Name: Misurazione del numero di copie del DNA mitocondriale a singola cellula e delleteroplasmia utilizzando la reazione a catena della polimerasi digitale a goccia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Scopri come misurare il numero di copie del DNA mitocondriale e l'eteroplasmia a singola cellula con la PCR digitale a goccia. Questo metodo offre precisione superiore rispetto alle analisi su tessuti.

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Grazie al Dr. L Bozhilova per i consigli sull'analisi statistica dei dati PCR di generazione di goccioline. Grazie al Dr. H Zhang per aver fornito gli ovociti utilizzati per generare i dati nella Figura 3C e nella Figura 4B. Questo lavoro è stato svolto da SPB presso la Medical Research Council Mitochondrial Biology Unit (MC_UU_00015/9), Università di Cambridge, e finanziato da una Wellcome Trust Principal Research Fellowship detenuta da PFC (212219/Z/18/Z).

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Nessun conflitto di interessi da divulgare.

Il protocollo qui descritto è applicabile a un'ampia gamma di tipi e specie cellulari oltre a quelli discussi sopra, sebbene un'attenta ottimizzazione dei nuovi progetti di analisi sarà fondamentale per garantire che l'accuratezza e la ripetibilità del metodo siano mantenute quando ci si allontana dalle combinazioni primer/sonda precedentemente convalidate. Quando si lavora con singole cellule è fondamentale garantire che la raccolta dei campioni venga eseguita nel modo più accurato possibile (ad esempio, utilizzando rig...

Il DNA mitocondriale (mt) dei mammiferi è un piccolo (circa 16,5 Kb) genoma circolare del DNA residente nella matrice mitocondriale che codifica per 37 geni, comprendenti due rRNA, 22 tRNA e 13 geni codificanti proteine1. A differenza del genoma nucleare, che contiene una (aploide) o due copie (diploidi) di ciascun gene per cellula, il mtDNA è presente in più copie nei mitocondri di ogni cellula, che vanno da decine di copie (ad esempio, spermatociti maturi) a centinaia di migliaia di copie (ad esempio, ovociti)2,3. Una conseguenza di questa natura multi-copia è che le mutazioni nel genoma del mtDNA, che possono esistere come polimorfismi a singolo nucleotide (SNP), delezioni o duplicazioni, possono essere presenti a vari livelli in ogni cellula, costituendo ovunque dallo 0% al 100% della popolazione totale di mtDNA della cellula. L'esistenza di genomi del mtDNA wild-type e mutanti nella stessa cellula è definita eteroplasmia, e le mutazioni del mtDNA eteroplasmatico patogeno sono una delle principali cause di malattia mitocondriale, con diverse sindromi neurologiche comuni legate alle mutazioni eteroplasmatiche del mtDNA sottostante4.
