Name: Caratterizzazione delle proprietà meccaniche della parete cellulare primaria in organi vegetali viventi mediante microscopia a forza atomica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Impara a caratterizzare le proprietà meccaniche delle pareti cellulari primarie in organi vegetali viventi mediante microscopia a forza atomica. Questo metodo consente analisi accurate di campioni non fissati e non disidratati.

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Vorremmo ringraziare il Dr. Dmitry Suslov (Università statale di San Pietroburgo, San Pietroburgo, Russia) e la Prof.ssa Mira Ponomareva (Tatar Scientific Research Institute of Agriculture, FRC KazSC RAS, Kazan, Russia) per aver fornito semi di mais e segale, rispettivamente. Il metodo presentato è stato sviluppato nell'ambito del progetto della Fondazione scientifica russa n. 18-14-00168 assegnato a LK. La parte del lavoro (ottenimento dei risultati presentati) è stata eseguita da AP con il sostegno finanziario dell'incarico governativo per il FRC Kazan Scientific Center di RAS.

1. Preparazione del campione per le misurazioni AFM
<ol><li>Materiale vegetale: Sterilizzare i semi di mais (Zea mays L.) e segale (Secale cereale L.) con una soluzione di NaOCl allo 0,35% per 10 minuti, lavare 3 volte con acqua distillata e quindi crescere idroponicamente al buio a 27 °C per 4 giorni e 2 giorni, rispettivamente. Per l'esperimento sono state utilizzate radici primarie.</li>
	<li>Preparazione di soluzioni e campioni per il sezionamento di vibratome<ol><li>Preparare la soluzione di agarosio per l'incorporazione delle radici sciogliendo il 3% (p / p) di agarosio a basso punto di fusione in acqua usando un forno a microonde. NOTA: Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in acqua. Se per lo studio è necessario un tampone o qualsiasi altro tipo di mezzo, è meglio utilizzare lo stesso mezzo per la preparazione dell'agarosio, durante il sezionamento e nella cella liquida dell'AFM per evitare di danneggiare il campione.</li>
		<li>Versare uno strato di 4 mm di agarosio fuso al 3% sul fondo della capsula di Petri (diametro = 35 mm) e lasciarlo raffreddare leggermente per evitare danni termici al campione.</li>
		<li>Posizionare orizzontalmente sull'agarosio tre o quattro piccoli pezzi (lunghi circa 5 mm) dell'organo vegetale studiato orizzontalmente sull'agarosio. NOTA: I campioni devono essere immersi per metà ma non immersi nello strato di agarosio. Se il campione non è immerso, potrebbe fuoriuscire dall'agarosio durante il sezionamento del vibratomo. Se il campione affonda sul fondo, sarà troppo vicino al bordo della sezione e diventerà scomodo per ulteriori passaggi.</li>
		<li>Quando un film sottile e semi-solido appare sopra il primo strato di agarosio (30-60 s), versare con attenzione un secondo strato sopra. NOTA: Lo strato inferiore di agarosio non deve solidificarsi completamente. In caso contrario, i due strati potrebbero separarsi l'uno dall'altro durante ulteriori lavori.</li>
		<li>Dopo che l'agarosio è completamente solidificato, ritagliare il blocco contenente il campione. Modellare il blocco in una piramide tronca esagonale per garantirne la stabilità durante un'ulteriore sezione (Figura 1A). NOTA: il campione può essere orientato verticalmente o orizzontalmente all'interno di questo blocco a seconda del tipo di sezione richiesta. Quando si prepara il blocco, lasciare 2-3 mm di agarosio attorno al campione. In questo caso, la sezione del campione sarà trattenuta dallo strato di agarosio al 3%, che faciliterà la sua ulteriore immobilizzazione (Figura 1B).</li>
	</ol></li>
	<li>Sezionamento del campione con la vibratoma<ol><li>Incollare il blocco allo stadio vibratomo con adesivo cianoacrilato. Posiziona il palco nella vibratoma in modo che uno degli angoli della piramide sia rivolto verso la lama del vibratomo. Versare acqua nel bagno vibratomo.</li>
		<li>Impostate i parametri di sezionamento (spessore della sezione, velocità della lama e frequenza di vibrazione) e tagliate il campione. NOTA: Utilizzare gli spessori di sezione compresi tra 200 e 400 μm. Una sezione troppo sottile può introdurre errori nella valutazione delle proprietà meccaniche, mentre una sezione troppo spessa è soggetta a rotture. Per le radici di segale e di mais sono state utilizzate una velocità della lama di 1,3 mm·s-1 e una frequenza di oscillazione di 90 Hz.</li>
