Elettroporazione del DNA plasmidico nel muscolo scheletrico del topo

L'elettroporazione del DNA plasmidico nel muscolo scheletrico è un metodo praticabile per modulare l'espressione genica senza compromettere la contrattilità muscolare nei topi.

Il trasferimento genico mediato dall'elettroporazione nel muscolo è una tecnica facile ed efficiente per studiare i cambiamenti nella fisiologia muscolare. Abbiamo scoperto che l'elettroporazione non compromette la contrattilità muscolare. L'elettroporazione di costrutti genici in muscolo in vivo è una procedura semplice ed efficiente che non richiede un confezionamento più esteso di costrutti genici in vettori virali.

È difficile visualizzare, isolare e iniettare l'EDL a causa della sua posizione e delle sue piccole dimensioni. Praticare su una carcassa di topo e l'iniezione di inchiostro biologico come l'inchiostro dell'India può aiutare a fornire prove di iniezione sufficiente. A dimostrare la procedura sarà Brian Hain, un post doc del mio laboratorio.

Prima di iniettare il topo, confermare il piano chirurgico dell'anestesia usando una pinza con l'assenza del riflesso del pizzico della punta, quindi trasferire il mouse su un cono nasale appoggiato su una piastra d'acqua circolante a 37 gradi Celsius per il resto della procedura. Una volta che il topo è posto in posizione supina, rimuovere i peli da entrambi gli arti posteriori utilizzando piccoli tagliacapelli, quindi disinfettare l'area di iniezione con alternanza di etanolo al 70% e betadina. Per l'iniezione individuare il tibiale anteriore o tendine TA visibile attraverso la pelle sul lato laterale della parte inferiore della gamba e segnare l'estremità superiore del muscolo TA.

Quindi inserire un ago calibro 30 montato su una micro siringa da 50 microlitri nel muscolo con un angolo di cinque gradi poco profondo da uno a due millimetri superiore alla giunzione miotendinea fino a quando l'ago raggiunge l'estremità superiore del muscolo. Premere lo stantuffo mentre si ritrae lentamente l'ago lungo il percorso di iniezione per fornire 50 microlitri della soluzione plasmidica nel muscolo. Il muscolo dovrebbe gonfiarsi.

Impostare il timer per un minuto e misurare lo spessore della gamba sul muscolo TA, quindi impostare gli elettrodi della pinza sullo spessore misurato. Quindi impostare la tensione dell'elettroporatore a 12,5 volt per millimetro. Dopo un minuto, posizionare gli elettrodi della pinza vicino all'arto inferiore senza essere eccessivamente stretti per fornire cinque impulsi a onda quadra con una durata di 20 millisecondi e intervalli di 200 millisecondi.

Il muscolo dovrebbe contrarsi ad ogni impulso. Ripetere la procedura con l'altro arto utilizzando il vettore plasmidico di controllo. Al termine, rimuovere il mouse dal cono del naso e consentire al mouse di recuperare su una piastra riscaldante impostata a 37 gradi Celsius.

Una volta recuperato, riporta il mouse nella sua gabbia. Con il topo in posizione supina, individuare la cresta anteriore dell'osso della tibia visivamente e attraverso una palpitazione delicata. Utilizzare un bisturi per fare un'incisione poco profonda attraverso la pelle sul lato laterale della cresta anteriore della tibia cinque millimetri inferiore al ginocchio a due millimetri superiore alla giunzione miotendinea TA.

Con l'aiuto di piccole forbici seziona senza mezzi termini la fascia, esponendo il muscolo TA, e quindi separa delicatamente il muscolo TA dalla tibia tirando delicatamente il muscolo per rivelare l'estensore digitorum longus o EDL. Mantenere l'TA chiaro dall'EDL durante la procedura utilizzando una piccola pinza curva. Inserire l'ago calibro 30 nell'EDL longitudinalmente fino a quando l'ago raggiunge l'estremità superiore del muscolo e iniettare 10 microlitri della soluzione plasmidica come dimostrato in precedenza.

Il muscolo EDL dovrebbe gonfiarsi. Misurare lo spessore della gamba all'EDL e impostare gli elettrodi della pinza sullo spessore misurato per fornire cinque impulsi a onda quadra come spiegato in precedenza. Al termine, chiudere l'incisione utilizzando suture di nylon monouso 4-0 non riassorbibili.

Successivamente rimuovere il mouse dal cono del naso e consentirgli di recuperare su una piastra riscaldante impostata a 37 gradi Celsius. Somministrare un analgesico sottocutaneo appropriato immediatamente dopo l'intervento chirurgico e da 12 a 24 ore dopo l'intervento chirurgico. Una volta recuperato riportare il mouse alla gabbia di casa.

Dopo l'iniezione e l'elettroporazione del plasmide pcDNA3-EGFP nei muscoli TA ed EDL, è stata osservata l'espressione GFP che indica l'assorbimento del DNA nelle fibre muscolari. Quando viene ripreso con un ingrandimento inferiore, l'efficienza di trasfezione muscolare EDL potrebbe essere visualizzata attraverso l'aspetto di fibre verdi rispetto alle fibre nere. Gli EDL iniettati ed elettroporati hanno avuto risposte tetaniche simili a 100 Hertz rispetto ai muscoli di controllo non iniettati o elettroporati.

L'EDL iniettato ed elettroporato, la forza muscolare tetanica, la forza muscolare tetanica specifica, il tempo di massima tensione e il tempo di mezzo rilassamento non sono stati compromessi rispetto al controllo intatto. È importante identificare con precisione il muscolo da iniettare e fornire in modo efficiente la soluzione plasmidica. Un certo numero di misurazioni istologiche e biochimiche possono essere effettuate utilizzando questo protocollo.

È possibile condurre la localizzazione cellulare della proteina bersaglio, l'abbattimento del gene bersaglio, i reporter trascrizionali e una serie di colorazioni tissutali. Questa tecnica è stata utilizzata per identificare una vasta gamma di cambiamenti nella segnalazione molecolare nel muscolo durante condizioni fisiologiche e fisiopatologiche. Lo studio della contrattilità muscolare a seguito del trasferimento genico è fattibile utilizzando questa tecnica.