Due parametri chiave che contribuiscono alla probabilità di una mutazione eteroplasmatica del mtDNA che causa la malattia clinica sono il livello di eteroplasmia e il numero di copie del mtDNA. Molte mutazioni eteroplasmatiche mostrano un effetto soglia, con fenotipi biochimici e clinici che diventano evidenti solo al di sopra di un certo livello di eteroplasmia, tipicamente intorno all'80%5, e successivamente peggiorano con l'aumento dell'eteroplasmia4. Tuttavia, è anche importante considerare il numero di copie del mtDNA presenti nella cellula, poiché ciò influenzerà il numero di genomi di mtDNA wild-type (cioè "sani") presenti a un dato livello di eteroplasmia. Studi in pazienti con malattia mitocondriale hanno evidenziato l'importanza di questa interazione tra eteroplasmia e numero di copie5,6, e Filograna et al. hanno recentemente riportato un aumento del numero di copie del mtDNA che allevia i sintomi nonostante l'eteroplasmia invariata in un modello murino di malattia mitocondriale7.
Mentre molto è stato fatto negli ultimi anni per migliorare la comprensione della patogenesi e della trasmissione delle malattie causate dall'eteroplasmia del mtDNA, la maggior parte di questo lavoro è stato condotto a livello di tessuti piuttosto che di cellule, confrontando i livelli medi di eteroplasmia tissutale e le misurazioni del numero di copie acquisite da biopsie tissutali di massa e campioni di sangue. Alcune tecniche consolidate, come la microdissezione a cattura laser, consentono tali misurazioni a livello cellulare 8,9; tuttavia, la recente esplosione dei metodi di analisi a singola cellula ad alto rendimento, o le cosiddette "omiche a singola cellula"10, ha creato un requisito per metodi in grado di misurare con precisione questi parametri cruciali del mtDNA a livello di singola cellula.
Il metodo PCR per la generazione di goccioline sfrutta i recenti progressi nella tecnologia microfluidica per migliorare i metodi esistenti di quantificazione delle concentrazioni di DNA sconosciute tramite l'amplificazione PCR di specifici ampliconi bersaglio nel DNA campione11. A differenza della qPCR, dove il DNA del campione viene amplificato in una singola reazione, con il relativo tasso di accumulo del prodotto PCR che funge da lettura, questo metodo divide il campione iniziale in migliaia di singole goccioline, compartimentando così le molecole di DNA del campione in reazioni spazialmente separate12. La successiva reazione PCR procede in ogni singola goccia, con il prodotto PCR che si accumula solo in goccioline che contengono il DNA bersaglio. Il risultato di questa reazione è un'uscita digitale sotto forma di un pool di goccioline che contengono una copia del DNA bersaglio e del prodotto PCR amplificato o non contengono DNA bersaglio. Utilizzando sonde fluorescenti di DNA o un colorante legante il DNA a doppio filamento (ds), è possibile contare le goccioline contenenti prodotto amplificato e il rapporto tra goccioline "positive" e "negative" può essere utilizzato per calcolare il numero assoluto di copie di DNA presenti nel campione iniziale. Questa misurazione assoluta, al contrario della misura relativa acquisita da una reazione qPCR, è il fattore chiave che consente di utilizzare questa metodologia per la misurazione accurata del numero di copie del mtDNA e dell'eteroplasmia in singole cellule11, e diversi studi recenti hanno già utilizzato la tecnologia PCR per la generazione di goccioline per questo scopo13,14 . Questo articolo presenta un metodo per misurare il numero di copie del mtDNA e l'eteroplasmia da delezione in singole cellule da tessuto umano e murino.