		<li>Usando un pennello sottile, spostare la sezione dal bagnomaria su un vetrino e posizionare una goccia d'acqua sulla sezione per evitare che si secchi. Controllare la qualità della sezione al microscopio ottico. NOTA: le sezioni oblique non possono essere utilizzate per misurare il modulo di elasticità. Le pareti cellulari devono essere perpendicolari al piano della sezione, altrimenti potrebbero piegarsi o piegarsi sotto la punta AFM.</li>
	</ol></li>
	<li>Immobilizzazione della sezione per le misure AFM (Figura 1B)<ol><li>Versare uno strato di agarosio fuso all'1% (p/p) (~1 ml) sul fondo del cappuccio della piastra di Petri usando una pipetta. NOTA: Assicurarsi che i lati del cappuccio della capsula di Petri non impediscano alla punta di avvicinarsi al campione. Lo strato di agarosio dovrebbe avere uno spessore di 1 mm e dovrebbe coprire l'intero fondo del cappuccio.</li>
		<li>Dopo che l'agarosio all'1% si è solidificato, rimuovere l'acqua in eccesso dalla sezione portando la carta da filtro sul bordo. NOTA: Non toccare la sezione della pianta con la carta per evitare danni e completa asciugatura del campione.</li>
		<li>Trasferire con attenzione la sezione dal vetrino al centro del cappuccio della piastra di Petri usando un pennello. Utilizzando una pipetta da 20 μL, aggiungere con cautela l'1% di agarosio attorno alla sezione (Figura 1B). NOTA: L'agarosio all'1% non deve salire sul campione stesso. Dovrebbe coprire solo i bordi dello strato di agarosio al 3% che trattiene l'esemplare vegetale. L'agarosio all'1% dovrebbe formare piccole collinette sui bordi di questo strato di agarosio al 3%. Grandi collinette possono impedire al cantilever di avvicinarsi al campione.</li>
		<li>Versare l'acqua o altra soluzione da utilizzare per l'AFM nel tappo della capsula di Petri con la sezione immobilizzata.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparazione e calibrazione AFM
NOTA: Il metodo forza-volume di AFM genera una matrice spazialmente risolta di curve forza-distanza ottenute in ciascun punto dell'area studiata. Ottenere tutti i parametri per la modalità forza-volume (rigidità a sbalzo, IOS, ecc.) in modalità contatto. Procedure simili per strumenti di altri produttori sono state descritte in precedenza10,20.
<ol><li>Selezionare il tipo appropriato di cantilever . NOTA: La rigidità a sbalzo deve essere paragonabile alla rigidità del campione21. Un cantilever molto più rigido del campione non devierà molto, mentre un cantilever troppo morbido non deformerà abbastanza il campione. Una frequenza di risonanza tipica dovrebbe essere sufficiente per far oscillare il cantilever nel liquido (cioè, essere almeno alcune decine di kHz). L'area di contatto dovrebbe essere piccola rispetto alla dimensione della parete cellulare poiché il campione in studio nei calcoli del modulo di Young è assunto come un semispazio infinito. Per le radici di segale e di mais sono stati utilizzati i seguenti cantilever acuti: cantilever taglienti con una frequenza di risonanza tipica di 60 kHz, una costante media della molla di 1,5 N·m-1 e un raggio apicale di 10 nm, o cantilever sferici con una frequenza di risonanza tipica di 75 kHz, una costante media della molla di 2,8 N·m-1, e un raggio apicale di 150 nm.</li>
	<li>Accendere il dispositivo AFM e il software associato (Tabella dei materiali). Montare il cantilever sul supporto della punta per la cella liquida. Posizionare una goccia di liquido sulla punta per evitare la formazione di bolle d'aria sulla punta mentre la si immerge nel liquido. NOTA: In caso di formazione di bolle, il liquido può essere rimosso con una salvietta di precisione e quindi è possibile posizionare una nuova goccia.</li>
	<li>Montare il supporto della punta sulla testina di scansione.</li>
	<li>Inserire un campione duro (vetrino fresco) in un tappo a capsula di Petri. Versare il liquido in esso, assicurandosi che copra il vetrino. Posizionare la testina di scansione sul palco e sollevare il campione in modo che il liquido copra il cantilever.</li>
	<li>Scegliere la scheda Teste nel menu a discesa Strumenti . Assicurarsi che la testina di scansione per la cella liquida sia selezionata.</li>
	<li>Fare clic sul pulsante Mira per aprire la finestra Puntamento laser . Fare clic sul pulsante Fotocamera per aprire la finestra Microscopio ottico . Posizionare il laser sulla punta del cantilever, utilizzando le viti sulla testa AFM e la finestra del microscopio ottico per l'orientamento.</li>
	<li>Scegli la modalità Semicontatto dal menu a discesa nella finestra principale del programma.</li>
