Name: Isolamento dei preadipociti dagli embrioni di pulcino di pollo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Impara l'isolamento dei preadipociti dagli embrioni di pollo per studiare lo sviluppo del tessuto adiposo. Questo metodo fornisce cellule vitali con elevata capacità differenziativa per analisi funzionali.

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Gli autori ringraziano UT AgResearch e il Dipartimento di Scienze Animali per aver supportato e ottimizzato questo protocollo. Questo lavoro è stato finanziato dalla sovvenzione USDA.

<ol><li>Fryar, C. D., Carroll, M. D., Ogden, C. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFryar%2C+CD+%22Prevalence+of+overweight%2C+obesity%2C+and+severe+obesity+among+children+and+adolescents+aged+2-19+years%3A+United+States%2C+1963-1965+through+2015-2016%22">Prevalence of overweight, obesity, and severe obesity among children and adolescents aged 2-19 years: United States, 1963-1965 through 2015-2016</a>. , (2018).</li>
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<li>Farkas, K., Ratchford, I. A., Noble, R. C., Speake, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+size+and+docosahexaenoic+acid+content+of+adipocytes+during+chick+embryo+development%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids%22%5BJournal%5D)">Changes in the size and docosahexaenoic acid content of adipocytes during chick embryo development.</a> Lipids. 31 (3), 313-321 (1996).</li>
<li>Claver, J. A., Quaglia, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+morphology%2C+development%2C+and+function+of+blood+cells+in+nonmammalian+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Exotic+Pet+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comparative morphology, development, and function of blood cells in nonmammalian vertebrates.</a> Journal of Exotic Pet Medicine. 18 (2), 87-97 (2009).</li>
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<li>Nema, R., Khare, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+animal+cell+culture%3A+Advance+technology+for+modern+research%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Bioscience+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">An animal cell culture: Advance technology for modern research.</a> Advances in Bioscience and Biotechnology. 3 (3), 219-226 (2012).</li>
<li>Regassa, A., Kim, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+oleic+acid+and+chicken+serum+on+the+expression+of+adipogenic+transcription+factors+and+adipogenic+differentiation+in+hen+preadipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Effects of oleic acid and chicken serum on the expression of adipogenic transcription factors and adipogenic differentiation in hen preadipocytes.</a> Cell Biology International. 37 (9), 961-971 (2013).</li>
<li>Temkin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+crude+oil%2Fdispersant+mixture+and+dispersant+components+on+PPAR+%CE%B3+activity+in+vitro+and+in+vivo%3A+identification+of+dioctyl+sodium+sulfosuccinate+%28DOSS%3B+CAS%23+577-11-7%29+as+a+probable+obesogen%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Effects of crude oil/dispersant mixture and dispersant components on PPAR γ activity in vitro and in vivo: identification of dioctyl sodium sulfosuccinate (DOSS; CAS# 577-11-7) as a probable obesogen.</a> Environmental Health Perspectives. 124, 112-119 (2016).</li>
<li>Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHausman%2C+DB+%22Adipose+Tissue+Protocols%22">Adipose Tissue Protocols</a>. , Springer. 201-219 (2008).</li>
<li>Lee, M. J., Wu, Y., Fried, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+protocol+to+maximize+differentiation+of+human+preadipocytes+and+improve+metabolic+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity%22%5BJournal%5D)">A modified protocol to maximize differentiation of human preadipocytes and improve metabolic phenotypes.</a> Obesity. 20 (12), 2334-2340 (2012).</li>
<li>Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+study+of+adipocyte+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Isolation and study of adipocyte precursors.</a> Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).</li>
<li>Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+human+adipocyte-derived+extracellular+vesicles+using+filtration+and+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of human adipocyte-derived extracellular vesicles using filtration and ultracentrifugation.</a> Journal of Visualized Experiments. (170), e61979(2021).</li>
<li>Perlman, D., Giuffre, N. A., Brindle, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Fungizone+in+control+of+fungi+and+yeasts+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Society+for+Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Use of Fungizone in control of fungi and yeasts in tissue culture.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 106 (4), 880-883 (1961).</li>
<li>Kuhlmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prophylactic+use+of+antibiotics+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">The prophylactic use of antibiotics in cell culture.</a> Cytotechnology. 19 (2), 95-105 (1995).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Black+swimming+dots+in+cell+culture%3A+the+identity%2C+detection+method+and+judging+criteria%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Black swimming dots in cell culture: the identity, detection method and judging criteria.</a> bioRxiv. , 366906(2018).</li>
<li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFreshney%2C+RI+%22Culture+of+animal+cells%3A+a+manual+of+basic+technique+and+specialized+applications%22">Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications</a>. , John Wiley & Sons. 163-186 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Sebbene diversi protocolli ben descritti abbiano riportato l'isolamento dei preadipociti 14,15,16,17, l'isolamento per i preadipociti embrionali è stato ottimizzato, che può essere utilizzato per analisi funzionali della crescita e dello sviluppo del grasso precoce nei pulcini da carne. Questo protocollo produce progenitori embrionali di adipociti ad alta vitalità con un elevato potenziale di d...

