Name: Immunolabeling and Counting Ribbon Synapses in Young Adult and Aged Gerbil Cochleae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-21T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Scopri un protocollo di immunomarcatura per valutare l'integrità sinaptica nella coclea di gerbilli giovani e anziani. Questo metodo combina quenching dell'autofluorescenza e quantificazione per studiare la perdita uditiva legata all'età.

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Gli autori riconoscono Lichun Zhang per aver contribuito a stabilire il metodo e l'unità di servizio di microscopia a fluorescenza, Carl von Ossietzky University di Oldenburg, per l'uso delle strutture di imaging. Questa ricerca è stata finanziata dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondazione tedesca per la ricerca) nell'ambito della strategia di eccellenza della Germania -EXC 2177/1.

<ol><li>Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-induced+and+age-related+hearing+loss%3A+new+perspectives+and+potential+therapies+%5Bversion+1%3B+peer+review%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Noise-induced and age-related hearing loss: new perspectives and potential therapies [version 1; peer review.</a> F1000Research. 6 (927), (2017).</li>
<li>Heeringa, A. N., Koeppl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+aging+cochlea%3A+Towards+unraveling+the+functional+contributions+of+strial+dysfunction+and+synaptopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing%22%5BJournal%5D)">The aging cochlea: Towards unraveling the functional contributions of strial dysfunction and synaptopathy.</a> Hearing. 376, 111-124 (2019).</li>
<li>Liberman, L. D., Wang, H., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+gradients+of+ribbon+size+and+AMPA+receptor+expression+underlie+sensitivity+differences+among+cochlear-nerve%2Fhair-cell+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Opposing gradients of ribbon size and AMPA receptor expression underlie sensitivity differences among cochlear-nerve/hair-cell synapses.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (3), 801-808 (2011).</li>
<li>Khimich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+cell+synaptic+ribbons+are+essential+for+synchronous+auditory+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hair cell synaptic ribbons are essential for synchronous auditory signalling.</a> Nature. 434 (7035), 889-894 (2005).</li>
<li>Pangršič, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hearing+requires+otoferlin-dependent+efficient+replenishment+of+synaptic+vesicles+in+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Hearing requires otoferlin-dependent efficient replenishment of synaptic vesicles in hair cells.</a> Nature Neuroscience. 13 (7), 869-876 (2010).</li>
<li>Meyer, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+of+synapse+number%2C+structure+and+function+in+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tuning of synapse number, structure and function in the cochlea.</a> Nature Neuroscience. 12 (4), 444-453 (2009).</li>
<li>Zhang, L., Engler, S., Koepcke, L., Steenken, F., Koeppl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+gradients+of+ribbon+volume+and+AMPA-receptor+patch+volume+in+cochlear+afferent+synapses+on+gerbil+inner+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Concurrent gradients of ribbon volume and AMPA-receptor patch volume in cochlear afferent synapses on gerbil inner hair cells.</a> Hearing Research. 364, 81-89 (2018).</li>
<li>Steenken, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+decline+in+cochlear+ribbon+synapses+and+its+relation+to+different+metrics+of+auditory-nerve+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Age-related decline in cochlear ribbon synapses and its relation to different metrics of auditory-nerve activity.</a> Neurobiology of Aging. 108, 133-145 (2021).</li>
<li>Merchan-Perez, A., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+differences+among+afferent+synapses+on+cochlear+hair+cells%3A+Correlations+with+spontaneous+discharge+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural differences among afferent synapses on cochlear hair cells: Correlations with spontaneous discharge rate.</a> Journal of Comparative Neurology. 371 (2), 208-221 (1996).</li>
<li>Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-induced+cochlear+neuropathy+is+selective+for+fibers+with+low+spontaneous+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).</li>
<li>Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+Foxo3+causes+adult+onset+auditory+neuropathy+and+alters+cochlear+synapse+architecture+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).</li>
<li>Yin, Y., Liberman, L. D., Maison, S. F., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olivocochlear+innervation+maintains+the+normal+modiolar-pillar+and+habenular-cuticular+gradients+in+cochlear+synaptic+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Association+for+Research+in+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Olivocochlear innervation maintains the normal modiolar-pillar and habenular-cuticular gradients in cochlear synaptic morphology.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 15 (4), 571-583 (2014).</li>
<li>Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+exposure+modulates+cochlear+inner+hair+cell+ribbon+volumes%2C+correlating+with+changes+in+auditory+measures+in+the+FVB%2FnJ+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse.</a> Scientific Reports. 6 (1), 25056(2016).</li>
<li>Reijntjes, D. O. J., Köppl, C., Pyott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+gradients+in+inner+hair+cell-auditory+nerve+fiber+pre-+and+postsynaptic+proteins+differ+across+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Volume gradients in inner hair cell-auditory nerve fiber pre- and postsynaptic proteins differ across mouse strains.</a> Hearing Research. 390, 107933(2020).</li>
<li>Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-neuron+labeling+in+the+cat+auditory+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-neuron labeling in the cat auditory nerve.</a> Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).</li>
<li>Bourien, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+auditory+nerve+fibers+to+compound+action+potential+of+the+auditory+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Contribution of auditory nerve fibers to compound action potential of the auditory nerve.</a> Journal of Neurophysiology. 112 (5), 1025-1039 (2014).</li>
<li>Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+cochlear+synaptopathy%3A+An+early-onset+contributor+to+auditory+functional+decline%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Age-related cochlear synaptopathy: An early-onset contributor to auditory functional decline.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).</li>
