Induzione e diversi indicatori di valutazione dell'encefalomielite autoimmune sperimentale
9 settembre 2022
Il presente protocollo descrive l'induzione dell'encefalomielite autoimmune sperimentale in un modello murino utilizzando glicoproteina oligodendrocitaria mielinica e monitorando il processo della malattia utilizzando un sistema di punteggio clinico. I sintomi sperimentali correlati all'encefalomielite autoimmune vengono analizzati utilizzando l'analisi della tomografia microcomputerizzata del femore di topo e il test in campo aperto per valutare il processo della malattia in modo completo.
Attualmente non esiste una cura completa per la sclerosi multipla. Il nostro protocollo consente la costruzione efficace di un modello sperimentale di encefalomielite autoimmune per aiutare a esplorare le terapie per la malattia della sclerosi multipla. Il vantaggio principale del nostro protocollo è una valutazione più completa del trattamento dell'encefalomielite autoimmune sperimentale da molteplici prospettive.
Per prima cosa preparare l'emulsione peptidica glicoproteina oligodendrocitaria della mielina sciogliendo il peptide liofilizzato e il PBS pre-raffreddato sterile senza ioni calcio e magnesio a pH 7,4. Aggiungere una sfera d'acciaio sterilizzata da cinque millimetri a un micro tubo di centrifuga pulito da due millilitri. Quindi aggiungere 500 microlitri di adiuvante completo di Freuds contenente cinque milligrammi per millilitro di microbatterio tuberculosis liofilizzato e 500 microlitri di emulsione peptidica glicoproteina oligodendrocitaria mielina al tubo.
Ora fai oscillare il tubo su un lyser tissutale per 10 minuti. Quindi raffreddare i tubi sul ghiaccio per 10 minuti. Ripetere il processo quattro volte fino a formare una soluzione viscosa bianca.
Quindi, diluire la soluzione di gambo della tossina della pertosse 50 volte in PBS sterile di pH 7,4 senza ioni di calcio e magnesio per ottenere una concentrazione finale di 200 nanogrammi per 100 microlitri. Per precipitare tutta l'emulsione peptidica di glicoproteina oligodendrocitaria mielinica inizialmente preparata sul fondo del tubo, centrifugare il tubo a quattro gradi Celsius per due o tre secondi, premendo il pulsante dell'impulso sull'apparecchiatura. Aspirare l'emulsione peptidica glicoproteina oligodendrocitaria mielinica con una siringa da un millilitro dotata di un ago da 22 gauge e trasferire l'emulsione in un nuovo cilindro di siringa da 1 millilitro.
Attaccare un ago calibro 26 alla canna e fissare la connessione con una pellicola sigillante. Iniettare 100 microlitri di emulsione peptidica glicoproteina oligodendrocitaria mielinica per via sottocutanea su ciascun lato della spina dorsale di un topo. Dopo l'iniezione, osservare la formazione automatica di masse bulbose sotto la pelle e il dorso.
Quindi per via intraperitoneale, iniettare 100 microlitri di tossina della pertosse nello stesso topo. Preparare una camera di reazione in campo aperto e impostare un sistema di analisi video per la registrazione della locomozione del topo. Per pulire la camera di reazione prima dell'esperimento, spruzzare il 70% di etanolo su tutta l'area e pulire con un tovagliolo di carta pulito.
Quindi posiziona un mouse nell'angolo di una camera di reazione. Per iniziare le riprese, fare clic sul pulsante di avvio acquisizione nella barra dei menu del sistema di registrazione video e registrare l'ora. Mantenendo il silenzio nella stanza di prova, lascia che il mouse si muova liberamente per cinque minuti.
Quindi interrompere la registrazione e salvare il video. Rimetti il mouse nella sua gabbia. Quindi pulire l'area di prova con etanolo al 70% e procedere al mouse successivo.
Tenere il topo eutanasia piatto su un vassoio da dissezione e fissare le estremità. Tenere la pelle degli arti posteriori nel mouse con una pinza e aprire la pelle e i muscoli con le forbici. Quindi, separare il femore dalla tibia e dall'osso dell'anca usando attentamente le forbici.
Rimuovere i muscoli aderenti al femore con le forbici. Quindi posizionare il femore in etanolo al 70% a temperatura ambiente. In questo studio, è stata valutata la capacità del peptide derivato dalla glicoproteina oligodendrocitaria della mielina di indurre EAE.
I topi iniettati con il peptide hanno sperimentato una progressiva perdita di peso. Dopo sei-nove giorni di iniezione, hanno sviluppato sintomi EAE che hanno raggiunto il picco dopo 14-16 giorni. I grafici delle tracce del test in campo aperto hanno dimostrato che EAE altera il normale comportamento esplorativo dei topi.
Rispetto ai topi normali, i topi con EAE hanno percorso una distanza significativamente inferiore nelle fasi di esordio precoce, picco e remissione. I topi con EAE avevano anche una durata dell'attività significativamente ridotta nelle fasi di picco e remissione della malattia. Inoltre, in tutte e tre le fasi i topi EAE avevano significativamente meno distanza di viaggio e tempo trascorso al centro.
Le scansioni di tomografia microcomputerizzata di femori di topi EAE hanno rivelato un'architettura trabecolare diversa dai topi normali. I femori dei topi EAE avevano significativamente meno densità minerale ossea e volume osseo al volume del volume tissutale rispetto a quelli dei topi normali. Inoltre, i femori di topi con EAE avevano meno densità di connessione trabecolare, numero trabecolare e spessore trabecolare rispetto a quelli dei topi normali.
