Name: Trifosforilazione chimica degli oligonucleotidi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T13:40:00.000+00:00
Duration: 13 min 19 s
Description: Impara la trifosforilazione chimica degli oligonucleotidi usando salicil fosforocloridite e pirofosfato. Questo metodo versatile consente la sintesi di RNA, DNA e L-RNA trifosforilati per applicazioni in biotecnologia e biologia sintetica.

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Gli autori sono grati a Greg Springsteen, Natasha Paul, Charles Olea, Jr., Jonathan Sczepanski e Katrina Tjhung per le utili discussioni sulle migliori pratiche per le reazioni di trifosforilazione chimica e a Gerald Joyce per i commenti utili. Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione MCB 2114588 dalla National Science Foundation.

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

La procedura di trifosforilazione qui descritta è ampiamente compatibile con la sintesi di oligonucleotidi utilizzando la chimica standard della fosforamidite. I nucleosidici fosfomiditi dovrebbero avere gruppi protettivi labili di base compatibili con la deprotezione rapida in AMA39, compresi i gruppi standard β-cianoetile sul fosfito e isobutirrile, dimetilformamidile, acetil, fenossiacetile o 4-isopropilfenossiacetil sulle ammine esocicliche delle nucleobasi. I gruppi ribosio 2'-idrossile devono essere protetti da gruppi che proteggono il silile, t-butildimetilsilil (TBDMS) o tri-iso-propilsillilossimetile (TOM)40,41. Anche il gruppo pivaloilossimetile (PivOM) labile di base è stato segnalato per essere compatibile con la trifosforilazione chimica30.
Sono stati descritti diversi metodi per la trifosforilazione chimica degli oligonucleotidi sintetici 28,29,30,31,32,33,34,35. Abbiamo scoperto che la trifosforilazione con il reagente ludwig-Eckstein37 è una delle più accessibili, non richiedendo alcuna sintesi specializzata di reagenti e nessuna attrezzatura specializzata. Gli oligonucleotidi 5′-trifosfati preparati con questo metodo sono stati utilizzati di routine come substrati per i ribozimi dell'RNA ligasi, incluso l'uso di trifosfati oligonucleotidici L-RNA enzimaticamente inaccessibili per ottenere la sintesi dipendente dal modello e la replicazione di questo acido nucleico "mirror-image" 14,16,17,18 . Il metodo è adatto anche per la preparazione di piccoli RNA stem-loop 5′-trifosforilati che sono potenti attivatori della risposta immunitaria innata nei vertebrati 6,7.
Il reagente di Ludwig-Eckstein, salicil fosforocloridite37, è altamente reattivo all'acqua e elimina efficacemente l'acqua introdotta durante la dissoluzione del reagente prima del caricamento sulla colonna oligonucleotidica. Dopo questo punto, tuttavia, l'oligonucleotide 5′-fosfolilato reagirà preferenzialmente con qualsiasi acqua introdotta nel sistema su pirofosfato, formando un prodotto laterale 5′-H-fosfonato dopo il workup 28,37,38. Un'attenta preparazione dei reagenti di trifosforilazione e la camera di reazione di trifosforilazione assicurano che questo prodotto laterale non si formi. Per l'essiccazione con solvente, i setacci molecolari di tipo 4 Å sono venduti preconfezionati in sacchetti di teflon compatibili con la maggior parte dei solventi organici con vari marchi dalla maggior parte delle aziende di reagenti di sintesi di oligonucleotidi. Ulteriori precauzioni, come l'esecuzione della trifosforilazione in un vano portaoggetti in atmosfera anidra, non sono generalmente necessarie.
La reazione dell'oligonucleotide 5′-fosfolilato con TBAP forma un intermedio ciclico 5′-trimetafosfito, che viene poi ossidato al ciclico 5′-trimetafosfato usando una soluzione ossidante di sintesi oligonucleotidica (iodio in acqua/piridina/THF). Va notato che le soluzioni ossidanti commerciali utilizzano quantità variabili di iodio ed è essenziale utilizzare l'alta concentrazione di iodio di 0,1 M per garantire la completa ossidazione al trifosfato. Il prodotto ciclico viene idrolizzato al 5′-trifosfato lineare finale nella stessa soluzione37 e devono essere utilizzate soluzioni ossidanti anidre alternative se si desidera la linearizzazione con nucleofili diversi dall'acqua (vedi sotto per le applicazioni)33. L'eventuale trimetafosfato ciclico residuo, tuttavia, sarà linearizzato durante la successiva deprotezione alcalina dell'oligonucleotide. L'idrolisi del 5′-trimetafosfato ciclico produce solo il trifosfato lineare, piuttosto che ramificato37,46.
La deprotezione degli oligonucleotidi in genere non ha bisogno di essere modificata per ospitare la 5′ trifosforilazione, ma devono essere prese alcune precauzioni. Il trifosfato è relativamente stabile a breve esposizione a condizioni alcaline, ma bisogna fare attenzione a non esporre il trifosfato all'AMA più a lungo del necessario. Dovrebbe essere evitata la protezione dei gruppi che richiedono un trattamento più prolungato in ammoniaca o AMA per più di 10 minuti a 65 °C. Trattamenti più delicati, come 2 ore di ammoniaca a temperatura ambiente sono accettabili se compatibili con altri gruppi protettivi di fosforamidite. Un metodo di deprotezione comune e veloce per oligonucleotidi di RNA sintetico protetti da silile utilizza trietilammina triidrofluoruro e alta temperatura47; tuttavia, questo dovrebbe essere evitato quando si preparano RNA 5′-trifosfati poiché le condizioni acide prolungate accelerano l'idrolisi del trifosfato31,32.
Preparative PAGE ha dimostrato di essere il metodo più semplice e affidabile per la purificazione post-protezione degli oligonucleotidi trifosforilati 5′ (Figura 3 e Figura 4). Tuttavia, l'HPLC preparativo in fase inversa può essere utilizzato anche per purificare i prodotti trifosforilati. La presenza di prodotti a base di 5′-difosfato e, in misura minore, di 5′-monofosfato viene osservata di routine quando si verifica la trifosforilazione mediante spettrometria di massa. Abbiamo osservato la frammentazione del 5′-trifosfato durante la spettrometria di massa da materiale altamente puro preparato per sintesi chimica o trascrizione, in particolare se lo strumento non è ottimizzato per l'analisi degli oligonucleotidi. Tuttavia, l'analisi RP-LC mostra spesso che il 10%-20% del prodotto laterale 5′-difosfato è presente in oligonucleotidi 5′-trifosforilati più lunghi (Figura 4). I preparati commerciali di pirofosfato di tributilammonio possono essere contaminati fino al 20% di monofosfato, che produrrà 5′-difosfato come prodotto collaterale durante la trifosforilazione30,31. Un'attenta preparazione di questo reagente in-house può produrre scorte TBAP molto più pure31. Tuttavia, abbiamo scoperto che gli oligonucleotidi trifosforilati utilizzando fonti commerciali di TBAP mostrano ancora una reattività comparabile o maggiore se usati come substrati nelle reazioni enzimatiche (Figura 5B), rispetto al materiale preparato mediante trascrizione in vitro.