<table><tbody><tr><td>Soluzione Tween-20 al 50%</td><td>Novex</td><td>3005</td><td></td></tr><tr><td>Olio automatizzato per la generazione di goccioline&nbsp;</td><td>Bio Rad</td><td>1864110</td><td>Formulazione di olio commerciale utilizzata per generare l'emulsione olio/goccioline (utilizzata nella fase 4.1 del protocollo)</td></tr> <tr><td>Macchina per PCR C1000 con blocco a pozzetti profondi</td><td>Bio Rad</td><td>1851197</td><td>termociclatore per PCR dotato di un blocco riscaldante a pozzetti profondi, utilizzato per la lisi cellulare (fase del protocollo 2.1.2.) e il ciclo PCR (fase 5 del protocollo)</td></tr><tr><td>Blocco di raffreddamento della piastra di raccolta</td><td>Bio Rad</td><td>12002819</td><td>Blocco di raffreddamento che mantiene i campioni refrigerati durante la generazione di goccioline (utilizzato nella fase 4.3 del protocollo)</td></tr><tr><td>piastre ddPCR a 96 pozzetti&nbsp;</td><td>Puntali per</td><td>pipette a 96 pozzetti Bio Rad 12001925 progettati per l'uso nel generatore di gocce QX200 AutoDG, utilizzati per la preparazione del campione (fase del protocollo 3.4) e la raccolta delle goccioline (fase del protocollo 4.3)</td><td></td></tr><tr><td>olio per lettore di gocce ddPCR&nbsp;</td><td>Bio Rad</td><td>1863004</td><td>Formulazione commerciale dell'olio utilizzata dal lettore di gocce (utilizzata nella fase del protocollo 6.1)</td></tr><tr><td>ddPCR Supermix per sonde (senza dUTP)</td><td>Bio Rad</td><td>1863023</td><td>Supermiscela commerciale per l'uso in esperimenti ddPCR che utilizzano sonde (utilizzate nella fase del protocollo 3.3)</td></tr><tr><td>Cartucce per generatori di gocce automatizzati DG32&nbsp;</td><td>Bio Rad</td><td>1864108</td><td>Cartucce microfluidiche utilizzate nel generatore di gocce QX200 AutoDG per generare l'emulsione olio/goccioline (utilizzato nel passaggio del protocollo 4.3)</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>Siero fetale bovino qualificato</td></tr><tr><td>Copri piastre in lamina&nbsp;</td><td>Bio Rad</td><td>1814040</td><td>Coperchi per piastre in lamina utilizzati per sigillare le piastre di raccolta delle goccioline dopo la generazione di goccioline (utilizzati nella fase 4.6 del protocollo)</td></tr><tr><td>Cellule HEK 293T</td><td>Takara</td><td>632180</td><td>Subclone commerciale della linea cellulare di rene embrionale umano trasformato, HEK 293, che esprime le cellule HeLa dell'antigene SV40 Large-T</td></tr><tr><td></td><td>ECACC</td><td>93021013</td><td>Cellule di carcinoma epiteloide della cervice umana</td></tr><tr><td>DMEM Gibco ad alto glucosio</td><td></td><td>13345364</td><td>4,5 g/L di D-glucosio, con L-glutammina e piruvato di sodio</td></tr><tr><td>Cibridi umani</td><td>Università di Miami</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibroblasti embrionali di topo.</td><td>Università di Newcastle</td><td>Immortalato da topi C57Bl/6</td> Acqua priva di nucleasi Ambion AM9937 Guarnizioni per piastre PCR Pierce SP-0027 Guarnizioni per piastre adesive trasparenti, utilizzate solo per la generazione di pre-goccioline (la guarnizione in alluminio deve essere utilizzata nel passaggio 4.6)Contenitori per rifiuti con punta in pipetta Bio Rad 1864125 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Contenitore di raccolta monouso utilizzato per raccogliere i puntali scartati nel generatore di gocce QX200 AutoDG (utilizzato nel passaggio 4.3 del protocollo)</td></tr><tr><td>Puntali per pipette per sistema AutoDG&nbsp;</td><td>Bio Rad</td><td>1864120</td><td>Puntali per pipette filtrati progettati per l'uso nel generatore di gocce QX200 AutoDG (utilizzato nella fase 4.3 del protocollo)</td></tr><tr><td>Cellule primarie di fibroblasti dermici umani</td><td>Newcastle Biobank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer/Sonde</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>Le sequenze esatte di primer/sonda dipenderanno dal saggio. I primer e le sonde utilizzati in questo studio sono riportati nella Tabella 1</td></tr><tr><td>Soluzione di proteinasi K 20 mg/mL</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>PX1 Sigillante per piastre PCR</td><td>Bio Rad</td><td>1814000</td><td>Applica i sigilli in alluminio alle piastre dei campioni ddPCR dopo la generazione di goccioline (utilizzato nel passaggio del protocollo 4.6)</td></tr><tr><td>Software QX Manager</td> Software di configurazione e analisi <td>del lettore di gocce Bio Rad</td><td>12012172</td> (<td>utilizzato nei passaggi 6 e 7 del protocollo)</td></tr><tr><td>Generatore di gocce QX200 AutoDG</td><td>Bio Rad</td><td>1864101</td><td>Generatore di gocce microfluidiche automatizzato (utilizzato nel passaggio del protocollo 4)</td></tr><tr><td>Lettore di gocce QX200</td><td>Bio Rad</td><td>1864003</td><td>Lettore di gocce (utilizzato nel passaggio 6 del protocollo)</td></tr><tr><td>Cristalli preimpostati Trizma pH 8,3</td><td>Sigma</td><td>T8943-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