L'obesità è una minaccia per la salute globale sia per gli adulti che per i bambini. I bambini in sovrappeso o obesi hanno circa cinque volte più probabilità di essere obesi da adulti, ponendoli a un rischio significativamente maggiore di malattie cardiovascolari, diabete e molte altre comorbidità. Circa il 13,4% dei bambini statunitensi di età compresa tra 2 e 5 anni ha l'obesità1, dimostrando che la tendenza ad accumulare grasso corporeo in eccesso può essere messa in moto molto presto nella vita. Per ragioni molto diverse, l'accumulo di tessuto adiposo in eccesso è una preoccupazione per i polli da carne (tipo carne). I polli da carne moderni sono incredibilmente efficienti ma accumulano ancora più lipidi di quanto sia fisiologicamente necessario 2,3. Questa tendenza inizia subito dopo la schiusa e spreca efficacemente mangime, il componente di produzione più costoso, allocandolo lontano dalla crescita muscolare. Pertanto, sia per i bambini che per i polli da carne, anche se per ragioni molto diverse, è necessario comprendere i fattori che influenzano lo sviluppo del tessuto adiposo e identificare modi per limitare l'espansione adiposa nelle prime fasi della vita.
Gli adipociti si formano dai preadipociti, cellule staminali derivate dal tessuto adiposo che subiscono la differenziazione per sviluppare cellule adipose mature che immagazzinano lipidi. Di conseguenza, i preadipociti in vitro sono un prezioso modello sperimentale per gli studi sull'obesità. Queste cellule, isolate dalla frazione vascolare stromale dei depositi adiposi, possono fornire una comprensione fondamentale delle vie molecolari che controllano la differenziazione degli adipociti e il metabolismo 4,5. Gli embrioni di pulcino sono un modello sperimentale favorevole negli studi sullo sviluppo perché la coltura delle uova secondo il programma desiderato rende più facile la manipolazione sperimentale, in quanto consente di ottenere embrioni senza il sacrificio della madre per osservare una serie di fasi di sviluppo degli embrioni. Inoltre, non sono necessarie complicate procedure chirurgiche e lunghi periodi di tempo per ottenere embrioni rispetto a modelli animali più grandi. Pertanto, l'embrione di pulcino presenta l'opportunità di ottenere preadipociti fin dalle prime fasi dello sviluppo del tessuto adiposo. Il tessuto adiposo sottocutaneo diventa visibile nel pulcino intorno al giorno embrionale 12 (E12) come un deposito chiaramente definito situato intorno alla coscia. Questo deposito è arricchito in preadipociti altamente proliferativi che subiscono attivamente la differenziazione sotto segnali di sviluppo per formare adipociti maturi 6,7. Il processo di differenziazione adipogenica è paragonabile tra polli e umani. Pertanto, i preadipociti isolati da embrioni di pulcino possono essere utilizzati come modello a doppio scopo per studi rilevanti per l'uomo e il pollame. Tuttavia, la resa dei preadipociti diminuisce con l'invecchiamento man mano che le cellule crescono in adipociti maturi5.
Il presente protocollo ottimizza l'isolamento dei preadipociti dal tessuto adiposo durante lo stadio (E16-E18) in cui il differenziamento adipogenico e l'ipertrofia degli adipociti sono al loro apice negli embrioni di pulcino di pollo8. Questa procedura può valutare gli effetti dei fattori a cui l'embrione in via di sviluppo è esposto in ovo, come la dieta della gallina, sullo sviluppo degli adipociti e sul potenziale adipogenico ex vivo. Può anche testare l'impatto di varie manipolazioni (ad esempio, ipossia, aggiunte di nutrienti, agonisti farmacologici e antagonisti) sull'adipogenesi o sui vari 'omes (ad esempio, trascrittoma, metaboloma, metiloma) dei progenitori degli adipociti. Come rappresentazione del primo stadio della formazione adiposa, le cellule ottenute utilizzando questo protocollo sono modelli preziosi per studi rilevanti per il pollame e l'uomo.

