacciato fresco e 10% di terreno FBS alla capsula di Petri per lavare e raccogliere le cellule rimanenti dalla superficie. Quindi, trasferire sul tubo conico da 50 millilitri.Ripetere questo passaggio fino a raccogliere tutte le celle. Per lavare e purificare gli epatociti da cellule non parenchimali, centrifugare le cellule raccolte nel tubo conico da 50 millilitri a 50 RCF a quattro gradi Celsius per cinque minuti a bassa decelerazione o senza interruzioni. Scartare il super-naton contenente detriti e cellule non parenchimali.Quindi risospendere il pellet nel super-naton rimanente ruotando delicatamente il tubo. Dopo la risospensione del pellet aggiungere 30 millilitri di DMEM fresco ghiacciato e il 10% di mezzo FBS. Iniziare a preparare il supporto dei substrati CRISPR CAS 9, le celle e lo strumento di elettroporazione accendendo il pulsante di accensione sul dispositivo di elettroporazione.Quindi impostare il programma di elettroporazione premendo il pulsante X e quindi il pulsante freccia giù fino a quando il programma T 0 28 appare sullo schermo. Preparato i pozzetti di destinazione per gli epatociti elettroporati aggiungendo 1,5 millilitri di PM a sei piastre rivestite di collagene a segno. Incubare le piastre in un'incubatrice a 37 gradi Celsius fino al momento dell'uso.In provette split strip PCR, preparare i complessi CAS 9 RMP e mRNA come descritto nel manoscritto testuale. Conservare la miscela di mRNA SG RNA su ghiaccio fino all'elettroporazione. Separatamente, preparare una provetta contenente un microgrammo di mRNA E G F P per verificare il successo dell'elettroporazione utilizzando la microscopia a fluorescenza.Centrifugare la reazione di elettroporazione a 100 RCF per due minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il supernaton dal pellet cellulare e aggiungere 100 microlitri di soluzione nucleoffection per reazione lungo il lato della parete del tubo. Risospendere gli epatociti nella soluzione di elettroporazione facendo oscillare delicatamente il tubo a mano.Una volta che gli epatociti sono uniformemente dispersi nella soluzione di elettroporazione, trasferire 100 microlitri della sospensione di epatociti ai tubi a striscia contenenti i nove complessi CAS. Trasferire il contenuto del pozzetto della striscia in un recipiente di elettroporazione. Posizionare il recipiente nucleo-vet nella fessura del dispositivo di elettroporazione.Elettroporare gli epatociti premendo il pulsante X. Dopo l'elettroporazione, attendi che sul dispositivo venga visualizzata una schermata che dice: Ok. Premere nuovamente il pulsante X e rimuovere il recipiente.Incubare il vaso elettropolato sul ghiaccio per 15 minuti. Aggiungere 500 microlitri di PM al recipiente di elettroporazione. Trasferire 300 microlitri della reazione di elettroporazione a ciascuna destinazione pozzetto sulla piastra preriscaldata.Incubare le piastre durante la notte a 37 gradi Celsius. Aggiungere la matrice della membrana al mezzo di mantenimento degli epatociti ghiacciati e mescolare pipettando su e giù 10 volte. Rimuovere il mezzo dai pozzetti designati per l'analisi di editing genetico 24 ore dopo aver placcato le cellule.Pipettare lentamente la miscela sovrapposta sopra le celle e riposizionare la piastra a 37 gradi Celsius. A 24 ore dalla placcatura, trasferire il mezzo condizionato dal pozzo designato per i saggi MTT e albumina e conservare in una provetta microfuga fino al momento di eseguire il test dell'albumina. Procedere con l'analisi dell'attività target CAS nove estraendo il DNA genomico e impostando la PCR come descritto nel manoscritto testuale.Entro 3-12 ore dalla placcatura gli epatociti hanno aderito alla piastra e la morfologia cellulare ha assunto un tipico aspetto poligonale o esagonale entro 24 ore La purezza delle cellule isolate è stata verificata tramite colorazione con glicogeno utilizzando il reagente periodico di spostamento acido a 24 ore dopo la placcatura. Il citoplasma degli epatociti colorati appariva magenta. Gli epatociti sono stati sottoposti a imaging 24 ore dopo l'elettroporazione e, in media, l'89,8% degli epatociti era positivo alla GFP.A tre giorni dopo l'elettroporazione CAS nove indotte nel locus HPD sono state analizzate e i risultati hanno mostrato su indels target del 47,4% negli epatociti elettroporati con CRISPR Cas nove mRNA e 78,4% indels per il CAS nove RNP. Il test MTT ha mostrato una vitalità del 35,4% e del 45,9% negli epatociti trattati con CRISPR Cas nove mRNA e R N P.Coerentemente con i risultati MTT, i livelli normalizzati di albumina erano del 31,8% negli epatociti trattati con CAS nove RNA e del 34,5% per CAS nove r p. La cosa più importante da ricordare è che un corretto incannulamento influisce su tutti i passaggi successivi e sul successo della procedura.Dopo questa procedura, gli epatociti possono essere trapiantati e topi per studiare i loro attecchimenti. Inoltre, il DNA genomico degli epatociti placcati può essere estratto per analizzare l'efficienza e la specificità dell'editing CAS nine.

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