Isolamento del virus associato alle zanzare dalle zanzare raccolte sul campo

Questo protocollo è un approccio utile per isolare i virus associati alle zanzare e può aiutare in ulteriori ricerche sulla distribuzione degli agenti patogeni legati alle zanzare e sul controllo delle malattie trasmesse dalle zanzare. L'utilizzo di linee sottili per isolare i virus nel laboratorio di livello 2 di biosicurezza è più sicuro ed efficiente. A differenza di altre procedure di isolamento del virus, come l'inoculazione rossa ciclica con fluido variabile, questa tecnica non richiede la sperimentazione animale o la valutazione etica.

La contaminazione da campioni e dalle cellule prelevate durante l'incubazione può portare al fallimento dell'esperimento. Quindi, è necessario aggiungere 2% Penicillina-streptomicina-amfotericina nel mezzo per prevenire la contaminazione. Iniziare con l'aggiunta di perle di ceramica da tre millimetri, 1,5 millilitri di mezzo RPMI integrato con una soluzione di penicillina-streptomicina-amfotericina B al 2% in un tubo sterile da due millilitri posto sul ghiaccio e quindi trasferire 50 zanzare in esso.

Quindi, omogeneizzare le zanzare con un omogeneizzatore tissutale a bassa temperatura macinando per 30 secondi a 70 hertz e 4 gradi Celsius per 3 cicli. Centrifugare l'omogenato a 15.000 G per 30 minuti a 4 gradi Celsius e trasferire i surnatanti nei nuovi tubi. Per rimuovere completamente i detriti di zanzara, centrifugare nuovamente il surnatante a 15.000 G per 10 minuti a 4 gradi Celsius.

Aliquot i 200 microlitri di surnatante P0 in un tubo di stoccaggio con tappo a vite da due millilitri e conservarlo a meno 80 gradi Celsius. Per l'amplificazione del virus, utilizzare la linea cellulare di zanzara carente di RNAi Aedes albopictus C6/36 e una linea cellulare di vertebrati, rene di criceto o BHK-21 da un pallone quadrato di 75 centimetri e seminarli separatamente in 24 piastre di pozzetto. Posizionare il piatto a 24 pozzetti seminato durante la notte a 28 o 37 gradi Celsius.

Il giorno successivo, osservare le cellule al microscopio per confermare l'80-90% di confluenza in ciascun pozzetto. Preparare 500 millilitri del terreno di mantenimento della coltura cellulare integrato con antibiotici. Rimuovere il terreno di coltura cellulare dalle piastre da 24 pozzetti e aggiungere 100 microlitri del terreno di mantenimento della coltura cellulare a ciascun pozzetto.

Quindi inoculare le cellule con 100 microlitri del surnatante dell'omogenato di zanzara o P0. Incubare le piastre a 28 o 37 gradi Celsius per 60 minuti e agitare delicatamente le piastre dopo ogni 15 minuti per evitare l'essiccazione delle cellule. Una volta fatto, rimuovere il surnatante e sciacquare ogni pozzetto con 600 microlitri di terreno di mantenimento della coltura cellulare per rimuovere completamente i detriti. Quindi, aggiungere 800 microlitri di terreno di mantenimento della coltura cellulare a ciascun pozzetto prima di posizionare le piastre in un incubatore umidificato al 5% di anidride carbonica a 28 o 37 gradi Celsius per 7 giorni.

Monitorare quotidianamente lo stato delle cellule di ciascun pozzetto al microscopio. Il settimo giorno, raccogliere il surnatante di cellule noto come P1 e conservarlo a meno 80 gradi Celsius. Ripetere la procedura per raccogliere i supernatanti virali P2 e P3.

A causa dell'effetto citopatogeno, o CPE, le cellule di alcuni pozzetti muoiono e si staccano dalla superficie. Per amplificare notevolmente i virus raccogliere da 300 a 400 microlitri di surnatante dai pozzetti che mostrano l'effetto CPE e trasferirlo in una nuova piastra a sei pozzetti con confluenza cellulare dall'80 al 90% delle cellule di coltura. Infine, raccogliere e trasferire 500 microlitri di surnatante dai pozzetti della piastra a sei pozzetti ai tubi di stoccaggio con tappo a vite da due millilitri prima di conservarli a meno 80 gradi Celsius.

L'inoculazione delle cellule C6/36 con gli omogenati di zanzara P0 ha mostrato un ampio spazio intercellulare nelle cellule esfoliate a 120 ore dopo il periodo di infezione rispetto alle cellule non inoculate o di controllo. L'incubazione delle cellule BHK21 con i supernatanti virali P3 ha dimostrato una CPE visibile a 48 ore dopo l'infezione, mostrando la morte della cellula e il distacco dalla superficie in contrasto con le cellule di controllo. Primer universali disponibili in commercio o Flavivirus, Alphavirus e Bunyavirus sono stati utilizzati per generare i prodotti PCR per il surnatante virale.

Un prodotto PCR per il Bunyavirus, il virus del lago Ebinur, è stato impostato come controllo positivo. I divieti di amplificazione della PCR nelle corsie appartenenti ai Bunyavirus e il controllo positivo hanno evidenziato la possibilità della presenza di Bunyavirus nei surnatanti . Per migliorare il tasso di successo dell'isolamento del virus, mantenere una temperatura bassa durante il trasporto, l'isolamento e la macinazione del campione.

Aggiungi antibiotici quando omogeneizzi le zanzare e la cultura stessa. E gestire rapidamente la coltura durante l'incubazione e la rimozione del terreno di coltura. Oltre a questa procedura, la soluzione di macinazione può essere iniettata in un ratto ciclico o in un embrione di pollo.

Tuttavia, la procedura di affermazione solleverà preoccupazioni etiche e aumenterà le spese dell'esperimento.