	<li>Aprire la scheda Risonanza e scegliere il tipo di cantilever utilizzato nel menu Sonde . Fare clic sul pulsante Auto per determinare la frequenza di risonanza. NOTA: se il cantilever utilizzato non è elencato, aprire Strumenti > Probe Passport. Creare un nuovo file, immettere i parametri a sbalzo e salvarlo. Quindi sceglilo nel menu a discesa Sonda .</li>
	<li>Scegli la modalità Contatto dal menu a discesa nella finestra principale del programma.</li>
	<li>Fare clic sul pulsante N_Force Cal per aprire la finestra di calibrazione a sbalzo. Scegliere il cantilever utilizzato e fare clic sul pulsante Sweep , quindi sul pulsante Spect Meas per determinare la costante della molla a sbalzo utilizzando la procedura di regolazione termica. Chiudere la finestra.</li>
	<li>Impostare il setpoint su 1 nA. Apri la scheda Approccio e fai clic sul pulsante Landing per avvicinarti all'esempio.</li>
	<li>Aprire la scheda Scansione . Impostare la frequenza di scansione su 0,5 Hz. Fare clic sul pulsante Area e impostare la dimensione della scansione su 10 μm x 10 μm e il punto di scansione su 256 x 256. Fare clic sul pulsante Esegui e scansionare circa 20 righe per verificare che non vi sia alcuna contaminazione sul vetro. Fare clic sul pulsante Stop per terminare la scansione senza perdere dati.</li>
	<li>Aprire la scheda Curve . Impostare i parametri per la retrazione e l'avvicinamento rispettivamente a 500 nm e -100 nm.</li>
	<li>Scegliere l'ultima scansione nel menu a discesa Selezionare Fotogramma (Frame ) per osservare la superficie.</li>
	<li>Trova un'area pulita sul vetro e indica il punto in cui deve essere presa la curva forza-deformazione, quindi fai clic sul pulsante Esegui per ottenere la curva. Registra da tre a cinque curve di forza in punti diversi della scansione.</li>
	<li>Fate clic sul pulsante Dati (Data ) per aprire la finestra di analisi e selezionare il fotogramma con la curva forza-deformazione.</li>
	<li>Fare clic sul pulsante Marcatori coppia e indicare la parte lineare della curva di retrazione per calcolare il rapporto tra il segnale DFL e lo spostamento, che è la sensibilità ottica inversa (IOS, nA nm-1) o sensibilità di deflessione.</li>
	<li>Ripetere il punto 2.17 per tutte le curve registrate e annotare tutti i valori calcolati del rapporto segnale DFL/spostamento. Dovrebbero essere uguali.</li>
	<li>Chiudere la finestra di analisi, fare clic sulla scheda Approccio (Approach ), quindi sul pulsante Rimuovi per ritrarre la sonda dal campione.</li>
</ol>3. Acquisizione dei dati
<ol><li>Guidare il campione sotto il cantilever AFM utilizzando il microscopio ottico. Fare clic sulla scheda Approccio , quindi sul pulsante Landing per avvicinarsi al campione in modalità contatto con un SetPoint di 1 nA.</li>
	<li>Fare clic sulla scheda Scansione , quindi sul pulsante Area . Selezionare la dimensione dell'area di 70 μm x 70 μm da scansionare.</li>
	<li>Fare clic sul pulsante Move Probe e controllare l'intera area di scansione spostando lo scanner su di esso. In base al grado di protrusione dello scanner, trova il punto più alto.</li>
	<li>Aprire la scheda Approccio , quindi fare clic sul pulsante Rimuovi per ritrarre dall'esempio. Utilizzando il punto più alto come bersaglio, fare clic sul pulsante Landing per avvicinarsi nuovamente al campione. Quindi, controllare nuovamente la superficie facendo clic sul pulsante Sposta sonda e spostando lo scanner su di essa. Nessuno dei punti nell'area dovrebbe richiedere che lo scanner sia completamente sollevato. NOTA: idealmente, la gamma z dello scanner dovrebbe superare la differenza di altezza del campione. Tuttavia, è accettabile se alcuni punti dell'area di scansione sono al di sotto della capacità dello scanner. Allo stesso tempo, non dovrebbero esserci molti di questi punti. Grandi aree che non possono essere raggiunte dallo scanner possono causare l'aborto di scansione.</li>
	<li>Impostare la frequenza di scansione su 0,5 Hz. Impostare la dimensione della scansione su 70 μm x 70 μm e il punto di scansione su 64 x 64. Fare clic sul pulsante Esegui e scansionare per verificare la superficie del campione e la sua possibile contaminazione con agarosio. NOTA: se il campione ha celle con un grande lume, la dimensione dell'area di scansione può essere ridotta o deve essere spostata in modo che ci siano più pareti cellulari nella scansione.</li>
	<li>Fare clic sul pulsante On nella parte superiore della finestra principale per disattivare il ciclo di feedback.</li>
	<li>Scegli la modalità HDPlus (metodo forza-volume) nel menu a discesa nella finestra principale del programma. Apparirà una finestra aggiuntiva (finestra HD).</li>