<li>Viana, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+neuropathy+in+human+presbycusis%3A+Confocal+analysis+of+hidden+hearing+loss+in+post-mortem+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue.</a> Hearing Research. 327, 78-88 (2015).</li>
<li>Batrel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+potentials+recorded+at+the+round+window+enable+the+detection+of+low+spontaneous+rate+fibers+in+gerbil+auditory+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Mass potentials recorded at the round window enable the detection of low spontaneous rate fibers in gerbil auditory nerve.</a> PLoS ONE. 12 (1), 0169890(2017).</li>
<li>Jeffers, P. W. C., Bourien, J., Diuba, A., Puel, J. -L., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-induced+hearing+loss+in+gerbil%3A+Round+window+assays+of+synapse+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Noise-induced hearing loss in gerbil: Round window assays of synapse loss.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 699978(2021).</li>
<li>Gleich, O., Semmler, P., Strutz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+auditory+thresholds+and+loss+of+ribbon+synapses+at+inner+hair+cells+in+aged+gerbils%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Behavioral auditory thresholds and loss of ribbon synapses at inner hair cells in aged gerbils.</a> Experimental Gerontology. 84, 61-70 (2016).</li>
<li>Cheal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gerbil%3A+A+unique+model+for+research+on+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Aging+Research%22%5BJournal%5D)">The gerbil: A unique model for research on aging.</a> Experimental Aging Research. 12 (1), 3-21 (1986).</li>
<li>Gates, G. A., Mills, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presbycusis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Presbycusis.</a> The Lancet. 366 (9491), 1111-1120 (2005).</li>
<li>Ryan, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hearing+sensitivity+of+the+gerbil%2C+Meriones+unguiculatis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+Acoustical+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">Hearing sensitivity of the gerbil, Meriones unguiculatis.</a> The Journal of the Acoustical Society of America. 59 (5), 1222-1226 (1976).</li>
<li>Müller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cochlear+place-frequency+map+of+the+adult+and+developing+gerbil%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">The cochlear place-frequency map of the adult and developing gerbil.</a> Hearing Research. 94 (1-2), 148-156 (1996).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Reijntjes, D. O. J., Breitzler, J. L., Persic, D., Pyott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+the+intact+rodent+organ+of+Corti+for+RNAscope+and+immunolabeling%2C+confocal+microscopy%2C+and+quantitative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of the intact rodent organ of Corti for RNAscope and immunolabeling, confocal microscopy, and quantitative analysis.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100544(2021).</li>
<li>Hickman, T. T., Hashimoto, K., Liberman, L. D., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+migration+and+reorganization+after+noise+exposure+suggests+regeneration+in+a+mature+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Synaptic migration and reorganization after noise exposure suggests regeneration in a mature mammalian cochlea.</a> Scientific Reports. 10 (1), 19945(2020).</li>
<li>Gray, D. A., Woulfe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipofuscin+and+aging%3A+a+matter+of+toxic+waste%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+Aging+Knowledge+Environment%3A+SAGE+KE%22%5BJournal%5D)">Lipofuscin and aging: a matter of toxic waste.</a> Science of Aging Knowledge Environment: SAGE KE. 2005 (5), 1(2005).</li>
<li>Li, H. -S., Hultcrantz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+degeneration+of+the+organ+of+Corti+in+two+genotypes+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22ORL%3B+Journal+for+Oto-rhino-laryngology+and+Its+Related+Specialties%22%5BJournal%5D)">Age-related degeneration of the organ of Corti in two genotypes of mice.</a> ORL; Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 56 (2), 61-67 (1994).</li>
<li>Kobrina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+anatomical+and+physiological+markers+of+auditory+system+degeneration+with+behavioral+hearing+assessments+in+a+mouse+%28Mus+musculus%29+model+of+age-related+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Linking anatomical and physiological markers of auditory system degeneration with behavioral hearing assessments in a mouse (Mus musculus) model of age-related hearing loss.</a> Neurobiology of Aging. 96, 87-103 (2020).</li>
<li>Moreno-García, A., Kun, A., Calero, O., Medina, M., Calero, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+the+role+of+lipofuscin+in+age-related+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">An overview of the role of lipofuscin in age-related neurodegeneration.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 464(2018).</li>
<li>Jensen, T., Holten-Rossing, H., Svendsen, I., Jacobsen, C., Vainer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+myocardial+tissue+with+digital+autofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology+Informatics%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of myocardial tissue with digital autofluorescence microscopy.</a> Journal of Pathology Informatics. 7, 15(2016).</li>
<li>Kalluri, R., Monges-Hernandez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+gradients+in+the+size+of+inner+hair+cell+ribbons+emerge+before+the+onset+of+hearing+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Association+for+Research+in+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Spatial gradients in the size of inner hair cell ribbons emerge before the onset of hearing in rats.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 18 (3), 399-413 (2017).</li>
<li>Wu, P. Z., Liberman, L. D., Bennett, K., de Gruttola, V., O'Malley, J. T., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+neural+degeneration+in+the+human+cochlea%3A+Evidence+for+hidden+hearing+loss+in+the+aging+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Primary neural degeneration in the human cochlea: Evidence for hidden hearing loss in the aging ear.</a> Neuroscience. 407, 8-20 (2019).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Con il metodo delineato in questo protocollo, è possibile immunostare IHC e strutture sinaptiche nelle coclee da gerbilli giovani adulti e anziani, identificare presunte sinapsi funzionali mediante co-localizzazione di elementi pre- e postsinaptici, assegnarle a singoli IHC e quantificare il loro numero, volume e posizione. Gli anticorpi utilizzati in questo approccio hanno anche etichettato le cellule ciliate esterne (OHC; mioVIIa) e i loro nastri presinaptici. Inoltre, una valida alternativa per l'immunolabeling sia de...