<table><tbody><tr><td>Pipetta da 1 mL</td><td>Eppendorf</td><td>Z683825</td><td>Pipetta monocanale, 100 - 1000 &; L</td></tr><tr><td>1 mL Puntale per pipetta</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-402</td><td></td></tr><tr><td>100% isopropanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A426P4</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>25 mL Pallone</td><td>Pyrex</td><td>4980-25</td><td></td></tr><tr><td>37% Formaldeide</td><td>Fisher Scientific</td><td>F75P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 6 pozzetti</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td>Piastra</td></tr> per <tr><td>saggi a 96 pozzetti</td> trattata con coltura tissutale <td>Costar</td><td>3632</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti, fondo nero</td><td>Costar</td><td>3603</td><td>Adipo trattato con coltura tissutaleRed</td></tr><tr><td></td><td>Lonza</td><td>PT-7009</td><td></td></tr><tr><td>Amfotericina B</td><td>Gibco</td><td>15290026</td><td></td></tr><tr><td>raschiatore da banco (Kimtechwiper)</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Su & Up</td><td>NDC 1167300334</td><td>20% soluzione di lavoro</td></tr><tr><td>Contatore di celle</td><td>Corning</td><td>6749</td><td></td></tr><tr><td>Filtro cellulare, 40 &; micro; m</td><td>SPL</td><td>93040</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugaton</td><td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>Siero di pollo</td><td>Gibco</td><td>16110082</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga coniche, 15 mL</td><td>VWR</td><td>10025-690</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga conica, 50 mL</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Cryovial</td><td>Nunc</td><td>343958</td><td></td></tr><tr><td>Pinze curve, 100 mm</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5137</td><td></td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche curve, 115 mm</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-6839</td><td></td></tr><tr><td>Acqua distillata</td><td>Millipore</td><td>SYNSV0000</td><td>erogato secondo necessità</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>HyClone</td><td>SH30023.01</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Labs</td><td>2701</td><td>70% soluzione di lavoro</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Microscopio fluorescente Gibco</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td></td><td>EVOS</td><td>M7000</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di piastre fluorescenti</td><td>Biotek</td><td>Synergy H1</td><td></td></tr><tr><td>Foil</td><td>Reynolds</td><td></td><td>Reynolds Wrap Foglio di alluminio per impieghi gravosi, 125 SQ.</td></tr><tr><td>Contenitore di congelamento</td><td>Thermo Scientific</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Millipore</td><td>4055</td><td>2% soluzione di lavoro</td></tr><tr><td>Ematocitometro (camera di conteggio)</td><td>Corning</td><td>480200</td><td>0,1 mm di profondità</td></tr><tr><td>Incubatore</td><td>Fisher Scientific</td><td>6845</td><td></td></tr><tr><td>Sterilizzatore per strumenti</td><td>VWR</td><td>B1205</td><td></td></tr><tr><td>Acido linoleico-oleico Acid-Albumin</td><td>Sigma</td><td>L9655</td><td>1x Soluzione</td></tr><tr><td>di lavoro Microscopio</td><td>Evos</td><td>AMEX1000</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta multicanale</td><td>Thermo Scientific</td><td>4661070</td><td>Pipettatori a 12 canali, 30 - 300 &; L</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S-7907</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S-3139</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue</td><td>Invitrogen</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O</td><td>Sigma</td><td>O-0625</td><td></td></tr><tr><td>Orbital Shaker</td><td>IKA</td><td>KS130BS1</td><td></td></tr><tr><td>Tovagliolo di carta</td><td>Tork</td><td>RK8002</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Parafilm M</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Steptomamicina (P/S)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>1x Piastre di Petri per soluzione di lavoro</td></tr><tr>, <td>Piastre di Petri Falcon</td><td>351029</td><td>100 mm</td>, Agitatore per piastre Falcon 351007 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>da 60 mm</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>200</td><td></td></tr><tr><td>RBC</td><td>Roche</td><td>11814389001</td><td></td></tr><tr><td>Reagent Reservior</td><td>VWR</td><td>89094-680</td><td></td></tr><tr><td>Bicchiere piccolo, 100 mL</td><td>Pyrex</td><td>1000-100</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro Lettore di piastre Biotek</td><td></td><td>Synergy H1</td><td></td></tr><tr><td>Garza sterile</td><td>McKesson</td><td>762703</td><td></td></tr><tr><td>Pinza dritta, 120 mm</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-4960</td><td></td></tr><tr><td>Forbici dritte, 140 mm</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-6762</td><td></td></tr><tr><td>T-25 Flask</td><td>Corning</td><td>430639</td><td>Incubatore per colture tissutali trattate con coltura tissutale</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific 50144906</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro per tessuti, 250 &; m</td><td>Pierce</td><td>87791</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td>0,1% Pinzette per soluzione di lavoro</td></tr><tr><td>, 110 mm</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5035</td><td></td></tr><tr><td>Tipo 1 Collagenase</td><td>Gibco</td><td>17100017</td><td></td></tr><tr><td>Bagno d'acqua</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-462-10</td><td></td></tr><tr><td>Carta da filtro Whatman grado 1</td><td>Whatman</td><td>1001-110</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento dei preadipociti dagli embrioni di pulcino di pollo