	<li>Impostare SetPoint su 0,1 nA nella finestra principale del programma.</li>
	<li>Nella scheda Main della finestra HD, impostare i parametri di scansione (ampiezza e frequenza del movimento sinusoidale a sbalzo) appropriati al campione studiato. NOTA: Ogni tipo di campione e cantilever richiede la selezione dei parametri di scansione. Sono necessari alcuni esperimenti preliminari. Per le radici di mais o di segale sono stati utilizzati cantilever affilati e sferici a un'ampiezza di 400 nm e una frequenza di 300 Hz.</li>
	<li>Apri la scheda Rumori nella finestra HD e inserisci la frequenza di risonanza del cantilever.</li>
	<li>Apri la scheda Quant della finestra HD e inserisci IOS, rigidità a sbalzo, raggio e angolo della punta. Selezionate il modello di contatto che verrà utilizzato per i calcoli in base alla geometria della punta. NOTA: Il modello DMT tiene conto della forza di adesione esistente tra la sonda e il campione ed è più comunemente usato in meccanobiologia21.</li>
	<li>Aprire la scheda Scansione della finestra HD e selezionare i segnali da registrare. Selezionare la direzione in cui viene registrato il segnale. Selezionare la casella Volume forza per ottenere un record di tutte le curve di forza . NOTA: registrare il segnale del modulo di elasticità in entrambe le direzioni avanti e indietro. Fornirà più punti da calcolare.</li>
	<li>Fare clic sul pulsante Off nella parte superiore della finestra principale del programma per attivare il ciclo di feedback.</li>
	<li>Fare clic sul pulsante PhaseCorr nella finestra HD principale per correggere la sensibilità del sistema ottico.</li>
	<li>La scheda vs Time della finestra HD principale presenta la funzione del segnale DFL rispetto al tempo in tempo reale; Selezionare le parti di questa funzione che verranno utilizzate per la determinazione del livello di base e per adattare il modello di contatto per ulteriori calcoli.</li>
	<li>Impostare il valore del punto di scansione su 256 x 256 nella finestra principale del programma. Impostare la frequenza di scansione su 0,2 Hz e fare clic sul pulsante Esegui per eseguire la scansione del campione.</li>
	<li>Dopo l'interruzione della scansione, fare clic sul pulsante On nella parte superiore della finestra principale per disattivare il ciclo di feedback.</li>
	<li>Scegliere Modalità contatto nel menu a discesa, aprire la scheda Approccio e fare clic sul pulsante Rimuovi per ritrarre l'esempio.</li>
	<li>Fare clic sul pulsante Dati per aprire il software di analisi e salvare l'output.</li>
	<li>Alla fine della giornata di misurazione, rimuovere il supporto della punta a sbalzo dalla testa e sciacquarlo accuratamente con acqua ultrapura più volte. Ogni volta, rimuovere l'acqua con una salvietta di precisione.</li>
</ol>4. Valutazione dei dati e post-elaborazione
NOTA: non fare affidamento sui valori del modulo elastico calcolati automaticamente. Poiché la superficie varia notevolmente in altezza, molte curve artefatto dovrebbero essere espulse.
<ol><li>Aprire il file salvato nel software di analisi.</li>
	<li>Selezionare il fotogramma HDForceVolume .</li>
	<li>Tenere premuto il tasto Ctrl e selezionare un fotogramma visivo ottenuto nella stessa direzione di scansione. Fare clic sul pulsante Carica mappa esterna per vedere dove si trovano le pareti cellulari. NOTA: qualsiasi mappa del segnale può essere utilizzata come cornice visiva, ma l'utilizzo della mappa del segnale DFL (diversi strumenti possono riferirsi ad essa come segnale di deflessione o segnale di errore) può essere il modo più semplice.</li>
	<li>Controllare InvOptSens (IOS) e i valori di rigidità a sbalzo nella scheda Principale .</li>
	<li>Apri la scheda Aggiuntivi e controlla i parametri della punta e il modello di contatto.</li>
	<li>Fate clic su vari punti sulle pareti delle celle sulla cornice visiva e selezionate solo le curve ben descritte dal modello. Per informazioni dettagliate, vedere Risultati rappresentativi.</li>
	<li>Annotare i valori ottenuti.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Le proprietà meccaniche delle pareti cellulari primarie determinano la direzione e il tasso di crescita delle cellule vegetali e quindi le dimensioni e la forma future della pianta. Il metodo basato sull'AFM qui presentato integra le tecniche esistenti utilizzate per studiare le proprietà delle pareti cellulari delle piante. Permette di studiare l'elasticità delle pareti cellulari, che appartengono ai tessuti interni della pianta. Utilizzando il metodo presentato, sono state mappate le proprietà meccaniche delle pareti c...