La perdita dell'udito legata all'età è una delle malattie più diffuse al mondo che colpisce più di un terzo della popolazione mondiale di età pari o superiore a 65 anni e1. Le cause sottostanti sono ancora in discussione e attivamente indagate, ma possono includere la perdita delle sinapsi specializzate che collegano le cellule ciliate interne (IHC) con le fibre nervose uditive afferenti2. Queste sinapsi a nastro comprendono una struttura presinaptica che ha vescicole piene del neurotrasmettitore glutammato legato ad esso, così come i recettori del glutammato postsinaptico α-ammino-3-idrossi-5-metil-4-isossazolepropionico (AMPA) 3,4,5. Nel gerbillo, ~ 20 fibre nervose uditive afferenti contattano un IHC 6,7,8. Le fibre sull'IHC di fronte al modiolo si oppongono ai grandi nastri sinaptici, mentre le fibre che si collegano sul lato del pilastro dell'IHC affrontano piccoli nastri sinaptici (cioè nei gatti9, gerbilli7, porcellini d'India10 e topi 3,11,12,13,14). Inoltre, nel gerbillo, la dimensione dei nastri presinaptici e dei cerotti di glutammato postsinaptico sono positivamente correlati 7,14. Le fibre che si oppongono ai grandi nastri sul lato modiolare dell'IHC sono di piccolo calibro e hanno bassi tassi spontanei e soglie elevate15. Ci sono prove che le fibre a basso tasso spontaneo sono più vulnerabili all'esposizione al rumore10 e ai farmaci ototossici16 rispetto alle fibre a bassa soglia ad alta spontaneità, che si trovano sul lato del pilastro degli IHC15.
La perdita di sinapsi del nastro è il primo evento degenerativo nella perdita dell'udito correlata all'età neurale cocleare, mentre la perdita delle cellule gangliari a spirale e delle loro fibre nervose uditive afferenti è in ritardo rispetto a17,18. I correlati elettrofisiologici includono registrazioni delle risposte uditive del tronco cerebrale17 e dei potenziali d'azione composti8; tuttavia, questi non riflettono le sottigliezze della perdita di sinapsi, poiché le fibre a basso tasso spontaneo non contribuiscono a queste misure16. Metriche elettrofisiologiche più promettenti sono l'indice neurale derivato dal potenziale di massa19 e la risposta temporale peristimulo20. Tuttavia, questi sono affidabili solo se l'animale non ha altre patologie cocleari, oltre alla perdita di fibre nervose uditive, che influenzano l'attività delle restanti fibre nervose uditive8. Inoltre, le soglie valutate comportamentalmente nel gerbillo non erano correlate con i numeri di sinapsi21. Pertanto, una quantificazione affidabile delle sinapsi del nastro sopravvissute e, quindi, del numero di fibre nervose uditive funzionali è possibile solo mediante l'esame diretto del tessuto cocleare.
Il gerbillo mongolo (Meriones unguiculatus) è un modello animale adatto per lo studio della perdita dell'udito legata all'età. Ha una breve durata della vita, ha un udito a bassa frequenza simile agli esseri umani, è facile da mantenere e mostra somiglianze con patologie umane legate alla perdita dell'udito legata all'età 2,22,23,24. I gerbilli sono considerati invecchiati quando raggiungono i 36 mesi di età, che è vicino alla fine della loro vita mediadi 22 anni. È importante sottolineare che una perdita di sinapsi del nastro legata all'età è stata dimostrata in gerbilli allevati e invecchiati in ambienti tranquilli 8,21.
Qui viene presentato un protocollo per immunolabel, sezionare e analizzare le coclee da gerbilli di diverse età, dai giovani adulti agli anziani. Vengono utilizzati anticorpi diretti contro i componenti della presinapsi (CtBP2), i cerotti del recettore postsinaptico del glutammato (GluA2) e gli IHC (myoVIIa). Viene applicato un quencher ad autofluorescenza che riduce lo sfondo nelle coclee invecchiate e lascia intatto il segnale di fluorescenza. Inoltre, viene fornita una descrizione di come sezionare la coclea per esaminare sia l'epitelio sensoriale che la stria vascolare. La lunghezza cocleare viene misurata per consentire la selezione di posizioni cocleari distinte che corrispondono a specifiche migliori frequenze25. La quantificazione dei numeri delle sinapsi viene effettuata con il software liberamente disponibile ImageJ26. Un'ulteriore quantificazione dei volumi e delle posizioni delle sinapsi all'interno del singolo HC viene eseguita con un software personalizzato scritto in Matlab. Questo software non è reso disponibile al pubblico, in quanto gli autori non hanno le risorse per fornire documentazione e supporto professionali.

