Isolamento di lisati proteici a cellule intere da processi facciali di topo e cellule mesenchimali palatali coltivate per l'analisi delle fosfoproteine

Questo protocollo può essere utilizzato per ottenere una maggiore comprensione delle dinamiche e dei ruoli delle fosfoproteine attive durante lo sviluppo craniofacciale dei mammiferi. Questo protocollo supera la barriera comune della defosforilazione durante l'isolamento proteico da due contesti fisiologicamente rilevanti, i processi facciali del topo e le cellule mesenchimali palatali embrionali di topo in coltura. È imperativo muoversi rapidamente mantenendo tutti i reagenti e i materiali sul ghiaccio e utilizzare inibitori della fosfatasi in tutti i tamponi di lisi per mantenere l'integrità delle proteine fosforilate.

Per iniziare, posare il corpo del topo su una tavola di dissezione con il lato ventrale rivolto verso l'alto e spruzzare l'addome del topo con il 70% di etanolo. Quindi aprire la cavità addominale pizzicando e sollevando la pelle anteriore all'apertura vaginale con pinze Semken dritte. Successivamente, tagliare la pelle sollevata negli strati sottostanti con forbici chirurgiche a lama dritta con un angolo di 45 gradi su entrambi i lati per generare una forma a V che si estende a ciascuna superficie laterale all'incirca a metà strada tra i quattro arti e gli arti posteriori.