Le proprietà meccaniche della parete cellulare della pianta determinano la forma della cellula e la sua capacità di crescere. Ad esempio, la punta crescente del tubo pollinico è più morbida delle parti non in crescita dello stesso tubo1. La formazione dei primordi sul meristema di Arabidopsis è preceduta da una diminuzione locale della rigidità della parete cellulare nel sito del futuro primordio 2,3. Le pareti cellulari di Arabidopsis hypocotyl, che sono parallele all'asse di crescita principale e crescono più velocemente, sono più morbide di quelle che sono perpendicolari a questo asse e crescono più lentamente 4,5. Nella radice di mais, la transizione delle cellule dalla divisione all'allungamento è stata accompagnata da una diminuzione dei moduli elastici in tutti i tessuti della radice. I moduli sono rimasti bassi nella zona di allungamento e sono aumentati nella zona di allungamento tardivo6.
Nonostante la disponibilità di vari metodi, le grandi matrici di informazioni biochimiche e genetiche sulla biologia della parete cellulare ottenute annualmente sono raramente confrontate con le proprietà meccaniche delle pareti cellulari. Ad esempio, i mutanti sui geni correlati alla parete cellulare hanno spesso una crescita e uno sviluppo alterati 4,7,8, ma sono raramente descritti in termini di biomeccanica. Una delle ragioni di ciò è la difficoltà di condurre misurazioni a livello cellulare e subcellulare. La microscopia a forza atomica (AFM) è attualmente l'approccio principale per tali analisi9.
Negli ultimi anni sono stati condotti numerosi studi basati sull'AFM sulla biomeccanica della parete cellulare vegetale. Sono state studiate le proprietà meccaniche delle pareti cellulari dei tessuti esterni di Arabidopsis 2,3,4,5,10,11 e cipolla 12, nonché delle cellule in coltura 13,14,15. Tuttavia, le cellule superficiali di una pianta possono avere pareti cellulari le cui proprietà meccaniche differiscono da quelle dei tessuti interni6. Inoltre, le cellule vegetali sono pressurizzate dal turgore che le rende più rigide. Per eliminare l'influenza della pressione del turgore, i ricercatori devono utilizzare soluzioni plasmolizzanti 2,3,4,5,10,11 o decomporre i valori ottenuti in turgore e contributi della parete cellulare 12. Il primo approccio porta alla disidratazione del campione e modifica lo spessore e le proprietà della parete cellulare16, mentre il secondo approccio richiede ulteriori misurazioni e matematica complicata e si applica solo a cellule di forma relativamente semplice12. Le proprietà della parete cellulare dei tessuti interni possono essere valutate su criosezioni17 o sezioni di materiale vegetale impregnato di resina8. Tuttavia, entrambi i metodi comportano la disidratazione e / o l'impregnazione dei campioni, che porta inevitabilmente a cambiamenti nelle proprietà. Le proprietà delle cellule isolate o in coltura sono difficili da mettere in relazione con la fisiologia dell'intera pianta. Sia la coltivazione che l'isolamento delle cellule vegetali possono influenzare le proprietà meccaniche delle loro pareti cellulari.
Il metodo qui presentato integra gli approcci sopra menzionati. Usandolo, è possibile esaminare le pareti cellulari primarie di qualsiasi tessuto e in qualsiasi fase dello sviluppo delle piante. Le osservazioni di sezionamento e AFM sono state eseguite in liquido che evita la disidratazione del campione. Il problema del turgore è stato risolto quando le cellule vengono tagliate. Il protocollo descrive il lavoro con le radici di mais e segale, ma qualsiasi altro campione può essere esaminato se è adatto per il sezionamento del vibratomo.