<table><tbody><tr><td>Frazione di albumina V senza biotina</td><td>Carl Roth</td><td>0163.2</td><td></td></tr><tr><td>anti-CtBP2 (topo monoclonale IgG1)</td><td>BD Biosciences, Eysins</td><td>612044</td><td></td></tr><tr><td>anti-GluA2 (topo monoclonale IgG2a)</td><td>Millipore</td><td>MAB39</td><td></td></tr><tr><td>anti-topo (IgG1)-AF 488</td><td>Molecular Probes Inc.</td><td>A21121</td><td></td></tr><tr><td>anti-miosinaVIIa (coniglio policlonale IgG)</td><td>Proteus Biosciences</td><td>25e6790</td><td></td></tr><tr><td>Portalama & Breaker - Flat Jaws</td><td>Fine Science Tools</td><td>10052-11</td><td></td></tr><tr><td>Forbici per arteria Bonn - Punta a sfera</td><td>Fine Science Tools</td><td>14086-09</td><td></td></tr><tr><td>Spessore vetrino coprioggetto 1,5H, 24 x 60 mm</td><td>Carl Roth</td><td>LH26.1</td><td></td></tr><tr><td>Lama chirurgica monouso</td><td>Henry Schein</td><td>0473</td><td></td></tr><tr><td>asino anti-coniglio (IgG)-AF647</td><td>Life Technologies-Molecular Probes</td><td>A-31573</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 - Pinza fine</td><td>Strumenti per la scienza</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5SF Forcipe</td><td>per la scienza</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo, assoluto 99,8%</td><td>Fisher Scientific</td><td>12468750</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico</td><td>Carl Roth</td><td>8040.2</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Feather Lama a doppio taglio</td><td>PLANO</td><td>112-9</td><td></td></tr><tr><td>G19 Cannula</td><td>Henry Schein</td><td>9003633</td><td></td></tr><tr><td>capra anti-topo (IgG2a)-AF568</td><td>Invitrogen</td><td>A-21134</td><td></td></tr><tr><td>Eparina</td><td>Ratiopharm</td><td>N68542.04</td><td></td></tr><tr><td>Huygens Essentials</td><td>Scientific Volume Imaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Fiji</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersol, Olio da immersione 518F</td><td>Carl Zeiss</td><td>10539438</td><td></td></tr><tr><td>Intrafix Primeline Classic, 150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung)</td><td>Braun</td><td>4062957E</td><td></td></tr><tr><td>ISM596D</td><td>Pompa peristaltica</td><td>Ismatec</td><td></td></tr><tr><td>KL 1600 LED</td><td>Schott</td><td>150.600</td><td>Sorgente luminosa per stereomicroscopio</td></tr><tr><td>Leica Suite di applicazioni X</td><td>Leica Microsystem CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema Leica TCS SP8</td><td>Leica Microsystem CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>The Mathworks Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forbici Mayo Tungston Carbide ToghCut</td><td>Fine Science Tools</td><td>14512-17</td><td></td></tr><tr><td>Mini-100 Orbital-Genie</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-M100</td><td>per l'uso in ambienti freddi</td></tr><tr><td>Narcoren (pentobarbital)</td><td>Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ni-Ei</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements</td><td>Nikon Europe B.V.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Carl Roth</td><td>0335.3</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri senza prese d'aria</td><td>Avantor VWR</td><td>390-1375</td><td></td></tr><tr><td><forte>Soluzione salina tamponata con fosfato:</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfato disodico</td><td>AppliChem</td><td>A1046</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato monopotassico</td><td>Carl Roth</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Carl Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31434-M</td><td></td></tr><tr><td>Contenitori con tappo a vite</td><td>Sarstedt</td><td>75.562.300</td><td></td></tr><tr><td>Sodio azide</td><td>Carl Roth</td><td>K305.1</td><td></td></tr><tr><td>Studente Adson Forcipe</td><td>Fine Science Tools</td><td>91106-12</td><td></td></tr><tr><td>Studente Halsted-Mosquito Hemostat</td><td>Fine Science Tools</td><td>91308-12</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio di adesione Superfrost</td><td>Epredia</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Triton&nbsp; X</td><td>Carl Roth</td><td>3051.2</td><td></td></tr><tr><td>TrueBlack Lipofuscin Autofluorescenza Quencher</td><td>Biotium</td><td>23007</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Forbici a molla,</td><td>3mm Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Antifade Montaggio Medio</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Vibrax VXR base</td><td>IKA</td><td>0002819000</td><td></td></tr><tr><td>VX 7 Attacco per piatto Vibrax VXR basic</td><td>IKA</td><td>953300</td><td></td></tr><tr><td>Wild TYP 355110 (Stereomicroscopio)</td><td>Wild Heerbrugg</td><td></td><td>non più disponibile</td></tr></tbody></table>