Isolation of Preadipocytes from Broiler Chick Embryos

I preadipociti primari sono un prezioso sistema sperimentale per comprendere le vie molecolari che controllano la differenziazione e il metabolismo degli adipociti. Gli embrioni di pollo offrono l'opportunità di isolare i preadipociti fin dalla prima fase dello sviluppo adiposo. Questa cellula primaria può essere utilizzata per identificare i fattori che influenzano la proliferazione dei preadipociti e la differenziazione adipogenica, rendendoli un modello prezioso per gli studi relativi all'obesità infantile e al controllo della deposizione di grasso in eccesso nel pollame. La rapida crescita del tessuto adiposo postnatale spreca efficacemente il mangime allocandolo lontano dalla crescita muscolare nei polli da carne. Pertanto, i metodi per comprendere le prime fasi dello sviluppo del tessuto adiposo possono fornire indizi per regolare questa tendenza e identificare modi per limitare l'espansione adiposa all'inizio della vita. Il presente studio è stato progettato per sviluppare un metodo efficiente per l'isolamento, la coltura primaria e la differenziazione adipogenica dei preadipociti isolati dallo sviluppo del tessuto adiposo di embrioni di pulcino di polli da carne commerciali (tipo carne). La procedura è stata ottimizzata per produrre cellule con elevata vitalità (~ 98%) e una maggiore capacità di differenziarsi in adipociti maturi. Questo semplice metodo di isolamento, coltura e differenziazione dei preadipociti embrionali supporta le analisi funzionali della crescita e dello sviluppo del grasso nei primi anni di vita.

I preadipociti primari sono morfologicamente simili ai fibroblasti, con forme irregolari simili a stelle e un nucleo centrale (Figura 2A-C). Le cellule aderiscono prontamente alla plastica di coltura tissutale e iniziano a proliferare subito dopo l'attaccamento. Differenziano e accumulano rapidamente goccioline lipidiche (Figura 3D) quando vengono fornite di acidi grassi nel mezzo. La vitalità (98%, basata sull'esclusione del co...

Il presente protocollo descrive un metodo semplice per isolare i preadipociti dal tessuto adiposo negli embrioni di polli da carne. Questo metodo consente l'isolamento con alta resa, coltura primaria e differenziazione adipogenica dei preadipociti. La colorazione Oil Red O e la colorazione lipidico/DNA hanno misurato la capacità adipogenica delle cellule isolate indotte con mezzi di differenziazione.

Isolamento dei preadipociti dagli embrioni di pulcino di pollo

Primary preadipocytes are a valuable experimental system for understanding the molecular pathways that control adipocyte differentiation and metabolism. ...