Gli studi AFM qui descritti sono stati eseguiti utilizzando la tecnica forza-volume. Strumenti diversi usano nomi diversi per questo metodo. Tuttavia, il principio di base è lo stesso; Una mappa forza-volume del campione è ottenuta da un movimento sinusoidale o triangolare del cantilever (o campione) per ottenere una certa forza di carico in ogni punto analizzato, registrando la deflessione a sbalzo18. Il risultato combina un'immagine topografica della superficie e la serie di curve forza-distanza. Ogni curva viene utilizzata per calcolare la deformazione, la rigidità, il modulo di Young, l'adesione e la dissipazione di energia in un punto specifico. Dati simili possono essere ottenuti mediante spettroscopia di forza punto per punto dopo la scansione in modalità di contatto19, sebbene richieda più tempo.

<table><tbody><tr><td>Agarosio, basso punto di fusione</td><td>Helicon</td><td>B-5000-0.1</td><td>per la fissazione del campione</td></tr><tr><td>Pennello</td> <td>-</td><td></td> <td>per sezione mobile</td></tr><tr><td>Cantilevers</td><td>NanoTools, Germania</td><td>NT_B150_v0020-5</td><td>Modello: Biosphere B150-FM</td></tr><tr><td>Cantilevers</td><td>NT-MDT, Russia</td><td>FMG01/50</td><td>Modello: FMG01</td></tr><tr><td>Adesivo cianoacrilato</td> <td>-</td><td>-</td><td>per vibratomia</td></tr><tr><td>Vetrini</td><td>Heinz Herenz</td><td>1042000</td><td>per vibratomia e calibrazione AFM</td></tr><tr><td>Software ImageAnalysis P9</td><td>NT-MDT, Russia</td><td></td> <td>- per l'analisi dei dati</td></tr><tr><td>Leica DM1000 microscopio a epifluorescenza Leica</td><td>Biosystems, Germania</td><td>11591301</td><td>per il controllo delle sezioni</td></tr><tr><td>NaOCl</td> <td>-</td><td></td> <td>per la sterilizzazione delle sementi</td></tr><tr><td>Software Nova PX 3.4.1</td><td>NT-MDT,</td> <td>Russia-per</td> <td>esperimenti che conducono</td></tr><tr><td>il microscopio NTEGRA Prima con controller HD</td><td>NT-MDT,</td> <td>Russia-per</td> <td>AFM e acquisizione dati</td></tr><tr><td>Piastra di Petri 35 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>153066</td><td>per la fissazione del campione</td></tr><tr><td>Tip pipetta 1000 &; L</td><td>Thermo Fisher Scientific Pipetta</td><td></td> <td>4642092-Tip</td></tr> <tr><td>2-20 & micro; L</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td> <td>4642062-Acqua</td></tr> <tr><td>ultrapura</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>-Vibratomo Leica VT 1000S</td><td>Leica Biosystems, Germania</td><td>1404723512</td><td>per il sezionamento dei campioni</td></tr></tbody></table>

caratterizzazione delle proprietà meccaniche della parete cellulare primaria in organi vegetali viventi mediante microscopia a forza atomica

Characterizing Mechanical Properties of Primary Cell Wall in Living Plant Organs Using Atomic Force Microscopy

Le proprietà meccaniche delle pareti cellulari primarie determinano la direzione e il tasso di crescita delle cellule vegetali e, quindi, le dimensioni e la forma future della pianta. Molte tecniche sofisticate sono state sviluppate per misurare queste proprietà; tuttavia, la microscopia a forza atomica (AFM) rimane la più conveniente per studiare l'elasticità della parete cellulare a livello cellulare. Uno dei limiti più importanti di questa tecnica è stato che solo le cellule viventi superficiali o isolate possono essere studiate. Qui viene presentato l'uso della microscopia a forza atomica per studiare le proprietà meccaniche delle pareti cellulari primarie appartenenti ai tessuti interni di un corpo vegetale. Questo protocollo descrive le misurazioni dell'apparente modulo di Young delle pareti cellulari nelle radici, ma il metodo può essere applicato anche ad altri organi vegetali. Le misure vengono eseguite su sezioni derivate dal vibratomo di materiale vegetale in una cella liquida, il che consente (i) di evitare l'uso di soluzioni plasmolizzanti o l'impregnazione del campione con cera o resina, (ii) di rendere gli esperimenti veloci e (iii) di prevenire la disidratazione del campione. Sia le pareti cellulari anticlinale che periclinale possono essere studiate, a seconda di come il campione è stato sezionato. Le differenze nelle proprietà meccaniche dei diversi tessuti possono essere studiate in una singola sezione. Il protocollo descrive i principi della pianificazione dello studio, i problemi con la preparazione e le misurazioni dei campioni, nonché il metodo di selezione delle curve di forza-deformazione per evitare l'influenza della topografia sui valori ottenuti del modulo elastico. Il metodo non è limitato dalla dimensione del campione, ma è sensibile alle dimensioni delle celle (cioè, le cellule con un grande lume sono difficili da esaminare).