misurazione del numero di copie del dna mitocondriale a singola cellula e dell'eteroplasmia utilizzando la reazione a catena della polimerasi digitale a goccia

Measuring Single-Cell Mitochondrial DNA Copy Number and Heteroplasmy Using Digital Droplet Polymerase Chain Reaction

Il DNA mitocondriale (mt) dei mammiferi è una piccola molecola di DNA mitocondriale circolare, a doppio filamento, che codifica per 13 subunità della catena di trasporto degli elettroni. A differenza del genoma nucleare diploide, la maggior parte delle cellule contiene molte più copie del mtDNA, che vanno da meno di 100 a oltre 200.000 copie a seconda del tipo di cellula. Il numero di copie del mtDNA è sempre più utilizzato come biomarcatore per una serie di condizioni degenerative e malattie legate all'età e, quindi, la misurazione accurata del numero di copie del mtDNA sta diventando uno strumento chiave sia nella ricerca che nelle impostazioni diagnostiche. Le mutazioni nel mtDNA, che spesso si verificano come polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) o delezioni, possono esistere in tutte le copie del mtDNA all'interno della cellula (chiamate omoplasmia) o come una miscela di copie del mtDNA mutato e WT (definita eteroplasmia). Le mutazioni eteroplasmatiche del mtDNA sono una delle principali cause di patologia mitocondriale clinica, sia nelle malattie rare che in un numero crescente di malattie comuni ad esordio tardivo come il morbo di Parkinson. Determinare il livello di eteroplasmia presente nelle cellule è un passo fondamentale nella diagnosi delle malattie mitocondriali rare e nella ricerca volta a comprendere i disturbi comuni ad esordio tardivo in cui i mitocondri possono svolgere un ruolo. Il numero di copie del mtDNA e l'eteroplasmia sono stati tradizionalmente misurati mediante saggi quantitativi basati sulla (q) PCR o sequenziamento profondo. Tuttavia, la recente introduzione della tecnologia ddPCR ha fornito un metodo alternativo per misurare entrambi i parametri. Offre diversi vantaggi rispetto ai metodi esistenti, tra cui la capacità di misurare il numero assoluto di copie del mtDNA e una sensibilità sufficiente per effettuare misurazioni accurate da singole cellule anche a basso numero di copie. Presentato qui è un protocollo dettagliato che descrive la misurazione del numero di copie del mtDNA in singole cellule usando ddPCR, indicato come droplet generation PCR d'ora in poi, con l'opzione per la misurazione simultanea dell'eteroplasmia in cellule con delezioni del mtDNA. Viene anche discussa la possibilità di espandere questo metodo per misurare l'eteroplasmia in cellule con SNP del mtDNA.

Dopo la generazione di goccioline, è visibile uno strato trasparente di goccioline opache che galleggiano sopra la fase oleosa in ciascun pozzetto (Figura 1B). La formazione di goccioline può essere influenzata negativamente dalla presenza di detergenti nel lisato di input quando si eseguono esperimenti su singole cellule. Utilizzando il protocollo di lisi descritto al punto 2.1.2., si ottengono regolarmente rese di goccioline superiori al livello raccomandato di 10.000, nonostante la presen...

Qui presentiamo un protocollo per misurare il numero assoluto di copie del DNA mitocondriale (mt) e i livelli di eteroplasmia di delezione del mtDNA in singole cellule.

Misurazione del numero di copie del DNA mitocondriale a singola cellula e dell'eteroplasmia utilizzando la reazione a catena della polimerasi digitale a goccia

The mammalian mitochondrial (mt)DNA is a small, circular, double-stranded, intra-mitochondrial DNA molecule, encoding 13 subunits of the electron ...