immunolabeling and counting ribbon synapses in young adult and aged gerbil cochleae

Immunolabeling and Counting Ribbon Synapses in Young Adult and Aged Gerbil Cochleae

Si presume che la perdita di sinapsi a nastro che collegano le cellule ciliate interne e le fibre nervose uditive afferenti sia una delle cause della perdita dell'udito legata all'età. Il metodo più comune per rilevare la perdita di sinapsi del nastro è l'immunolabeling perché consente il campionamento quantitativo da diverse posizioni tonotopiche in una singola coclea. Tuttavia, le strutture di interesse sono sepolte in profondità all'interno della coclea ossea. I gerbilli sono usati come modello animale per la perdita dell'udito legata all'età. Qui vengono descritti i protocolli di routine per la fissazione, l'immunolabeling dei gerbilli cocleari interi mount, l'imaging confocale e la quantificazione dei numeri e dei volumi delle sinapsi del nastro. Inoltre, vengono evidenziate le particolari sfide associate all'ottenimento di buon materiale da individui invecchiati di valore. 
I gerbilli vengono eutanasizzati e perfusi per via cardiovascolare, o le loro bolle timpaniche vengono accuratamente sezionate fuori dal cranio. Le coclee vengono aperte all'apice e alla base e trasferite direttamente al fissativo. Indipendentemente dal metodo iniziale, le coclee vengono postfisse e successivamente decalcificate. Il tessuto viene quindi etichettato con anticorpi primari contro le strutture pre- e postsinaptiche e le cellule ciliate. Successivamente, le coclee vengono incubate con anticorpi secondari marcati con fluorescenza che sono specifici contro i rispettivi primari. Le coclee dei gerbilli invecchiati vengono quindi trattate con un quencher di autofluorescenza per ridurre la fluorescenza di fondo tipicamente sostanziale dei tessuti degli animali più anziani. 
Infine, le coclee vengono sezionate in 6-11 segmenti. L'intera lunghezza cocleare viene ricostruita in modo tale che specifiche posizioni cocleari possano essere determinate in modo affidabile tra gli individui. Le pile di immagini confocali, acquisite in sequenza, aiutano a visualizzare le cellule ciliate e le sinapsi nei luoghi scelti. Le pile confocali sono deconvolte e le sinapsi vengono contate manualmente utilizzando ImageJ, oppure viene eseguita una quantificazione più estesa delle strutture sinaptiche con procedure di analisi delle immagini scritte su misura in Matlab.

Le coclee sono state raccolte dopo perfusione cardiovascolare con fissativo dell'intero animale o rapidamente sezionate dopo l'eutanasia dell'animale e fissate per immersione. Con quest'ultimo metodo, gli IHC sono rimasti in posizione durante la dissezione, mentre, in caso di perfusione infruttuosa e quindi tessuto non sufficientemente fissato, l'epitelio sensoriale è stato spesso distrutto. Si noti che gli autori hanno riscontrato casi in cui la fissazione delle coclee dopo la perfusione transcardica era insufficiente m...

Viene presentato un protocollo per l'elaborazione di coclee di gerbillo giovani adulti e invecchiati immunomarcando le strutture sinaptiche afferenti e le cellule ciliate, spegnendo l'autofluorescenza nei tessuti invecchiati, sezionando e stimando la lunghezza delle coclee e quantificando le sinapsi in pile di immagini ottenute con l'imaging confocale.

The loss of ribbon synapses connecting inner hair cells and afferent auditory nerve fibers is assumed to be one cause of age-related hearing loss. The ...