Un notevole ulteriore uso della trifosforilazione oligonucleotidica con il reagente di Ludwig-Eckstein sfrutta l'intermedio ciclico trimetafosfito33. Se la successiva fase di ossidazione viene condotta con perossido di t-butile 1 M negli esani, che viene spesso utilizzato per l'ossidazione degli oligonucleotidi in condizioni anidre, l'ossidazione del fosfito avviene senza idrolisi di apertura dell'anello, producendo il trimetafosfato ciclico. Questo intermedio può quindi essere fatto reagire con nucleofili primari di ammina o alcol per produrre 5′-trifosfati con modifiche al γ-fosfato. Queste modifiche includono l'aggiunta di un tag lipofilo collegato da un legame fosforamidato, che facilita la rapida purificazione specifica del trifosfato mediante RP-LC, seguita da idrolisi acida del tag dal trifosfato33. Le modifiche fluorescenti nella posizione γ-fosfato possono anche essere introdotte per l'uso come reporter fluorescenti in tempo reale per le reazioni di legatura catalizzate da ribozima15,33.

La forma 5′-tripfosforilata dell'RNA è onnipresente in biologia in quanto è generata dalla trascrizione dell'RNA in tutti i domini della vita e dalla replicazione dell'RNA durante il ciclo di vita di molti virus a RNA. Questi trifosfati fungono da substrato per la formazione di mRNA con 7-metilguanilato negli eucarioti e, quindi, svolgono un ruolo essenziale nell'espressione proteica1. Al contrario, il trifosfato viene trattenuto in batteri e virus; pertanto, l'RNA 5′-trifosfati è riconosciuto dai regolatori di risposta immunitaria innati negli eucarioti 2,3,4,5,6,7. Al di fuori della biologia, una serie di ribozimi di RNA ligasi sono stati evoluti per utilizzare il 5′-trifosfato in vitro8 e modificati per l'uso nei saggi diagnostici 9,10,11,12,13,14,15. Uno di questi ribozimi può essere utilizzato per la sintesi template-dipendente di L-RNA, l'enantiomero non biologico "mirror-image" del D-RNA naturale, da piccoli oligonucleotidi L-RNA 5′-trifosfati 16,17,18. La preparazione di routine di oligonucleotidi trifosforilati di varia sequenza e composizione della spina dorsale è essenziale per studiare questi sistemi.
Il metodo più comune e accessibile per preparare l'RNA 5′-trifosfati in laboratorio è la trascrizione in vitro. Tuttavia, l'RNA prodotto con questo metodo è limitato in sequenza e dimensioni dai requisiti del promotore e del substrato dell'enzima RNA polimerasi. T7 RNA polimerasi e derivati specializzati sono le polimerasi più comuni utilizzate a questo scopo 19,20,21,22. L'RNA trascritto in vitro preparato con questi enzimi deve essere iniziato con una purina 5′-terminale ed è fortemente sbilanciato verso le purine nei primi 10 nucleotidi23,24. Inoltre, l'incorporazione enzimatica di nucleotidi modificati dalla base o dalla spina dorsale è nel migliore dei casi inefficiente e più spesso impossibile con le polimerasi naturali, limitando l'opportunità di produrre oligonucleotidi 5′-trifosfati composti da tutt'altro che D-RNA naturale. Un altro fattore limitante è che l'RNA generato dalla trascrizione in vitro può contenere una sostanziale eterogeneità di 5′ e 3′ ed è prodotto come prodotti estremamente eterogenei quando è inferiore a 20 nt 23,24,25,26,27.
Al contrario, la trifosforilazione chimica degli oligonucleotidi preparati mediante sintesi di fosforamidite in fase solida 28,29,30,31,32,33,34,35 può essere utilizzata per preparare oligonucleotidi 5′-trifosfati lunghi 3-50 nt, di qualsiasi sequenza. Inoltre, una vasta gamma di modificazioni dell'acido nucleico accessibili alla sintesi della fosforamidite possono essere aggiunte agli oligonucleotidi prima della 5′-tripfosforilazione 14,15,16,17,18,29,36. Molti di questi metodi utilizzano il reagente di fosfolilazione salicil fosforocloridite, sviluppato da Ludwig ed Eckstein per la trifosforilazione in fase di soluzione dei mononucleosidi37. La trifosforilazione degli oligonucleotidi con questo reagente si ottiene in fase solida mediante fosfolilazione dell'oligonucleotide 5′-idrossile, conversione al trifosfato per reazione con pirofosfato e ossidazione, seguita da procedure standard per la scissione dell'oligonucleotide dal supporto solido, la deprotezione e la purificazione (Figura 1)28.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig01v2.jpg"> Figura 1: Schema per la trifosforilazione di oligonucleotidi sintetici. Nella prima fase, l'oligonucleotide 5ʹ-idrossile viene fosfolilato con SalPCl. Nella fase successiva, il fosfito 5ʹ-salicile viene fatto reagire con TBAP per formare il metafosfito ciclico, quindi nella terza fase ossidato per generare il ciclico 5ʹ-trimetafosfato nella soluzione di ossidazione del sintetizzatore DNA/RNA (0,1 M Iodio/piridina/H2O/THF), che viene rapidamente idrolizzato per produrre il 5ʹ-trifosfato lineare nella stessa soluzione28,33, 37. La successiva scissione alcalina dal supporto solido del CPG e la deprotezione dell'oligonucleotide nel MeNH2/ammoniaca acquosa idrolizzeranno qualsiasi trimetafosfato ciclico residuo nella forma lineare. Abbreviazioni: SalPCl = salicyl phosphorochloridite; TBAP = tributilammonio pirofosfato; THF = tetraidrofurano; CPG = vetro a pori controllati; MeNH2 = metilammina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Sebbene i primi rapporti pubblicati che utilizzano questo metodo spesso soffrissero di scarse rese e prodotti collaterali indesiderati 28,37,38, un attento mantenimento delle condizioni anidre è tutto ciò che è necessario per ottenere regolarmente rese elevate. Ciò può essere ottenuto mediante un'attenta preparazione dei reagenti e l'uso di un semplice dispositivo di reazione assemblato da componenti in plastica standard. Qui, dimostriamo i passaggi appropriati per la trifosforilazione chimica degli oligonucleotidi, compresa la preparazione dei reagenti, l'assemblaggio della camera di reazione, la reazione di trifosforilazione e la successiva deprotezione e purificazione degli oligonucleotidi trifosforilati. È incluso anche l'uso rappresentativo di oligonucleotidi trifosforilati 5′ come substrati per ribozimi ligasi per la sintesi di prodotti di acidi nucleici più grandi con dorsali naturali di D-RNA e L-RNA abiotico.