Questo protocollo può essere utilizzato per misurare con precisione il numero di copie del DNA mitocondriale presenti nelle singole cellule e il livello di alcuni tipi di mutazione del DNA mitocondriale. I metodi precedenti possono effettuare con precisione queste misurazioni in campioni di tessuto contenenti molte cellule. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo effettuare le stesse misurazioni in singole cellule.Questo metodo è particolarmente utile per coloro che studiano i mitocondri e avrà ampie applicazioni in questo campo. L'isolamento e la lisi efficaci delle singole cellule sono fondamentali per questa tecnica. L'esperienza precedente con l'ordinamento a cella singola sarebbe molto utile.Per iniziare, preparare il master mix per la PCR senza il DNA campione su ghiaccio, come descritto nel testo. Dopo il vortice brevemente, distribuire il volume richiesto della miscela master preparata a ciascun pozzetto di una piastra PCR a 96 pozzetti di generazione di gocce, disponendo i campioni in colonne piene. Quindi, aggiungere la combinazione principale a qualsiasi pozzo vuoto in colonne incomplete per utilizzarle come controlli non modello.Quindi aggiungere il DNA di input a ciascun pozzetto per rendere il volume totale di ciascun pozzetto di 22 microlitri. Sigillare la piastra con una guarnizione adesiva e posizionarla su uno shaker a 2000 RPM per un minuto. Quindi centrifugare la piastra a 1000 volte G per un minuto a quattro gradi Celsius prima di metterla sul ghiaccio.Per la generazione di gocce, assicurarsi innanzitutto che il generatore di goccioline sia acceso e controllare se una bottiglia di olio che genera goccioline è caricata nella posizione E del ponte strumenti. Quindi fare clic su Configura piastra campione sul touchscreen. Dopo aver selezionato tutte le colonne sulla piastra campione contenente i campioni o gli spazi vuoti, fare clic su OK per confermare la configurazione della piastra.Quindi, caricare le cartucce del generatore di gocce nella posizione B sul ponte strumenti in modo che tutte le luci diventino verdi e posizionare un trogolo di scarico vuoto nella posizione C.Quindi caricare le scatole di punta del filtro con i coperchi rimossi nella posizione D sul palco dello strumento in modo che tutte le luci diventino verdi. Quindi, rimuovere il sigillo adesivo prima di caricare la piastra campione nella posizione F del piano strumenti in modo che la luce diventi verde. Caricare anche una piastra vuota di raccolta di gocce a 96 pozzetti posta in un blocco freddo, pre-raffreddata a meno 20 gradi Celsius, nella posizione G in modo che la luce diventi verde.Fare clic su Start Droplet Generation (Avvia generazione di gocce) sul touch screen dello strumento e il coperchio del generatore di gocce si chiuderà automaticamente. Una volta completata la generazione delle gocce, controllare visivamente la piastra di raccolta del campione per confermare che uno strato di emulsione di gocce sia presente sopra la fase oleosa in ciascun pozzetto. Quindi, accendere il sigillatore a piastre e impostare la temperatura su 180 gradi Celsius e sigillare il tempo a cinque secondi.Consentire alla macchina di raggiungere la temperatura di esercizio. Quindi posizionare la piastra di raccolta del campione sul supporto della piastra del sigillante e posizionare un nuovo sigillo di alluminio sulla parte superiore della piastra con la linea rossa rivolta verso l'alto. Quando la sigillatrice di piastre ha raggiunto la temperatura di esercizio, premere Eject sul touch screen dello strumento.Dopo aver posizionato il portapiastre nel cassetto del sigillatore di piastre, premere il sigillo per chiudere il cassetto. Una volta completata la sigillatura, il cassetto si aprirà automaticamente. Rimuovere la piastra sigillata e posizionarla sul blocco freddo.Quindi spegnere il sigillante a piastre. Per eseguire la PCR, posizionare la piastra di raccolta delle gocce sigillata in una macchina PCR con un blocco di 96 pozzetti profondi. Al termine della PCR, accendere il lettore di gocce e il computer collegato.Caricare la piastra con i campioni post-PCR nel supporto della piastra del lettore di gocce. Mantenendo il coperchio della pellicola sulla piastra del campione, posizionare il coperchio sulla parte superiore del supporto e fissarlo in posizione con clip di bloccaggio nere. Quindi, per aprire il coperchio del lettore di gocce, premere il pulsante di apertura / chiusura.Quindi caricare il supporto della piastra del lettore di gocce con la