Questo protocollo consente la valutazione dell'integrità sinaptica nella coclea del gerbillo di tutte le età. Questo è importante per la ricerca fondamentale sui problemi di udito, in particolare a causa dell'invecchiamento. Il protocollo è relativamente veloce e fornisce dati quantitativi da diverse posizioni lungo la coclea.Inoltre, affronta un problema specifico dell'invecchiamento del tessuto utilizzando un quencher ad autofluorescenza. La degenerazione delle sinapsi è il primo segno di perdita di funzione nella coclea. Quantificarlo è uno strumento importante nella ricerca verso lo sviluppo di strumenti diagnostici non invasivi per la sinaptopatia.La dissezione cocleare è la parte più cruciale che richiede pratica, quindi è meglio iniziare con cochli non sperimentali. Inizia rimuovendo le bolle. Tagliare l'osso con le forbici o rompere l'osso con una pinza e rimuoverlo con una pinza per raggiungere la coclea.Rimuovere il malleus, l'incus e i canali semicircolari. Rimuovere con cura l'osso che copre l'apice della coclea e graffiare l'osso cocleare con una pinza per fare piccoli fori all'apice e nel giro basale o fare accuratamente fori in entrambe le posizioni. Trasferire immediatamente le bolle in almeno 50 millilitri di fissativo freddo.Per tagliare i cochli a metà, posizionare un pezzo di lama di rasoio più lungo della lunghezza arrotolata della coclea in un supporto per lama. Quindi, posizionare la coclea in una capsula di Petri sotto uno stereomicroscopio. Tagliare via il tessuto in eccesso con una lama di rasoio o con forbici fini.Tenere la coclea in posizione con una pinza fine e tagliarla a metà lungo il modiolo. Preparare una soluzione al 5% del quencher ad autofluorescenza mescolandola con etanolo al 70%. Posizionare i cochli in questa soluzione e incubarlo per un minuto a temperatura ambiente su uno shaker seguito da lavare tre volte con un millilitro di PBS per cinque minuti.Per la dissezione della coclea, raccogliere due pinze fini, pinze super-fini, vannas, forbici a molla, un supporto per lame, una lama di rasoio e riempire la capsula di Petri in polistirolo e il suo coperchio con PBS. Rompere i pezzi dalla lama del rasoio per ottenere una superficie di taglio da due a quattro millimetri. Tagliare la coclea a metà come mostrato nella sezione per la preparazione dei tessuti.Fissare con cura la metà cocleare con la pinza in modo tale che il bordo tagliato sia rivolto verso l'alto. Utilizzare forbici a molla fine per tagliare via l'osso della coclea sopra l'elicotrema che copre l'apice. Quindi, utilizzare le forbici per isolare il giro apicale tagliando il modiolo e il nervo uditivo e il vestibolo della scala.Fare due tagli su ciascun lato dell'osso cocleare sopra, o se la stria vascolare non è necessaria per un'ulteriore valutazione, direttamente attraverso la stria vascolare del giro centrale. Usa la lama del rasoio per separare i pezzi cocleari. In alternativa, tagliare tra l'organo di Corti e la stria vascolare.Lasciare la stria vascolare collegata al legamento a spirale e rimuovere l'osso decalcificato usando una pinza. Quindi, trasferire i pezzi cocleari in un coperchio della capsula di Petri riempito con PBS. Rimuovere il tessuto in eccesso sul pilastro e sui lati modiolari in modo tale che l'intero supporto si trovi successivamente sulla diapositiva il più piatto possibile.I pezzi cocleari di grandi dimensioni, in particolare quelli provenienti dal giro basale, dovrebbero essere tagliati in due pezzi. Rimuovere con cura la membrana tectoriale con una pinza super-fine. Posizionare i pezzi cocleari su una diapositiva in una goccia di mezzo di montaggio, assicurandosi che l'organo di Corti sia rivolto verso l'alto.Sposta il pezzo cocleare nel piano sagittale e cerca l'invaginazione del limbus a spirale in prossimità delle cellule ciliate interne. Questa invaginazione del limbus a