Rispetto ai topi normali, la spaziatura trabecolare è stata migliorata e lo spessore osseo corticale è stato ridotto nei topi EAE. Possiamo anche isolare il cervello e il codice spinale dei topi EAE al culmine della malattia e analizzare la produzione di cellule immunitarie e citochine mediante citometria influenzale.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo studio presenta un protocollo per indurre l'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) nei topi utilizzando la glicoproteina della mielina oligodendrocitaria (MOG). Offre una valutazione completa del processo patologico mediante punteggio clinico, tomografia computerizzata microscopica e test comportamentali.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Neuroimmunologia
- Ricerca sulla sclerosi multipla
- Modellizzazione delle malattie autoimmuni
Sfondo
- Esistenza di vari modelli sperimentali per lo studio della sclerosi multipla.
- Importanza di un modello affidabile per la valutazione dei trattamenti.
- La MOG è un componente chiave nella patologia della sclerosi multipla.
Metodi Utilizzati
- Induzione di EAE mediante emulsione del peptide MOG e tossina pertussica.
- Modello murino
- Tomografia computerizzata micro-CT e test del campo aperto per la valutazione.
Risultati principali
- I topi hanno mostrato una perdita di peso progressiva e hanno sviluppato sintomi di EAE entro due settimane dall'iniezione di MOG.
- L'analisi comportamentale ha rivelato un comportamento esplorativo compromesso e una ridotta locomozione nei topi con EAE.
- La microtomografia computerizzata ha indicato una densità ossea ridotta e un'architettura trabecolare alterata nei topi con EAE.
Conclusioni
- Lo studio stabilisce con successo un modello completo di EAE per ulteriori esplorazioni delle terapie per la sclerosi multipla.
- I risultati sono significativi per comprendere il meccanismo della malattia e possibili interventi terapeutici.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
I modelli di encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) forniscono una piattaforma clinicamente rilevante per valutare ipotesi terapeutiche e ridurre i rischi meccanicistici nella scoperta di farmaci per la sclerosi multipla (SM). L'integrazione di indicatori comportamentali, scheletrici e immunologici migliora l'affidabilità predittiva e supporta decisioni di portafoglio proporzionate al rischio nei primi stadi della scoperta e nei punti critici preclinici. Una fenotipizzazione completa nell'EAE consente una validazione del target più solida e orienta le decisioni di avanzamento o interruzione per i candidati alla SM.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche in un modello di neuroinfiammazione autoimmune rilevante per la malattia.
- Supporta la validazione funzionale del bersaglio collegando interventi molecolari a fenotipi clinici, comportamentali e scheletrici.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistico attraverso letture multidimensionali che vanno oltre il tradizionale punteggio clinico.
- Migliora l'affidabilità predittiva per la selezione del portafoglio catturando diversi endpoint rilevanti per la sclerosi multipla.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara sistemi in vivo validati per la valutazione dell'efficacia e lo screening meccanicistico di candidati farmaci per la sclerosi multipla.
- Standardizza la valutazione mediante punteggi clinici riproducibili, analisi del comportamento e output di micro-TC.
- Consente una valutazione quantitativa degli effetti del composto sulla neuroinfiammazione, sul comportamento e sulla salute ossea.
- Supporta piattaforme scalabili e riutilizzabili per il profilo comparativo dei composti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea gli endpoint preclinici alle manifestazioni nei pazienti con sclerosi multipla, inclusi comportamenti simili all'ansia e osteoporosi.
- Garantisce continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica integrando biomarcatori immunologici e fenotipici.
- Riduce i rischi nelle decisioni di avanzamento fornendo evidenze multiparametriche di efficacia e sicurezza.
- Accresce la rilevanza traslazionale per la selezione dei candidati e la strategia dei biomarcatori.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo modello EAE collega la fase iniziale della scoperta, l'identificazione dei composti promettenti e la validazione preclinica dei farmaci per la SM, consentendo la verifica delle ipotesi, la chiarificazione dei percorsi molecolari e la valutazione quantitativa degli effetti degli interventi terapeutici.
- Biologia della scoperta: Supporta il test dell'ipotesi nulla e l'esplorazione meccanicistica dei percorsi neuroimmunitari nella sclerosi multipla.
- Screening: Fornisce output standardizzati, riproducibili e quantitativi per la valutazione di composti.
- Analisi: Offre misurazioni multimodali—punteggi clinici, parametri comportamentali e microarchitettura ossea—per confronti robusti tra condizioni.
- Ricerca traslazionale: Allinea i risultati preclinici con fenotipi rilevanti per i pazienti e con endpoint biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma in vivo riutilizzabile per la scoperta iterativa di farmaci e biomarcatori per la sclerosi multipla.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione degli obiettivi tramite spettrometria di massa.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la scalabilità degli studi sull'efficacia in vivo.
- Valore strategico: Orienta le decisioni di avanzamento o interruzione e migliora l'efficienza del capitale integrando diversi indicatori di valutazione.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione e la progressione di candidati terapeutici per la sclerosi multipla con adeguamento del rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in neuroimmunologia, analisi del comportamento e imaging osseo.
- Richiede l'accesso a infrastrutture per micro-TC, tracciamento video e citometria a flusso.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per i punteggi clinici e i protocolli comportamentali.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per diverse linee di topi o interventi pertinenti alla sclerosi multipla.
- La complessità della valutazione aumenta con endpoint multiparametrici e l'integrazione dei dati.
Domande frequenti sul biopharma
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:44
Preparation of Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein Peptide (MOG35-55) Emulsion and Pertussis Toxin
1:55
Establishment of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Animal Model
2:55
Open Field Test
3:42
Analysis of Bone Phenotype
4:16
Results: Induction of EAE by MOG35-55 Treatment
5:49
Conclusion
