Utilizzo della microscopia a microfluidica e fluorescenza per studiare la dinamica di assemblaggio di singoli filamenti e fasci di actina

Combiniamo la microscopia a fluorescenza con la microfluidica per studiare come le proteine leganti l'actina regolano l'assemblaggio e lo smontaggio dei filamenti di actina. Con la microfluidica, siamo in grado di quantificare le reazioni che si verificano su decine di singoli filamenti di actina contemporaneamente, controllando con precisione le condizioni biochimiche e meccaniche. Ricorda che le soluzioni vengono prima iniettate in parallelo fino a raggiungere la camera, quindi i filamenti vengono esposti in sequenza a ciascuna soluzione modificando l'impostazione della pressione.

Per iniziare la preparazione del polidimetilsilossano, o PDMS, assemblaggio della camera, preriscaldare la piastra calda a 100 gradi Celsius. Esporre una camera PDMS pulita e un coperchio di vetro scivolare in una capsula di Petri pulita alla luce ultravioletta per tre-cinque minuti in un detergente UV profondo. Al termine, posizionare la camera PDMS sopra lo slittamento del coperchio in modo tale che le due superfici direttamente esposte ai raggi UV siano messe a contatto.

Per rimuovere le bolle d'aria intrappolate nell'interfaccia di scorrimento del coperchio PDMS, premere delicatamente la superficie della camera con un dito. Premere con forza su angoli e lati, assicurandosi che il soffitto della camera non entri in contatto con la superficie del vetro. Posizionare la camera con il fondo di vetro rivolto verso la piastra calda a 100 gradi Celsius per cinque minuti.

Quindi utilizzare immediatamente la camera o conservarla in una capsula di Petri pulita per una settimana. Per risciacquare il tubo di ingresso e di uscita, riempire un tubo del serbatoio da 2 millilitri con 300 microlitri di F-buffer, avvitarlo sul supporto microfluidico e impostare la pressione su 300 millibar. Lasciare che da cinque a otto gocce di F-buffer vadano sprecate, quindi impostare la pressione a zero e ripetere la procedura per ciascun canale.

Quindi, impostare la pressione per l'uscita sul tubo del serbatoio da quattro a 50 millibar, una volta che una goccia esce dalla punta del tubo, collegare il tubo all'uscita della camera PDMS. Quando il liquido riempie la camera ed esce da tutte le entrate, impostare la pressione di uscita a 20 millibar. Successivamente, impostare la pressione per il tubo del serbatoio da 1 a 50 millibar.

Per evitare l'introduzione di bolle d'aria, assicurarsi che una goccia esca dal tubo e dall'ingresso PDMS prima di collegare il tubo a quello in ingresso. Impostare la pressione dell'ingresso su 30 millibar. Dopo aver collegato le prese due e tre come dimostrato, impostare la pressione di tutte le prese a 20 millibar e la pressione di uscita a zero millibar.

Assicurarsi che le portate nelle prese siano approssimativamente uguali. Quando si cambia il serbatoio, impostare tutte le pressioni di ingresso su 12 millibar e la pressione di uscita su 5 millibar. Per iniettare rapidamente una soluzione, impostare la pressione dell'ingresso corrispondente a 150 millibar e regolare la pressione negli altri ingressi a circa 100 millibar, in modo tale che la portata risultante nelle prese sia di 500 nanolitri al minuto.

Per cambiare la soluzione, riempire da 200 a 300 microlitri della soluzione in un nuovo tubo del serbatoio e impostare la pressione sull'impostazione di modifica. Quindi, svitare il tubo del serbatoio dell'ingresso. Una volta che una piccola goccia si è formata sulla punta del tubo, avvitare il nuovo tubo con la soluzione fresca, modificare l'impostazione della pressione su un flusso elevato.

A seconda della configurazione microfluidica e della geometria della camera, attendere da tre a cinque minuti affinché la soluzione riempia il tubo e raggiunga la camera. Il processo può essere seguito misurando l'aumento della fluorescenza nel tempo. Per la funzionalizzazione superficiale, cambiare la soluzione da tre a 200 microlitri di 50 semi di spettrina-actina picomolare in F-buffer e iniettare la soluzione per due minuti con un flusso tre elevato.

Per la passivazione superficiale, cambiare il tubo tre con 300 microlitri del 5% BSA in F-buffer, quindi, iniettare per cinque minuti ad alto flusso tre, seguito da cinque minuti a metà flusso tre, con pressione ridotta da sette a otto millibar nei canali uno e due per ottenere un controflusso di 100 nanolitri al minuto. L'intera superficie della camera sarà passivata BSA. Cambiare il tubo tre in F-buffer per risciacquare il canale per cinque minuti ad alto flusso tre.

Successivamente, cambiare i tubi da uno a tre con un'actina profilina micromolare, 0,15 actina micromolare e tampone F, rispettivamente, come spiegato nel manoscritto, e iniettare soluzioni appena preparate usando l'alto flusso tutto preimpostato per tre o quattro minuti. Accendere il microscopio e regolare il tempo di esposizione della fotocamera a 100-200 millisecondi, il laser di eccitazione al 10-20% di potenza e la fluorescenza totale della riflessione interna, o profondità TIRF, da 200 a 300 nanometri per acquisire le immagini con un obiettivo 60X. Quindi, impostare l'impostazione della pressione a metà flusso uno per 10 minuti per registrare la polimerizzazione del filamento alla velocità di un fotogramma ogni 20 secondi, seguita da un flusso medio due per 15 minuti per l'invecchiamento del filamento.

Cattura la depolimerizzazione in modalità epifluorescenza a un fotogramma ogni cinque secondi, dopo uno o due fotogrammi, passa a un flusso medio tre per registrare i filamenti depolimerizzanti a circa 10 subunità al secondo. Per ripristinare l'esperimento, rompere tutti i filamenti etichettati in modo fluorescente esponendoli continuamente al laser alla massima potenza per due minuti. Testare condizioni diverse cambiando le soluzioni uno, due o tre e iniettandole ad alto flusso per tre o quattro minuti.

Il risultato dell'esperimento di polimerizzazione/ depolimerizzazione di base è presentato qui. I kymografi risultanti sono stati utilizzati per quantificare i tassi di polimerizzazione e depolimerizzazione. Quando i filamenti di actina cresciuti sono stati esposti a una soluzione di cofilina marcata fluorescentemente, i grappoli di cofilina sono stati nucleati e cresciuti verso le estremità appuntite e spinate.

Quando i singoli filamenti sono esposti al fascio formano fasci che appaiono più luminosi e non perfettamente allineati con il flusso. È molto importante evitare di introdurre bolle d'aria nel sistema quando si cambiano i tubi e prestare attenzione a non svuotare i tubi del serbatoio. Questa tecnica è stata fondamentale per applicare forze di trazione su decine di singoli filamenti, esaminare la sensibilità meccanica di formina e cofilina e il debranching ARP2/3.