I tipici moduli elastici e le mappe DFL, nonché le curve di forza ottenute sulle radici di segale e mais con il metodo descritto, sono presentati nella figura 2. La figura 2A mostra il modulo elastico e le mappe DFL ottenute sulla sezione trasversale della radice primaria di segale. Le aree bianche nella mappa del modulo (Figura 2A, a sinistra) corrispondono a una sovrastima errata del modulo di Young dovuta al raggiungimento del li...

Gli studi sulla biomeccanica della parete cellulare sono essenziali per comprendere la crescita e la morfogenesi delle piante. Il seguente protocollo è proposto per studiare le pareti cellulari primarie sottili nei tessuti interni di giovani organi vegetali utilizzando la microscopia a forza atomica.

Caratterizzazione delle proprietà meccaniche della parete cellulare primaria in organi vegetali viventi mediante microscopia a forza atomica

The mechanical properties of the primary cell walls determine the direction and rate of plant cell growth and, therefore, the future size and shape of the ...

La crescita delle cellule vegetali è controllata dalle proprietà meccaniche delle loro pareti cellulari. Pertanto, è importante conoscere queste proprietà in diversi organi e tessuti delle piante. Il metodo qui presentato consente la caratterizzazione biomeccanica delle pareti cellulari non fisse e non disidratate nei tessuti interni delle giovani piante.Iniziare con la preparazione delle soluzioni e del campione per il sezionamento della vibratomia. Versare uno strato di quattro millimetri di agarosio fuso al 3% sul fondo della piastra di Petri e lasciarlo raffreddare leggermente per evitare danni termici al campione. Posizionare orizzontalmente sull'agarosio lunghi circa cinque millimetri tre o quattro pezzi dell'organo vegetale.Circa 30-60 secondi dopo, un sottile film semi-solido apparirà sopra il primo strato di agarosio. Quindi, versare con attenzione un secondo strato sopra. Dopo che l'agarosio è completamente solidificato, ritagliare il blocco contenente il campione.Modella il blocco in una piramide tronca esagonale per garantirne la stabilità durante l'ulteriore sezionamento. Prima di iniziare il sezionamento del campione con il vibratomo, incollare il blocco allo stadio vibratomo con adesivo cianoacrilato. Posiziona il palco nel vibratomo, in modo che uno degli angoli della piramide sia rivolto verso la lama del vibratomo e versa acqua nel bagno di vibratomo.Impostate i parametri di sezionamento come spessore della sezione, velocità della lama e frequenza di vibrazione e tagliate il campione. Utilizzando un pennello sottile, spostare la sezione dal bagno d'acqua su un vetrino e posizionare una goccia d'acqua sulla sezione per evitare che si secchi. Dopo aver controllato la qualità della sezione al microscopio ottico, selezionare la sezione appropriata con la parete cellulare perpendicolare al piano della sezione.Quindi immobilizzare la sezione per le misurazioni al microscopio a forza atomica versando uno strato di un millilitro di agarosio fuso all'1% sul fondo del cappuccio della piastra di Petri usando una pipetta. Dopo che l'agarosio si è solidificato, rimuovere l'acqua in eccesso dalla sezione portando la carta da filtro sul bordo. Trasferire con attenzione la sezione dal vetrino al centro del cappuccio della piastra di Petri usando un pennello.Quindi aggiungere con cautela l'1% di agarosio intorno alla sezione usando una pipetta da 20 microlitri e versare l'acqua o altra soluzione per la microscopia a forza atomica nel tappo della piastra di Petri con la sezione immobilizzata. Guidare il campione sotto il cantilever della microscopia a forza atomica usando il microscopio ottico. Fare clic sul pulsante Approach e quindi sul pulsante Landing per avvicinarsi al campione in modalità di contatto con un set point di un nanoampere.Fare clic sul pulsante Scansione e quindi sul pulsante Area. Selezionare la dimensione dell'area di 50 micrometri per 50 micrometri da scansionare. Fare clic sul pulsante Sposta sonda e controllare l'intera area di scansione spostando lo scanner su di esso e trovando il punto più alto in base al grado di protrusione dello scanner.Aprire la scheda Approccio. Quindi fare clic sul pulsante Rimuovi per ritrarre dal campione. Utilizzando il punto più alto come destinazione, fare clic sul pulsante Landing per avvicinarsi nuovamente al campione.Quindi controllare nuovamente la superficie facendo clic sul pulsante Sposta sonda e spostando lo scanner su di essa. Impostare la velocità di scansione su 0,5 hertz, quindi impostare la dimensione della scansione su 50 micrometri per 50 micrometri e il punto di scansione su 64 per 64. Fare clic sul pulsante Esegui e scansionare per verificare la superficie