<table><tbody><tr><td>0,22 &micro; m filtro per siringa in polietersulfone</td><td>MilliporeSigma</td><td>SLMP025SS</td><td>Filtro per siringa per la rimozione di particelle di gel di poliacrilammide frantumate (Sezione 5)</td></tr><tr><td>0,22 &; m Filtro per siringa in PTFE</td><td>MilliporeSigma</td><td>SLLG013SL</td><td>Filtro per siringa per la rimozione della resina CPG (Sezione 5)</td></tr><tr><td>Siringhe in plastica da 1 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-823-434 (BD 309659)</td><td>Componenti dell'apparecchio per trifosforilazione (sezioni 2... 4)</td></tr><tr><td>1,4-diossano, solvente anidro</td><td>MilliporeSigma</td><td>296309</td><td>trifosforilazione (sezioni 2&ndash; 4)</td></tr><tr><td>2-Cloro-4H-1,3,2-benzodioxafosforina-4-one, Salicilfosforocloridite (SalPCl)</td><td>MilliporoSigma</td><td>324124</td><td>Reagente di trifosforilazione (sezioni 2&ndash; 4)</td></tr><tr><td>Flaconi di vetro da 30 mL</td><td>MilliporeSigma</td><td>23232</td><td>Flaconi per la preparazione di solventi di trifosforilazione e soluzione TBAP (sezione 2)</td></tr><tr><td>Rubinetto a 3 vie, policarbonato/polipropilene</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>7328103</td><td>Componente dell'apparato di trifosforilazione (sezioni 2... 4)</td></tr><tr><td>Soluzione di acrilammide/bis-acrilammide al 40%, 19:1</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610144</td><td>Per PAGINA (sezioni 5... 7)</td></tr><tr><td>Acetonitrile, anidro, 100 mL</td><td>Glen Research</td><td>40-4050-50</td><td>Solvente per trifosforilazione (sezioni 2&ndash; 4)</td></tr><tr><td>Trappola neutralizzante l'ammoniaca</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ANT100 e ANS121</td><td>Per l'uso con Speedvac DNA130 (sezione 5)</td></tr><tr><td>Persolfato di ammonio (APS)</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610700</td><td>Per PAGE, catalizzatore per la polimerizzazione dell'acrilammide (sezioni 5... 7)</td></tr><tr><td>Ammoniaca acquosa, 28%</td><td>MilliporeSigma</td><td>338818</td><td>Per la preparazione del reagente di deprotezione AMA (sezione 5)</td></tr><tr><td>Metilammina acquosa, 40%</td><td>TCI America</td><td>TCI-M0137</td><td>Per la preparazione del reagente di deprotezione AMA (sezione 5)</td></tr><tr><td>Sintetizzatore automatizzato di oligonucleotidi DNA/RNA</td><td>PerSeptive Biosystems</td><td>Expedite 8909 Sintetizzatore di DNA/RNA</td><td>qualsiasi sintetizzatore basato su colonna è accettabile (sezione 1)</td></tr><tr><td>Magnete cattura microsfere</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12320D</td><td>Per cattura perline streptavidina (sezione 7)</td></tr><tr><td>Blu di bromofenolo</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610404</td><td>Per tampone di caricamento urea PAGE (sezione 5)</td></tr><tr><td>Pompa per olio a vuoto profondo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>VLP200-115</td><td>Per l'uso con liofilizzatore (sezione 5)</td></tr><tr><td>Essiccante drierite, 10-20 mesh</td><td>MilliporeSigma</td><td>737828</td><td>Essiccante per lo stoccaggio di prodotti chimici e attrezzature per trifosforilazione (sezioni 1) 2)</td></tr><tr><td>D-RNA 27.3t polimerasi cross-chirale</td><td>preparata in house18</td><td>5&prime;-GGUGGUGGAC GUGAUCAUUA CGGAUCACUA ACUCGUCAGU GCAUUGAGAA GGAGAAUAAA AUGCACAUAG GUCGAAAGAC CUUAUACAAG AACUGUAUCA CCGGAGGGCG AGCACCACC-3&prime;</td><td>Per reazioni ribozimiche cross-chirali (sezione 7)</td></tr><tr><td>Supporti solidi D-RNA CPG, 1.000&Aring;, preconfezionati 1 & micro; colonne di sintesi di moli</td><td>Glen Research</td><td>20-3404-41E, 20-3415-41E, 20-3424-41E, 20-3430-41E</td><td>rappresentativo, per la sintesi di oligonucleotidi D-RNA (sezione 1)</td></tr><tr><td>Fosforamiditi protetti da D-RNA TOM</td><td>ChemGenes</td><td>ANP-3201, 3202, 3203, 3205</td><td>rappresentativo, per la sintesi di oligonucleotidi D-RNA (sezione 1)</td></tr><tr><td>Colonne di sintesi Expedite vuote, 1&micro; m</td><td>Glen Research</td><td>20-0021-01</td><td>Colonne di sintesi per l'uso con il sintetizzatore di DNA/RNA Expedite (sezione 1)</td></tr><tr><td>EPPS, N-(2-idrossietil)piperazina-N&prime;-(acido 3-propansulfonico), solido</td><td>MilliporeSigma</td><td>E1894</td><td>Componente tampone di reazione Ribozyme (sezione 6)</td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), solido</td><td>MilliporeSigma</td><td>EDS</td><td>Chelante bivalente di ioni metallici per l'uso in vari tamponi ( Sezioni 5&ndash; 7)</td></tr><tr><td>Filtri per colonne di sintesi Expedite</td><td>Glen Research</td><td>20-0021-0F</td><td>Filtri per colonne di sintesi in stile Expedite, per l'uso con colonne di sintesi vuote (sezione 1)</td></tr><tr><td>Scanner su gel fluorescente/fosforescente</td><td>Cytiva</td><td>Amersham Typhoon RGB, 29187193</td><td>Per la visualizzazione analitica PAGINA (sezioni 6&ndash; 7)</td></tr><tr><td>Formamide, deionizzato</td><td>VWR Life Science</td><td>97062</td><td>per tampone di caricamento del gel di formammide PAGE (sezioni 6&ndash; 7)</td></tr><tr><td>Software di quantificazione delle immagini su gel</td><td>Cytiva</td><td>ImageQuant TL</td><td>Per quantificare le immagini su gel scansionate (sezione 6)</td></tr><tr><td>Essiccatore in vetro</td><td>MilliporeSigma</td><td>CLS3121150</td><td>Stoccaggio di solventi per trifosforilazione (sezione 2)</td></tr><tr><td>Supporti solidi L-RNA CPG, 1.000&Aring;, bulk</td><td>ChemGenes</td><td>N-4691-10, N-4692-10, N-4693-10, N-4694-10</td><td>Sintesi di oligonucleotidi L-RNA (sezione 1)</td></tr><tr><td>Modello a testa di martello L-RNA</td><td>preparato in casa18</td><td>5&prime;-GCGCCUCAUC AGUCGAGCC-3&prime;</td><td>Per reazioni ribozimiche cross-chirali (sezione 7)</td></tr><tr><td>Primer L-RNA</td><td>preparato in casa18</td><td>5&prime;-fluoresceina-GGCUCGA-3&prime;</td><td>Per reazioni ribozimiche cross-chirali (sezione 7)</td></tr><tr><td>L-RNA Fosforammidite protette da Tom</td><td>ChemGenes</td><td>OP ANP-5201, 5202, 5203, 5205</td><td>Sintesi di oligonucleotidi L-RNA (sezione 1)</td></tr><tr><td>Liofilizzatore/Liofilizzatore</td><td>VirTis</td><td>Benchtop K</td><td>Per la concentrazione di oligonucleotidi (sezione 5)</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio esaidrato, solido</td><td>MilliporeSigma</td><td>M2670</td><td>Per reazioni ribozimiche (sezioni 6... 