spirale può essere vista più chiaramente nei pezzi cocleari centrali e basali. Trasferire l'intera coclea e l'intera stria vascolare sul vetrino del microscopio ripetendo questi passaggi.Coprire scivolare la diapositiva e aggiungere smalto nero intorno ai bordi per sigillare. Asciugare al buio e conservarli a quattro gradi Celsius. Apri una copia degli stack deconvolti nel software ImageJ caricato con il plugin BioVoxxel.Dividere i canali facendo clic su Immagine, quindi su Colore e quindi su Dividi canali. Uniscili facendo clic su Immagine, quindi su Colore e quindi su Unisci canali per assegnare colori diversi. Converti l'immagine in uno stack RGB facendo clic su Immagine, quindi vai su Colore e fai clic su Impila in RGB.Regola la luminosità e il contrasto facendo clic su Immagine, Regola e quindi su Luminosità/Contrasto. Utilizzare l'auto o il dispositivo di scorrimento per garantire che le strutture pre e post-sinaptiche e le etichette interne delle cellule ciliate siano distinte dallo sfondo. Etichetta cinque celle ciliate interne con lo strumento testo facendo clic sulla posizione desiderata all'interno della pila.Quindi, vai su Analizza, quindi su Strumenti e seleziona ROI Manager. Seleziona le etichette delle caselle di controllo per etichettare i punti con un numero. Ingrandisci la cellula ciliata interna di interesse.Fare clic con il pulsante destro del mouse sullo strumento punto per scegliere la modalità multipunto. Scorrere la dimensione Z e contare le sinapsi funzionali del nastro, che sono identificate da un nastro pre-sinaptico in giustapposizione a un cerotto di glutammato post-sinaptico. Dopo aver selezionato tutte le strutture di interesse, fai clic su Aggiungi il ROI Manager, quindi fai clic sul nome arbitrario e scegli Rinomina.Con lo strumento manuale, regola l'immagine per visualizzare completamente la cella ciliata interna successiva. Passare dallo strumento Multipunto allo strumento Punto per evitare di aggiungere ulteriori puncta ai dati memorizzati in precedenza. Fare clic su una struttura di interesse all'interno della cella ciliata interna successiva e passare allo strumento Multipunto.Continuare ad aggiungere la sinapsi funzionale del nastro nel ROI Manager fino a quando tutte le cellule ciliate interne non vengono valutate. Fare clic su un set di dati nel ROI Manager e quindi su Misura. Attendi che appaia una nuova finestra che elenca i punti dati misurati e fai clic su File e Salva con nome per salvare questo elenco come foglio di calcolo.Salva l'immagine attivando Mostra tutto nel ROI Manager. Fare clic su Appiattisci per aggiungere definitivamente le etichette dei punti allo stack e fare clic su Accetto per chiudere salvando le modifiche. Le proiezioni della pila Z dalla coclea di un giovane gerbillo di 10 mesi mostrano che le cellule ciliate interne marcate con miosina 7A delineate qui da linee tratteggiate bianche erano in netto contrasto con lo sfondo.I nastri pre-sinaptici sono stati etichettati con anti-CtBP2 due mostrati in verde, mentre i cerotti di glutammato post-sinaptico sono stati etichettati con anti-GluA2 mostrato in rosso. La coclea di un vecchio gerbillo di 38 mesi è stata trattata con il quencher ad autofluorescenza e ha mostrato cellule ciliate interne distinte con strutture pre e post-sinaptiche chiaramente visibili. Per testare la stabilità dell'immunolabeling, lo stesso pezzo di coclea del giovane gerbillo è stato ripreso dopo tre mesi e 29 mesi e mezzo.Nonostante il ridotto rapporto segnale-rumore, le sinapsi funzionali erano distinte e quantificabili. Anche se un taglio fallisce, montare il pezzo di tessuto rimanente per stimare successivamente l'intera lunghezza cocleare in modo più accurato. I dati di questo protocollo sono particolarmente preziosi se preceduti e quindi correlati individualmente con test dell'udito elettrofisiologici o psicofisici.