del campione ed è possibile contaminazione con agarosio.Dopo aver fatto clic sul pulsante On, scegli la modalità HDPlus nel menu a discesa nella finestra principale del programma e imposta il set point su 0,1 nanoampere nella finestra principale del programma. Nella scheda principale della finestra HD, impostare i parametri di scansione appropriati per il campione studiato. Quindi apri la scheda Rumori nella finestra HD e inserisci la frequenza di risonanza del cantilever .Apri la scheda Quant della finestra HD e inserisci IOS, rigidità a sbalzo, raggio della punta e angolo. Selezionare il modello di contatto, che verrà utilizzato per i calcoli in base alla geometria della punta. Successivamente, apri la scheda Scansione della finestra HD e seleziona i segnali, nonché la direzione in cui viene registrato il segnale.Spuntare la casella Force Volume per ottenere una registrazione di tutte le curve di forza e fare clic sul pulsante Off nella parte superiore della finestra principale del programma per attivare il ciclo di feedback Fare clic sul pulsante Phase Core nella finestra HD principale per correggere la sensibilità del sistema ottico. La scheda Tempo Versus della finestra HD principale presenta la funzione del segnale DFL rispetto al tempo in tempo reale. Selezionare le parti di questa funzione che verranno utilizzate per la determinazione del livello di base e per adattare il modello di contatto per ulteriori calcoli.Ora, imposta il valore del punto di scansione su 256 per 256 nella finestra principale del programma. Quindi, impostare la velocità di scansione su 0,2 hertz e fare clic sul pulsante Esegui per eseguire la scansione del campione. Dopo l'interruzione della scansione, fare clic sul pulsante On nella parte superiore della finestra principale per disattivare il ciclo di feedback.Scegliere Modalità contatto nel menu a discesa, aprire la scheda Approccio e fare clic sul pulsante Rimuovi per ritrarre dall'esempio. Fare clic sul pulsante Dati per aprire il software di analisi e salvare l'output. Aprire il file salvato nel software di analisi.Selezionare il fotogramma del volume forza HD. Tenere premuto il tasto Ctrl e selezionare un fotogramma visivo ottenuto nella stessa direzione di scansione. Fare clic sul pulsante Carica mappa esterna per vedere dove si trovano le pareti cellulari.Controllare i valori di rigidità InvOptSens e cantilever nella scheda principale. Apri la scheda Aggiuntivi e controlla i parametri della punta e il modello di contatto. Fate clic su vari punti delle pareti delle celle sulla cornice visiva e selezionate solo le curve ben descritte dal modello.Le aree bianche nella mappa del modulo corrispondono a una sovrastima errata del modulo di Young dovuta al raggiungimento del limite da parte dello scanner nella direzione Z. Questa immagine non è comoda per essere utilizzata come mappa esterna per un'ulteriore selezione di curve di forza soddisfacenti. Tuttavia, la mappa del segnale DFL presentata a destra è più adatta qui.Diversi strumenti possono riferirsi ai segnali DFL come segnali di deflessione o errore. Lo scanner che è stato completamente esteso durante il tentativo di raggiungere il fondo del campione può causare misurazioni errate e persino scansioni interrotte. La presenza di agarosio può essere controllata mentre si ottiene la prima scansione in modalità di contatto poiché le pareti cellulari e alcuni fondi cellulari sono visibili su tali scansioni.Tuttavia, in caso di immobilizzazione imprecisa, la superficie può essere coperta di agarosio, che maschera la topografia del campione. Su quattro diverse curve di forza registrate in punti diversi della stessa parete cellulare, la curva registrata a 0,1 non mostra alcuna linea di base, il che significa nessuna separazione della punta a sbalzo dalla parete cellulare. La curva registrata a 0,3 mostra una spalla sulla parte in avvicinamento che indica la flessione della parete cellulare.I punti due e quattro mostrano curve di forza soddisfacenti con valori di moduli simili. La preparazione e l'esame del campione richiedono pratica, ma possono essere padroneggiati. Una parte cruciale di questo protocollo è filtrare le curve risultanti.Non fare affidamento sui moduli, che sono stati calcolati automaticamente. La stessa tecnica può essere utilizzata per misurare le forze di adesione o la dissipazione di energia. Può anche essere importante per la descrizione del comportamento viscosa o viscoelastico di alcuni materiali.

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Caratterizzazione delle proprietà meccaniche della parete cellulare primaria in organi vegetali viventi mediante microscopia a forza atomica

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