7)</td></tr><tr><td>N,N-Dimetilformammide, anidro</td><td>MilliporeSigma</td><td>227056</td><td>Solvente per trifosforilazione (sezione 2)</td></tr><tr><td>Colonna di desalinizzazione NAP-25 (resina Sephadex G-25)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>45000150</td><td>Colonne cromatografiche monouso per esclusione dimensionale a flusso gravitazionale contenenti resina Sephadex G-25 (sezione 5)</td></tr><tr><td>Ago in acciaio inossidabile senza carotaggio, 20 G</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-815-410</td><td>Aghi per forare setti in gomma (sezioni 2&ndash; 4)</td></tr><tr><td>Calcolatore del coefficiente di estinzione degli oligonucleotidi</td> Strumento <td>integrato DNA Technologies</td><td>OligoAnalyzer</td><td>Modello più vicino Calcolatore del coefficiente di estinzione breve dell'oligonucleotide 260nm (sezione 5)</td></tr><tr><td>Soluzione ossidante, 0,1 M di iodio in THF/piridina/acqua</td><td>ChemGenes</td><td>RN-1456</td><td>Reagente di trifosforilazione (sezione 4)</td></tr><tr><td>Piastre PAGE</td><td>Timberrock/CBS</td><td>NGP-250-BO e NO</td><td>Per PAGE (sezioni 5&ndash; 7)</td></tr><tr><td>Alimentatore PAGE</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>PowerPac HV 1645056</td><td>Per PAGE (sezioni 5&ndash; 7)</td></tr><tr><td>Distanziatori e pettini PAGE (analitici)</td><td>Timberrock/CBS</td><td>VGS-0725 e VGC-0714</td><td>Per PAGE (sezioni 6&ndash; 7)</td></tr><tr><td>Distanziatori e pettini PAGE (preparativi)</td><td>Timberrock/CBS</td><td>VGS-3025R e VGC-3001</td><td>Per PAGE (sezione 5)</td></tr><tr><td>Supporto PAGE</td><td>Timberrock/CBS</td><td>ASG-250</td><td>Per PAGE (sezioni 5&ndash; 7)</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13-374-12 (Bemis PM999)</td><td>Pellicola sigillante in cera per apparecchi di trifosforilazione (sezioni 2&ndash; 4)</td></tr><tr><td>Termociclatore per PCR</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>C1000 Touch Thermalcycler</td><td>Per reazioni ribozimiche cross-chirali (sezione 7)</td></tr><tr><td>Colonna di desalinizzazione PD 10 (resina Sephadex G-10)</td><td>MilliporeSigma</td><td>GE17-0010-01</td><td>Colonne cromatografiche monouso ad esclusione dimensionale a flusso gravitazionale contenenti resina Sephadex G-10, per oligonucleotidi < 15 nt (sezione 5)</td></tr><tr><td>Schermi al fosforo</td><td>Cytiva</td><td>28956480</td><td>Per la visualizzazione di RNA marcato con 32P (sezione 6)</td></tr><tr><td>Reagenti di sintesi di fosforamidite</td><td>Glen Research</td><td>30-3142-52, 40-4050-53, 40-4012-52, 40-4122-52, 40-4132-52, 40-4060-62</td><td>rappresentativo, per la sintesi standard di RNA/DNA (sezione 1)</td></tr><tr><td>Provetta sigillabile in polipropilene con tappo a vite</td><td>MilliporeSigma</td><td>BR780752</td><td>Provette per microcentrifuga da 1,5 mL con tappo a vite e O-ring in silicone, per una sicura deprotezione AMA ( sezione 5)</td></tr><tr><td>Piridina, anidra</td><td>MilliporeSigma</td><td>270970</td><td>Solvente di trifosforilazione (sezione 2)</td></tr><tr><td>Cromatografia liquida a fase inversa/spettrometria di massa a ionizzazione elettrospray (RP-LC/ESI-MS)</td><td>Novatia</td><td>n/a</td><td>Servizio commerciale per LC/MS specializzato in oligonucleotidi (sezione 5)</td></tr><tr><td>Setti di gomma (ID x OD 7,9 mm x 14 mm), bianco</td><td>MilliporeSigma</td><td>Z564702</td><td>Setti per la preparazione di solventi di trifosforilazione e TBAP (sezione 2)</td></tr><tr><td>Autoreplicatore ribozima E</td><td>preparato in casa14</td><td>5&prime;-GGAAGUUGUG CUCGAUUGUU ACGUAAGUAA CAGUUUGAAU GGUUGAAGUA UGAGACCGCA ACUUA-3&prime;</td><td>Per reazioni di ribozima autoreplicatore (sezione 6)</td></tr><tr><td>Substrato autoreplicante A</td><td>preparato in house14</td><td>5&prime;-32P-GGAAGUUGUG CUCGAUUGUU ACGUAAGUAA CAGUUUGAAU GGUUGAAGUA U-3&prime;-OH</td><td>Per reazioni di ribozima autoreplicatore (sezione 6)</td></tr><tr><td>Substrato autoreplicante B, trascritto</td><td>preparato in house14</td><td>5&prime;-pppGAGACCGCAA CUUA-3&prime;</td><td>Per reazioni di ribozima autoreplicatore (sezione 6)</td></tr><tr><td>Piccole trappole di essiccazione, 4 setacci molecolari</td><td>ChemGenes</td><td>DMT-1975</td><td>Trappole di essiccazione per sintetizzatori di DNA/RNA fosforamiditi e reagenti di trifosforilazione (sezioni 1... 2)</td></tr> <tr><td>Cloruro di sodio (NaCl), sale solido</td><td>MilliporeSigma</td><td>S7653</td><td>per l'uso in vari tamponi (sezioni 5&ndash; 7)</td></tr><tr><td>Idrossido di sodio (NaOH), sale solido</td><td>MilliporeSigma</td><td>S8045</td><td>per l'uso in vari tamponi (sezioni 5&ndash; 7)</td></tr><tr><td>Software di adattamento dei dati statistici</td><td>GraphPad</td><td>Prism</td><td>Per l'adattamento dei dati da PAGE analitico a modelli cinetici (sezione 6)</td></tr><tr><td>Perle magnetiche rivestite di streptavidina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>65002</td><td>Per catturare l'RNA marcato con biotina in reazioni di ribozima cross-chirali (sezione 7)</td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>MilliporeSigma</td><td>84097</td><td>Per tampone di caricamento dell'urea PAGE (sezione 5)</td></tr><tr><td>TBE tampone di corsa, 10x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AAJ62788K3</td><td>For PAGE (sezioni 5&ndash; 7)</td></tr><tr><td>Fluoruro di tetrabutilammonio, soluzione 1,0 M in tetraidrofurano</td><td>Aldrich</td><td>216143</td><td>Per la rimozione di gruppi protettivi 2&prime;-silil (sezione 5)</td></tr><tr><td>Tetrametiletilendiammina (TEMED)</td><td>Bio-Rad Laboratories</td> 1610801 Per la polimerizzazione <td>dell'acrilammide</td><td>per PAGE (sezioni 5... 7)</td></tr><tr><td>Tributilammina</td><td>MilliporeSigma</td><td>90781</td><td>Reagente di trifosforilazione (sezione 2)</td></tr><tr><td>Pirofosfato di tributilammonio (TBAP)</td><td>MilliporeReagente di</td><td>trifosforilazione</td> Sigma <td>P8533</td> (sezione 2)</tr><tr><td>Tris base</td><td>MilliporeSigma</td><td>T6666</td><td>Agente tampone per l'uso in vari tamponi (sezioni 5&ndash; 7)</td></tr><tr><td>TWEEN20 detergente polisorbato</td><td>MilliporeSigma</td><td>P7949</td><td>Detergente neutro per l'uso con perline magnetiche (Sezione 7)</td></tr><tr><td>Urea</td><td>MilliporeSigma</td><td>U5378</td><td>Per PAGE e tampone di caricamento gel (sezioni 5&ndash; 7)</td></tr><tr><td>Spettrofotometro UV-Vis</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NanoDrop 2000, ND2000</td><td>Per misurare le concentrazioni di oligonucleotidi (sezione 5)</td></tr><tr><td>Centrifuga a vuoto</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Savant Speedvac DNA130-115 Concentratore a vuoto</td><td>Per la rimozione di AMA e THF (sezione 5)</td></tr><tr><td>Xilene cianolo</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610423</td><td>Per tampone di caricamento dell'urea PAGE (sezione 5)</td></tr></tbody></table>