I preadipociti primari sono un prezioso sistema sperimentale per comprendere le vie molecolari che controllano il metabolismo degli adipociti. Gli embrioni di pollo offrono l'opportunità di isolare i preadipociti fin dalla prima fase dello sviluppo degli adipociti. Questo metodo è stato ottimizzato per produrre cellule con elevata vitalità e maggiore capacità di differenziarsi in adipociti maturi, che possono essere utilizzati per l'analisi funzionale della crescita del grasso precoce e dello sviluppo embrionale nei pulcini.Il processo di differenziazione adipogenica è altamente comparabile tra polli e umani. Pertanto, i preadipociti isolati possono essere utilizzati come modello a doppia proposta per studi rilevanti per l'uomo e il pollame. Per iniziare il tampone il corpo dell'embrione con il 70% di etanolo.Quindi, per evitare interferenze durante la filtrazione nelle fasi successive dopo la digestione, strofinare delicatamente la superficie della pelle con una garza sterile per rimuovere le piume. Quindi tagliare la pelle tra le gambe e la regione addominale per rivelare la coppia di depositi adiposi femorali. Utilizzare una pinza curva con una mano per tenere la pelle intorno alla gamba e rimuovere delicatamente il grasso sottocutaneo femorale.con l'altra mano. Successivamente, utilizzare una pinza curva per allontanare delicatamente il deposito dalla gamba. Trasferire i tessuti in un tubo da 15 millilitri contenente cinque millilitri di mezzi di raccolta e ripetere la dissezione per l'altro lato del cuscinetto di grasso.Ora, trasferire i cuscinetti di grasso raccolti in una capsula di Petri da 60 millimetri contenente soluzione di sterilizzazione e risciacquare brevemente facendo roteare il piatto un paio di volte. Quindi risciacquare la soluzione di sterilizzazione trasferendo i cuscinetti di grasso in una capsula di Petri da 60 millimetri contenente PBS. Ruotare delicatamente la piastra e, ancora una volta, lavare con PBS.Per la digestione dei tessuti adiposi, trasferirli in un tubo da 15 millimetri contenente soluzione enzimatica preriscaldata. Quindi immergere un paio di lunghe forbici dritte nel tubo e infine tritare i tessuti adiposi nella soluzione in pezzi il più piccoli possibile. Trasferire il tessuto tritato e la soluzione enzimatica in un matraccio autoclavato da 25 millilitri.Avvolgere il pallone con pellicola di paraffina e posizionare il matraccio in un incubatore shaker orbitale a 37 gradi Celsius per la digestione. Dopo la digestione, pipettare delicatamente su e giù per mescolare bene. Quindi rimuovere eventuali frammenti di tessuto e detriti non digeriti filtrando attraverso un filtro di tessuto da 250 micrometri in un tubo da 15 millilitri mediante pipettaggio.Ora, rimuovere le cellule aderenti al pallone risciacquando il pallone con quattro millilitri di terreno di crescita e filtrare la sospensione cellulare nello stesso tubo da 15 millilitri. Quindi risciacquare il colino pipettando nuovamente il mezzo di crescita per rimuovere eventuali cellule intrappolate nel filtro. Centrifugare a 300 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente per pellettizzare la frazione cellulare e aspirare il surnatante senza disturbare il pellet cellulare.Risospendare delicatamente il pellet in un millilitro di tampone di lisi dei globuli rossi, mescolare bene mediante pipettaggio e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi diluire le cellule aggiungendo cinque millilitri di mezzi di crescita al tubo contenente le cellule e mescolarle delicatamente mediante pipettaggio. Ora, pipettare le celle su un filtro cellulare da 40 micrometri e filtrarle in un nuovo tubo da 50 millilitri.Quindi risciacquare il filtro con altri cinque millilitri di mezzi di crescita e pellettizzare le celle centrifugando a 300 volte G per sette minuti a temperatura ambiente. Aspirare accuratamente il surnatante. Risospesso il pellet cellulare rimanente in un millilitro di terreno di crescita mediante pipettaggio Per determinare la densità e la vitalità della cella, mescolare 10 microlitri di ciascun campione in tripano blu mediante pipettaggio.Caricare 10 microlitri della miscela sull'emocitometro e contare le celle. L'analisi dei preadipociti dopo 24, 48 e 72 ore ha mostrato una morfologia e un numero cellulari normali. L'induzione adipogenica dei preadipociti ha mostrato una rapida differenziazione e accumulo di goccioline lipidiche.La manipolazione aggressiva dei preadipociti durante l'isolamento ha provocato danni cellulari e un basso numero di cellule. La contaminazione microbica può essere osservata nonostante l'adozione di misure preventive. La colorazione lipidica con olio rosso O ha indicato che i preadipociti iniziano rapidamente a sviluppare goccioline lipidiche sotto induzione adipogenica e l'accumulo progredisce nel tempo come osservato in 24, 48 e 72 ore.L'accumulo lipidico relativo al numero di cellule è stato quantificato utilizzando macchie lipidiche e di DNA. Sia l'accumulo lipidico che la proliferazione cellulare sono aumentati nel tempo. Un basso numero di cellule o cellule danneggiate possono essere osservate quando le frazioni tissutali vengono digerite troppo a lungo.Pertanto, si raccomanda di non superare un'ora e mezza di digestione. I preadipociti isolati possono essere utilizzati per studi di espressione genica. È possibile ottenere un RNA sufficiente per l'uso nella sintesi del cDNA e nel follow-on qPCR o RNAseq.

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