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Questo protocollo dettagli come quantificare il numero delle sinapsi sia dissociato cultura neuronale e nelle sezioni cerebrali con immunocitochimica. Utilizzando vano anticorpi specifici, abbiamo etichetta terminali presinaptici così come i luoghi di specializzazione post-sinaptici. Si definiscono sinapsi come punti di colocalizzazione tra i segnali generati da questi marcatori.

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Questo articolo video illustra un protocollo completo per rilevare e quantificare tutte le fasi della neurogenesi ippocampale adulta all'interno della stessa sezione di tessuto. Abbiamo elaborato un metodo per superare i limiti dell'immunofluorescenza multipla indiretta che si verificano quando non sono disponibili anticorpi adatti da diverse specie ospiti.

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Questo manoscritto descrive un protocollo sperimentale per valutare le caratteristiche morfologiche e lo stato funzionale delle sinapsi del nastro nei topi normali. Il modello attuale è adatto anche per modelli con sinaptopatia cocleare indotta dal rumore e legati all'età. Vengono inoltre discussi i risultati correlati dei precedenti studi sul mouse.

Valutazione morfologica e funzionale delle sinapsi del nastro nelle specifiche regioni di frequenza della Coclea del topo

Questo articolo presenta un metodo di preparazione della superficie cocleare modificato che richiede la decalcificazione e l'uso di un adesivo per cellule e tessuti per aderire i pezzi di epitemi cocleari a 10 mm rotondi schede di copertura per l'immunostochimica nelle cocleee di topo adulto.

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Scopri un protocollo di immunomarcatura per valutare l'integrità sinaptica nella coclea di gerbilli giovani e anziani. Questo metodo combina quenching dell'autofluorescenza e quantificazione per studiare la perdita uditiva legata all'età.

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