trifosforilazione chimica degli oligonucleotidi

Chemical Triphosphorylation of Oligonucleotides

Il 5′-trifosfato è una modifica essenziale dell'acido nucleico che si trova per tutta la vita e sempre più utilizzata come modificazione funzionale degli oligonucleotidi nelle biotecnologie e nella biologia sintetica. Gli oligonucleotidi 5′-trifosfati sono stati storicamente preparati in vitro con metodi enzimatici. Tuttavia, questi metodi sono limitati agli oligonucleotidi naturali dell'RNA, hanno forti preferenze di sequenza e tendono a produrre prodotti eterogenei. Nuovi metodi di trifosforilazione chimica completano sia il costo ridotto della sintesi automatizzata di oligonucleotidi mediante la chimica della fosforamidite sia la vasta gamma di modificazioni nucleotidiche ora disponibili. Pertanto, la sintesi di oligonucleotidi trifosfati di sequenza e lunghezza arbitrarie, e facoltativamente contenenti varie modifiche non naturali, è ora accessibile.
Questo documento presenta i metodi e le tecniche appropriate per la trifosforilazione chimica degli oligonucleotidi utilizzando salicil fosforocloridite e pirofosfato. Questo metodo utilizza reagenti disponibili in commercio, è compatibile con la maggior parte degli oligonucleotidi preparati con metodi standard di sintesi in fase solida e può essere completato in 2 ore dopo la sintesi degli oligonucleotidi, prima della deprotezione e della purificazione. Sono stati dimostrati due usi di oligonucleotidi chimicamente trifosforilati come substrati per gli enzimi dell'RNA catalitico, compresa la sintesi di una versione speculare del ribozima testa di martello da trifosfati non biologici di L-RNA.

Gli oligonucleotidi devono essere sintetizzati utilizzando protocolli standard appropriati alle fosforamimiti e sintetizzatori automatici DNA/RNA, lasciando l'oligonucleotide prodotto allontanato dal supporto solido nella colonna di sintesi plastica originale, con il gruppo dimetossitrilcino terminale a 5ʹ rimosso per produrre il 5ʹ-idrossile libero (sezione 1). Tutti gli oligonucleotidi utilizzati in questa dimostrazione sono stati preparati utilizzando resina di vetro a pori controllati (CPG) da 1.000 Å come supporto solido e condotti alla scala 0,2 o 1 μmole. Esempi rappresentativi di colonne di sintetizzatori, resine, reagenti e fosforamimiti sono forniti nella Tabella dei materiali. Per le reazioni su larga scala, potrebbe essere necessario regolare i volumi e i tempi utilizzati nelle fasi successive.
La reazione di trifosforilazione viene condotta su colonna in una camera di reazione costruita su misura (Figura 2, sezione 3) utilizzando componenti standard disponibili in commercio elencati nella Tabella dei materiali e segue lo schema illustrato nella Figura 1 (sezione 4)28. È essenziale che le condizioni siano mantenute rigorosamente anidre durante la trifosforilazione e che tutti i solventi e i reagenti siano preparati in anticipo su setacci molecolari e lasciati asciugare completamente prima dell'uso (paragrafo 2). La trifosforilazione richiede in genere 2 ore per verificarsi e, successivamente, la colonna lavata e asciugata può essere trattata secondo le procedure standard di deprotezione e purificazione degli oligonucleotidi (sezione 5).
Dopo la deprotezione, gli oligonucleotidi trifosfati vengono purificati mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide denaturante (PAGE), mostrando una singola banda di prodotto principale mediante back-shadowing UV che può essere asportata ed eluita dal gel. Il prodotto 5′-trifosfato è facilmente separato dai prodotti collaterali di reazione per oligonucleotidi corti, come mostrato per DNA trinucleotide 5ʹ-trifosfati, pppAAA e pppCCC, e L-RNA trinucleotide 5ʹ-trifosfato pppGAA in Figura 3A,B. Entrambi i prodotti 5′-idrossile e 5′-trifosfato per i trimeri di DNA AAA e CCC sono stati asportati e identificati mediante spettrometria di massa e corrispondentemente etichettati nella Figura 3A. Bande aggiuntive, come visibile per il trimero di DNA AAA, generalmente non contengono abbastanza materiale per recuperare e identificare. La presenza di queste bande, tuttavia, è correlata con masse di prodotto aggiuntive nei prodotti di reazione non purificati (Figura 3C), che rappresentano tipicamente prodotti collaterali 5′-difosfato, monofosfato e H-fosfonato, come discusso di seguito.
Dopo la purificazione di PAGE, gli oligonucleotidi più grandi possono essere eluiti utilizzando il metodo di schiacciamento e immersione42 e la successiva precipitazione di etanolo. Tuttavia, gli oligonucleotidi inferiori a 15 nt non possono essere precipitati in modo efficiente con etanolo e, pertanto, richiedono una procedura modificata per l'eluizione del gel (fase 5.11.3). La colonna di esclusione delle dimensioni usa e getta elencata nella Tabella dei materiali è classificata solo per l'uso con oligonucleotidi di lunghezza superiore a 10 nt. Tuttavia, abbiamo scoperto che gli oligonucleotidi corti come i trimeri possono essere efficacemente dissalati utilizzando il protocollo raccomandato dal produttore. Tuttavia, si raccomanda quando si dissalazione di oligonucleotidi corti (come nei passaggi 5.6 e 5.11.3) che l'eluato di colonna sia raccolto in frazioni e che le frazioni di prodotto siano identificate per assorbanza a 260 nm utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis. Una colonna di esclusione dimensionale ottimizzata per oligonucleotidi più corti è fornita nella Tabella dei materiali come scelta alternativa. La resa finale dalla sintesi di oligonucleotidi in scala 1 μmole dopo la purificazione è di 50-300 nmol.