piastra del campione nella camera del lettore e posizionarlo saldamente sulla base magnetica. Premere nuovamente il pulsante di apertura/chiusura per chiudere il coperchio. Aprire l'interfaccia del software di analisi.Selezionare la scheda Aggiungi piastra, fare clic su Aggiungi piastra e quindi su Configura piastra. Nella scheda Informazioni piastra, immettere un nome di targa, selezionare Supermix for Probes, No DUTP dal menu a discesa Supermix e immettere un nome file in Save Data File As.In scheda Selezione pozzi, evidenziare i pozzetti da analizzare e fare clic su Includi pozzi selezionati. Quindi, nella scheda Informazioni pozzo, selezionare i pozzi da annotare.Selezionare Quantificazione diretta dal menu a discesa Tipo di esperimento. Popolare quindi le caselle Descrizione esempio, Tipo di campione e Nome di destinazione e aggiungere note di pozzo e/o note di targa in base alle esigenze. Quindi fare clic su Applica.Una volta completata la configurazione della piastra, fare clic su Avvia corsa. Per l'analisi dei risultati, selezionare la scheda Analisi dati e aprire il file da analizzare dal menu File di dati personali. Quindi fate clic sulla scheda Ampiezza 1D per gli esperimenti a colore singolo o sulla scheda Ampiezza 2D per gli esperimenti a due colori.Quindi, selezionare i pozzi che richiedono la soglia. Usate lo strumento Modalità linea soglia per applicare manualmente la soglia nello spazio libero tra le popolazioni positiva e negativa sul grafico di ampiezza, assicurandovi che il mirino sia posizionato in modo tale che le quattro popolazioni di goccioline siano chiaramente separate. Una volta applicata la soglia per tutti i campioni, esportare i risultati come file CSV per ulteriori analisi facendo clic sulla scheda Tabella dati, Importa/Esporta, e selezionando Esporta dati visibili in CSV.Immettere un nome file adatto e fare clic su Salva. Le procedure di PCR e di lettura delle goccioline utilizzate in questo protocollo hanno dimostrato la presenza di popolazioni chiaramente separate di goccioline positive e negative, sia nei canali fam che esadecimali. Le popolazioni di DNA mitocondriale positive per entrambe le sonde potrebbero anche essere distinte dai lisati monocellulari.Questo metodo ha anche mostrato che per i campioni con delezioni nel DNA mitocondriale, è presente una popolazione mista di goccioline doppie positive e goccioline positive solo per la porzione non eliminata del DNA. Questo metodo è stato utilizzato con successo per contare il numero di copie del DNA mitocondriale per cellula in una varietà di cellule di mammifero, compresi gli ovociti di topo e le cellule embrionali primarie di topo. Inoltre, nelle cellule con eteroplasmia ad alta delezioni, la popolazione positiva per una singola sonda è risultata significativamente più grande della popolazione doppiamente positiva.Tuttavia, nelle cellule con eteroplasmia a bassa delezioni, entrambe le popolazioni erano di dimensioni simili. Quindi risultati accurati assicurano sempre che la generazione di goccioline abbia avuto successo e che la soglia sia stata applicata in modo appropriato utilizzando la vista di ampiezza 1D o 2D. Il lisato inutilizzato può essere utilizzato per altri saggi a singola cellula, come il pirosequenziamento, che può misurare l'eteroplasmia del polimorfismo a singolo nucleotide.Lo sviluppo di questa tecnica ci ha permesso di effettuare misurazioni accurate del numero di copie del DNA mitocondriale e dell'eteroplasmia da delezione nelle singole cellule, cosa che in precedenza non era possibile.

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Marcatori epigenetici sono utilizzati per sottotipi di globuli bianchi (WBC) attraverso la quantificazione dei modelli di metilazione del DNA. Questo protocollo presenta un metodo di reazione a catena di polimerasi a goccia multiplex (mdPCR) utilizzando un dispositivo microfluidometro termoplastico (TPE) per la generazione di droplet che consente una quantificazione mirata precisa e multiplex specifica della metilazione dei conteggi differenziali WBC.

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Misurazione del numero di copie del DNA mitocondriale a singola cellula e delleteroplasmia utilizzando la reazione a catena della polimerasi digitale a goccia (Video) | JoVE Journal

Misurazione del numero di copie del DNA mitocondriale a singola cellula e dell'eteroplasmia utilizzando la reazione a catena della polimerasi digitale a goccia

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