Metodi in vitro bottom-up per saggiare l'organizzazione ultrastrutturale, il rimodellamento della membrana e il comportamento di sensibilità alla curvatura delle settine

Utilizzando questo protocollo, abbiamo visualizzato l'organizzazione delle proteine filamentose citoscheletriche su substrati pattern che mostrano varie curvature. Possiamo testare la sensibilità della curvatura. La risoluzione delle immagini al microscopio elettronico a scansione è abbastanza alta da consentire la visualizzazione di organizzazioni su scala nanometrica.

I metodi che usiamo per la fissazione sono abbastanza lievi da preservare l'organizzazione intra-strutturale della proteina. Questo rimane nell'ambito della ricerca fondamentale per comprendere il comportamento dei filamenti citoscheletrici. Inizia progettando un adesivo ottico Norland ondulato, o replica NOA, in un ambiente di camera bianca da modelli ondulati ondulati di polidimetilsilossano ondulati di 250 nanometri di ampiezza e periodicità laterale di due micrometri.

Per fare ciò, depositare cinque microlitri di NOA liquido su un vetrino circolare di vetro di un centimetro di diametro e quindi posizionare il modello PDMS sulla goccia. Trattare l'assemblaggio con luce UV a 320 nanometri per cinque minuti per fotopolimerizzare il liquido NOA in un sottile film polimerico. Una volta fatto, staccare delicatamente la maschera PDMS dalla copertina con il NOA appena polimerizzato.

Trattare il film NOA utilizzando un detergente al plasma ad aria per cinque minuti per rendere la superficie idrofila. Preparare una soluzione di piccole vescicole unilamellari, o SUV, come descritto nel manoscritto, e ottenere i SUV risospendendo un film lipidico essiccato nel tampone di osservazione sotto la sonicazione in un sonicatore da bagno per cinque a 10 minuti fino a quando la soluzione è trasparente. Successivamente, inserire i vetrini di copertura che supportano i modelli NOA all'interno dei pozzetti delle scatole di coltura cellulare e incubare i modelli NOA appena scaricati con 100 microlitri di una soluzione SUV da un milligrammo per millilitro per 30 minuti a temperatura ambiente per generare un doppio strato lipidico supportato.

Per rimuovere il SUV non fuso, sciacquare accuratamente i lati sei volte con il tampone a basso contenuto di sale della settina senza lasciare asciugare completamente il campione tra due lavaggi. Diluire la soluzione madre di septina octomerica in un tampone di sale a basso contenuto di settino a concentrazioni finali, comprese tra 10 e 100 nanomolari e volumi di un millilitro. Quindi, incubare la soluzione proteica sui vetrini per un'ora a temperatura ambiente.

Lavare i vetrini NOA contenenti doppi strati lipidici supportati fusi e incubare le proteine con tampone a basso contenuto di sale della settina. Sostituire il tampone a basso contenuto di sale della settina con una soluzione fissativa di glutaraldeide al 2% in tampone di cacodilato sodico molare 0,1, preriscaldato a 37 gradi Celsius, e lasciare che la reazione proceda per 15 minuti, e lavare il campione fissato tre volte, cinque minuti ciascuna con cacodilato di sodio 0,1 molare. Dopo il lavaggio, incubare il campione nella soluzione fissativa di tetrossido di osmio, quindi l'acido tannico filtrato e infine l'acetato di uranile filtrato per 10 minuti ciascuno.

Lavare il campione tre volte in acqua distillata dopo ogni soluzione. Incubare il campione in serie in soluzioni di etanolo a partire dal 50% al 100% per due o tre minuti ciascuna. Trasferire i vetrini all'interno dell'essiccatore a punti critici preriempito con etanolo e seguire le istruzioni del produttore per l'essiccazione.

Poiché i campioni essiccati sono altamente idroscopici, rivestirli immediatamente attaccando il vetrino di copertura ai mozziconi. Quindi aggiungere una striscia di vernice argentata sulla faccia superiore del vetrino senza creare deglomerati di vernice. Assicurati che il collegamento con lo stub sia soddisfacente.

Quando il campione evapora completamente, utilizzare un apparecchio dotato di una testa di sputtering magnetron al plasma e di uno stadio planetario rotante e seguire i protocolli standard forniti dal produttore. Eseguire il pre-sputtering a 120 milliampere per 60 secondi per rimuovere lo strato di ossido in superficie. Quindi depositare 1,5 nanometri di tungsteno con un monitor dello spessore del film a 90 milliampere e una distanza di lavoro di 50 millilitri.

Successivamente, conservare i campioni sotto vuoto per proteggerli dall'aria ambiente fino e durante le analisi SEM. Per ottenere immagini ad alta soluzione rilevando gli elettroni secondari con il rilevatore interno, impostare la tensione di accelerazione a tre kilovolt e la corrente del fascio su un'apertura di 20 micrometri. Per le osservazioni, utilizzare risoluzioni che vanno da 21,25 nanometri per pixel a 1,224 nanometri per pixel.

Utilizzare una risoluzione di 5,58 nanometri per pixel per l'analisi dei dati. Impostare la distanza di lavoro tra uno e due millimetri per l'osservazione ad alta risoluzione e circa tre millimetri se è richiesta una maggiore profondità di campo. Regolare continuamente la velocità di scansione e l'integrazione della linea per garantire un rapporto segnale/rumore costante con un tempo di acquisizione di circa 30-45 secondi per immagine.

L'analisi rappresentativa illustra l'effetto del materiale depositato sui filamenti di settina su modelli PDMS ondulati con 1,5 nanometri di platino e 1,5 nanometri di tungsteno. È stato osservato che le vescicole unilamellari giganti nude, o GUV, erano perfettamente sferiche. Dopo la deformazione indotta dalla settina, le vescicole apparivano sfaccettate e le deformazioni rimanevano statiche, e quindi non fluttuavano.

A concentrazioni più elevate delle settine sono state osservate deformazioni periodiche nelle vescicole. L'autoassemblaggio dei filamenti di settina legati a grandi vescicole unilamellari, o LUV, è stato esaminato con un'immagine al microscopio elettronico criogenico e la ricostruzione 3D è stata ottenuta da una serie inclinata. La disposizione dipendente dalla curvatura dei filamenti di settina è stata visualizzata mediante microscopia elettronica a scansione.

A basso ingrandimento, era visibile un modello ondulato con la periodicità delle curvature negative e positive. L'organizzazione ultra-strutturale dei filamenti di settina è stata osservata a un ingrandimento più elevato. Il NOA deve essere rimosso delicatamente per evitare il degrado.

Dopo l'imaging, è possibile eseguire alcune analisi delle immagini per quantificare le caratteristiche dell'ultrastruttura visualizzate da SCM, come la spaziatura dei filamenti e l'orientamento del filamento. Il presente metodo è stato applicato alle septine, ma potrebbe essere utilizzato anche per altre proteine citoscheletriche o proteine che si organizzano come filamenti lunghi e quindi sono sensibili alla curvatura.