La trifosforilazione può essere confermata dalla spettrometria di massa, dove il prodotto trifosforilato ha una massa +239,94 Da maggiore dell'oligonucleotide 5′-idrossile, sebbene si osservi spesso la presenza di materiali corrispondenti al 5′-di- e al monofosfato (+159,96 e +79,98 Da, rispettivamente). Si può anche osservare un prodotto laterale 5′-H-fosfonato con una massa +63,98 Da dalla massa 5′-OH, e alti livelli di questo prodotto indicano che le condizioni durante la trifosforilazione non erano sufficientemente anidre. Prima della purificazione, gli oligonucleotidi deprotetti mostreranno tipicamente tutti questi prodotti (Figura 3C), mentre il materiale purificato mostrerà un picco corrispondente al prodotto 5′-trifosfato insieme a 5′-di- e monofosfati (Figura 3D,E).
La spettrometria di massa da sola in genere non fornisce una misura rigorosa della purezza del 5′-trifosfato a causa dei tassi differenziali di ionizzazione e frammentazione del trifosfato durante la ionizzazione. Per misurare la purezza del prodotto finale, si raccomanda la cromatografia liquida in fase inversa e l'ESI-MS tandem (RP-LC/ESI-MS), in particolare per gli oligonucleotidi più lunghi. L'analisi dei D-RNA 5ʹ-trifosfati pppACGAGG e pppGAGACCGCAACUUA da parte di RP-LC/ESI-MS (Figura 4A,B, rispettivamente) mostra una purezza tipica del prodotto finale, contenente il 20% di 5ʹ-difosfato poiché queste due specie sono difficili da separare quando presenti su oligonucleotidi più lunghi.
Gli oligonucleotidi sintetici 5′-trifosfato funzionano tipicamente bene o meglio dei materiali preparati enzimaticamente negli studi biochimici. Nella sezione 6, ad esempio, substrati di RNA 5′-trifosfato 14 nt preparati sinteticamente o mediante trascrizione in vitro sono stati confrontati in una reazione di autoreplicazione catalizzata dall'RNA 14,15,43,44,45. Il ribozima E catalizza l'unione dei substrati A e B per produrre una nuova copia di E in una reazione autocatalitica capace di crescita esponenziale (Figura 5A). I componenti A marcati E e 32P sono stati preparati mediante trascrizione in vitro e il substrato B trifosforilato è stato preparato sinteticamente, come descritto sopra, o mediante trascrizione in vitro 14. Il progresso della reazione di autoreplicazione è stato monitorato prelevando campioni periodici che sono stati analizzati mediante DENATURAZIONE DI PAGE e quantificati tramite uno scanner gel fluorescente/fosforescente. I dati risultanti, adatti a una funzione di crescita logistica, hanno rivelato che il substrato B trascritto o sintetico supporta la crescita esponenziale, ma il B sintetico fornisce una quantità leggermente maggiore di prodotto (Figura 5B). Questo risultato può riflettere l'eterogeneità compositiva alla fine 5′-end dell'RNA preparato mediante trascrizione in vitro 23,24.
La trifosforilazione chimica consente anche la sintesi di oligonucleotidi trifosfati che non possono essere preparati biologicamente, né in vitro né in cellule. Nella sezione 7, gli oligonucleotidi trifosfati non biologici composti da L-RNA, l'enantiomero del D-RNA naturale, preparato come nelle sezioni 1-5, sono stati utilizzati come substrati per il D-RNA "cross-chiral" polimerasi ribozima 27.3t (Figura 6A), che catalizza la polimerizzazione diretta dal modello di un prodotto L-RNA più lungo da oligonucleotide 5′-trifosfati L-RNA corto in modo generale di sequenza. Ad esempio, il ribozima può sintetizzare una versione L-RNA del motivo di auto-scissione della testa di martello (Figura 6B)18. I trifosfati di L-RNA trinucleotide purificati sono stati combinati con un primer L-RNA marcato con fluoresceina e un modello di L-RNA (Figura 6C) e hanno reagito con la ligasi cross-chirale. I campioni nel corso della reazione sono stati analizzati da PAGE e ripresi utilizzando uno scanner gel fluorescente / fosforescente per dimostrare la sintesi di una versione L-RNA del ribozima a martello codificato dal modello (Figura 6D).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig03.jpg"> Figura 3: Purificazione del trinucleotide 5ʹ-trifosfati. (A) Analisi PAGE (visualizzata mediante UV-back-shadowing) della trifosforilazione dei trinucleotidi del DNA tri-deossiadenosina (AAA, blu) e tri-deossicitidina (CCC, rosso), intenzionalmente sovraccaricati per visualizzare prodotti collaterali minori. Sia il prodotto 5ʹ-trifosfato (ppp) che il materiale di partenza 5ʹ-idrossile (OH) sono stati asportati e identificati da MALDI-MS. (B) PAGINA preparatoria di trifosforilazione di L-RNA trinucleotide GAA, con banda di prodotto principale asportata e identificata come 5ʹ-trifosfato (ppp) da ESI-MS. C) MALDI-MS di prodotti grezzi di reazione dopo deprotezione e (D) prodotti purificati da (A). 5ʹ-trifosfato (ppp; pppAAA atteso 1.119 Da, osservato 1.118 Da; pppCCC atteso 1.047 Da, osservato 1.046); Sono etichettati 5ʹ-difosfato (pp), 5ʹ-monofosfato (p), 5ʹ-idrossile (OH) e 5ʹ-H-fosfonato (Hp). (E) Spettro di massa deconvoluto dall'iniezione diretta ESI-MS di prodotto isolato 5ʹ-trifosfato da (B), con picchi identificati etichettati (atteso 1.181,6 Da, osservato 1.181,0 Da). Si osservano anche prodotti a 5ʹ-difosfato (pp), così come picchi di ioni di sodio sia per i prodotti tri- che per quelli difosfato (+22 Da). I picchi di contaminanti comuni sono etichettati con un asterisco. Per facilitare il confronto, gli spettri di massa sono stati normalizzati alla massima intensità misurata in ciascuno spettro e sono riportati come percentuale rispetto a quel valore. Abbreviazioni: PAGE = elettroforesi su gel di poliacrilammide; MALDI-MS = desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice; ESI-MS = spettrometria di massa a ionizzazione elettrospray. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig04.jpg"> Figura 4: RP-LC analitico di 6 nt e 14 nt D-RNA oligonucleotide trifosfati. (A) 5ʹ-pppACGAGG-3ʹ e (B) 5ʹ-pppGAGACCGCAACUUA-3ʹ. Tandem ESI-MS ha identificato il picco maggiore di entrambi (~ 70%) come il 5ʹ-trifosfato (ppp), con minori quantità di 5ʹ-difosfato (pp). Abbreviazioni: RP-LC = cromatografia liquida in fase inversa; nt = nucleotidi; ESI-MS = spettrometria di massa a ionizzazione elettrospray. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig05.jpg"> Figura 5: Confronto di substrati oligonucleotidi 5ʹ-trifosfato preparati mediante sintesi chimica o trascrizione in vitro. (A) Il ribozima E autoreplicante lega l'RNA A e l'RNA 5′-trifosforilato B. (B) Confronto delle reazioni di autoreplicazione utilizzando 10 μM A e 10 μM B, sia sintetici (cerchi aperti) che trascritti in vitro (cerchi riempiti). (B) I dati erano adatti all'equazione di crescita logistica: [E] = a / (1 + b e-ct), dove a è la resa finale, b è il grado di sigmoidicità e c è il tasso di crescita esponenziale. I tassi di crescita per le due reazioni erano identici, a 1,14 h-1, mentre l'estensione finale era superiore del 10% per le reazioni con B sintetico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig06.jpg"> Figura 6: Polimerizzazione cross-chirale di L-RNA con un ribozima. (A) Il D-RNA 27.3t polimerasi ribozima, che catalizza la legatura template-dipendente di L-RNA. (B) Il prodotto L-RNA sintetizzato da 27.3t fa parte di un motivo di endonucleasi a martello. (C) Polimerizzazione L-RNA catalizzata di 27,3 t utilizzando un modello di L-RNA biotinilato (marrone), un primer L-RNA (magenta) marcato alla fine e quattro trifosfati trinucleotidici L-RNA (ciano), preparati sinteticamente. (D) ANALISI PAGE dei prodotti di estensione di (B) a 4 h e 24 h, mostrando ogni incorporazione di trinucleotide fino al prodotto a lunghezza intera (punto nero). Il primer L-RNA non reagito è incluso come marcatore di riferimento. Abbreviazioni: PAGE = elettroforesi su gel di poliacrilammide; M = marcatore di riferimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Gli oligonucleotidi 5′-trifosfati sono componenti onnipresenti nei percorsi biologici essenziali e hanno visto un uso crescente nelle applicazioni biotecnologiche. Qui descriviamo le tecniche per la sintesi e la purificazione di routine degli oligonucleotidi 5′-trifosfati, a partire da oligonucleotidi preparati con tecniche di sintesi automatizzate standard.

Trifosforilazione chimica degli oligonucleotidi

The 5&#8242;-triphosphate is an essential nucleic acid modification found throughout all life and increasingly used as a functional modification of ...

La trifosforilazione è una modifica onnipresente di 5'RNA in biologia ed è sempre più utilizzata nelle applicazioni biotecnologiche. Il protocollo qui delineato consente la trifosforilazione 5'di qualsiasi oligonucleotide preparato mediante sintesi automatizzata standard. La trifosforilazione chimica agisce su oligonucleotidi contenenti RNA, DNA o acido nucleico non naturale.Qui, l'L-RNA mancino trifosforilato, l'enantiomero del D-RNA biologico, viene sintetizzato purificato e utilizzato in una reazione ribosomica. La trifosforilazione viene eseguita dopo sintesi automatizzata di oligonucleotidi e prima della deprotezione. Questi passaggi non sono mostrati qui, ma i ricercatori dovrebbero avere familiarità con i metodi standard per entrambi.Per iniziare, assicurarsi che lo spazio di lavoro per la fosforilazione abbia un collettore di gas con almeno due linee e il gorgogliatore collegato a una sorgente di argon secco con pressione regolabile poiché la reazione di trifosforilazione deve essere eseguita sotto argon. Quindi collegare una siringa di plastica da un millilitro alle linee per facilitare il collegamento all'apparato di reazione. Quindi, raccogliere l'attrezzatura tra cui siringhe di plastica da un millilitro, un rubinetto di polipropilene a tre vie, aghi noncoranti, tubi in polipropilene da 1,5 millilitri, una piccola spatola metallica e conservarli in un contenitore o essiccatore sigillato con un dessicante a temperatura ambiente per almeno un giorno prima dell'uso.Sotto pressione di argon, prelevare 30 millilitri di 1, 4-diossano anidro da una bottiglia sigillata. Trasferire in una bottiglia di vetro essiccata da 30 millilitri e aggiungere una trappola per l'essiccazione. Sigillare con setti di gomma e conservare in un essiccatore con dessicant.Allo stesso modo, preparare 30 millilitri di N, N-dimetilformammide, acetonitrile e la miscela di tre parti di diossano e una parte di piridina in volume. Preparare la soluzione di TBAP mescolando il pirofosfato solido di tribilammonio con dimetilformammide e tributilamina in una bottiglia di vetro da 30 millilitri come descritto nel manoscritto. Aggiungete tre trap di disegno.Sigillare la bottiglia con un setto di gomma sotto argon e bollare con argon per 30 minuti. Dopo aver preparato un oligonucleotide con un idrossile libero di 5'su una colonna di sintesi utilizzando un sintetizzatore automatico DNA/RNA. Preparare la camera rimuovendo lo stantuffo da una siringa asciutta da un millilitro.Tagliare la parte superiore della siringa con le forbici o una lama di rasoio e attaccare la siringa alla colonna di sintesi. Nella parte superiore della siringa, collegare il rubinetto a tre vie e collegare l'ingresso laterale del rubinetto alla sorgente di argon secco con il gorgogliatore in modo che l'ingresso superiore del rubinetto funga da porta di iniezione del reagente. Fissare questi operatori a un supporto con morsetti e sigillare tutti i giunti a monte con pellicola sigillante a cera.Quindi regolare il rubinetto in modo che la porta di iniezione sia chiusa e l'apparecchio sia aperto alla sorgente di argon. Chiudere il gorgogliatore e lasciare che l'argon a bassa pressione fluisca attraverso la camera d'azione per cinque minuti. Dopo aver riaperto il gorgogliatore, attaccare una siringa sul fondo della colonna di sintesi, che sarà la siringa di scarto.Quindi, tirare l'argon attraverso la colonna ripetutamente usando la siringa di scarto e quindi riattaccare la siringa con lo stantuffo spinto completamente dentro. Per aggiungere un reagente o un solvente, attaccare un ago alla fonte di argon secco e inserirlo nel setto del reagente o del flacone di solvente, facendo attenzione a non immergere l'ago nel contenuto del flacone. Quindi assemblare una siringa asciutta con un ago e inserirla nel setto del reagente o del flacone di solvente senza immergerlo nel contenuto del flacone.Successivamente, riempire la siringa con argon, estrarre l'ago dal setto ed espellere l'argon. Dopo aver riempito la siringa con argon ed espulso ancora una volta, riempire la siringa con il volume richiesto di solvente o reagente sotto pressione di argon. Regolare il rubinetto in modo che la sorgente di argon sia chiusa e la porta di iniezione sia aperta.Una volta regolato rapidamente l'arresto dell'apparecchio, rimuovere la siringa e l'ago riempiti dal flacone di origine, asciugare il solvente attaccato al lato o alla punta dell'ago e quindi inserire l'ago nella porta di iniezione. Dopo aver espulso un reagente nell'anticamera degli operatori, rimuovere l'ago e chiudere la porta di iniezione riaprendo l'apparecchio alla fonte di argon. Aspirare delicatamente il liquido dall'anticamera attraverso la colonna di sintesi utilizzando la siringa di scarto in modo che tutto il liquido sia ora trattenuto nella siringa di scarto.Ora spingere lentamente la soluzione verso l'alto nella colonna di sintesi, assicurandosi che non ci siano bolle di gas nella colonna. Per mescolare o agitare, tirare delicatamente la soluzione su e giù sopra la colonna con la siringa di scarto. Per rimuovere un reagente o un solvente dalla colonna, estrarre lentamente la soluzione nella siringa di scarto.Dopo che la maggior parte della soluzione è passata nella siringa di scarto, estrarre l'argon per lavare il solvente rimanente dalla colonna. Quindi, rimuovere il film sigillante in cera attorno al giunto della siringa di scarto. Quindi rimuovere la siringa ed eliminare la soluzione di scarto.Successivamente, sostituire la siringa di scarto con una nuova siringa asciutta e richiudere l'articolazione. Dopo aver assemblato l'apparato di trifosforilazione, iniziare la reazione di trifosforilazione aggiungendo 200 microlitri di piridina diossano all'anticamera come dimostrato in precedenza. Ma non tirare ancora il campione sulla colonna di sintesi.Dopo aver sciolto SalPCl in diossano come descritto nel manoscritto, aggiungerlo all'anticamera e caricarlo sulla colonna di sintesi usando una siringa asciutta. Quindi lasciare reagire per 15 minuti e quindi rimuovere e scartare la soluzione SalPCl utilizzando una siringa di scarto come dimostrato in precedenza. Immediatamente dopo aver rimosso la soluzione SalPCl, aggiungere 250 microlitri di soluzione TBAP all'anticamera e caricarli sulla colonna di sintesi.Lasciare che reagisca 20 minuti con agitazione e scartare come descritto in precedenza. Successivamente, lavare la colonna con 0,5 millilitri di N, N-dimetilformammide, quindi 0,5 millilitri di acetonitrile, rimuovendo il solvente dopo ogni aggiunta. Dopo aver aggiunto la soluzione ossidante, rimuoverla e lavare nuovamente la colonna con acetonitrile utilizzando la stessa procedura mostrata, smontare l'apparecchio e lavare la colonna con cinque millilitri di acetonitrile.Successivamente, asciugare la colonna. Scindere l'oligonucleotide trifosforilato dal supporto solido e deproteggere usando protocolli standard come descritto nel manoscritto. Successivamente, sciogliere l'oligonucleotide deprotetto essiccato nel tampone di carico dell'urea, riscaldato a 80 gradi Celsius, quindi caricare su un gel di poliacrilammide e funzionare per una o due ore a 25-35 watt.Alla fine dell'elettroforesi su gel, dopo aver rimosso la piastra gel, smontarla e avvolgere il gel in un film di polivinilcloruro. Quindi, identificare le bande di prodotto mediante back shadowing con luce UV a 254 nanometri ed asportare la banda principale del prodotto utilizzando una lama di rasoio. Schiacciare il gel asportato estrudendolo attraverso una siringa di plastica o meccanicamente.Per oligonucleotidi inferiori a 15 nucleotidi, eluire in tre volte il volume di gel di acqua priva di nucleasi per almeno 12 ore con agitazione o agitazione. Quindi rimuovere i pezzi di gel solido facendo passare la soluzione attraverso una siringa dotata di un filtro da 0,2 micrometri e concentrare mediante liofilizzazione. Dopo la concentrazione, rimuovere i sali residui e i saluti utilizzando una colonna di esclusione delle dimensioni usa e getta e concentrare per liofilizzazione come dimostrato in precedenza.Dopo aver preparato 10 microlitri di una soluzione di RNA contenente polimerasi ribozima e modello di primer L-RNA e trinucleotidi trifosfati come descritto nel manoscritto, ricotturandolo a 90 gradi Celsius per un minuto e raffreddandolo a 23 gradi Celsius a 0,2 gradi Celsius al secondo in un termociclatore PCR. Dopo aver incubato la soluzione di RNA a 17 gradi Celsius, interrompere la reazione aggiungendo 10 microlitri del doppio della concentrazione del tampone di avvio mentre la reazione procede, prendere 10 aliquote di microlitri e spegnere con cinque microlitri di 0,5 MOLARE EDTA a pH 8 ed elaborare ogni campione per isolare l'RNA come descritto nel manoscritto. Sciogliere l'RNA precipitato in 10 microlitri di tampone di carico del gel formalizzato e preparare il primer etichettato come descritto nel testo.Una volta preparati i campioni, riscaldare a 80 gradi Celsius. Caricare cinque microlitri del campione in ciascun pozzetto ed eseguire il gel a 40 watt per circa 40 minuti. Dopo aver rimosso la piastra gel dal supporto, eseguire la scansione utilizzando uno scanner gel fluorescente o fosforescente per visualizzare i prodotti di estensione L-RNA chirale incrociati.Dopo la purificazione del gel, l'ombreggiatura posteriore UV rivela la presenza di 5'trifosfato come singolo prodotto principale, come mostrato per i trimeri di DNA AAA e CCC e il trimero GAA L-RNA. Il prodotto lato 5'idrossile è spesso visibile come una banda di migrazione più lenta, che è stata isolata e identificata dalla spettrometria di massa per i trimeri del DNA. Bande aggiuntive durante la purificazione del gel sono correlate con i prodotti collaterali 5'difosfato, monofosfato e H-fosfonato nella spettrometria di massa dei prodotti di reazione non purificati.I prodotti 5'trifosfati mostrano un picco di massa primario corrispondente al 5'trifosfato insieme alle masse 5'di e monofosfato. I trinucleotidi L-RNA correlati chimicamente trifosfati sono stati utilizzati con un primer L-RNA e un modello L-RNA in una reazione di polimerizzazione dell'RNA analizzata da PAGE e riprodotta utilizzando uno scanner gel fluorescente. Il prodotto esteso contrassegnato da cerchi neri ha dimostrato la sintesi di una versione L-RNA del ribozima a testa di martello codificato dal modello.L'esposizione all'acqua durante la trifosforilazione ridurrà la resa. Seguire i passaggi per preparare i reagenti secchi e assemblare attentamente l'apparato di reazione. Spostare lentamente i fluidi attraverso l'apparecchio per evitare la rottura delle guarnizioni.La trifosforilazione chimica è essenziale per la preparazione di trifosfati oligonucleotidici non biologici, incluso l'RNA mancino. Ciò ha permesso la sintesi incrociata di ribozima chirale delle versioni speculari delle molecole di RNA presenti in biologia.

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