Name: Elettroporazione del DNA plasmidico nel muscolo scheletrico del topo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 20 s
Description: Impara l'elettroporazione del DNA plasmidico nel muscolo scheletrico del topo per studiare la fisiologia muscolare. Questa tecnica consente il trasferimento genico efficiente senza compromettere la contrattilità muscolare.

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Tutti gli esperimenti che utilizzano animali sono stati eseguiti presso il Penn State College of Medicine, approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Penn State University, ed eseguiti in conformità con gli standard etici stabiliti nella Dichiarazione di Helsinki del 1964 e nei suoi successivi emendamenti. Per questa procedura sono stati utilizzati topi C57BL/6 di 12 settimane. Tutti gli strumenti chirurgici sono stati autoclavati per la sterilità prima della sperimentazione.
1. Preparazione per iniezione/elettroporazione TA ed EDL
NOTA: questi passaggi sono identici per la preparazione all'iniezione/elettroporazione TA ed EDL.
<ol><li>Purificare i costrutti plasmidici di espressione ad una concentrazione di 1 μg/μL diluito in PBS sterile prima dell'esperimento. Per questa procedura, è stato utilizzato un kit di purificazione privo di endotossine disponibile in commercio per purificare il vettore vuoto pcDNA3-EGFP (GFP) o pcDNA3 (controllo).</li>
	<li>Calcolare la concentrazione del plasmide per garantire un adeguato volume di iniezione (TA 50 μg di DNA in 50 μL di PBS sterile; EDL 10 μg di DNA in 10 μL di PBS sterile) e campioni di aliquota.</li>
	<li>Programmare le impostazioni dell'elettroporatore utilizzando la ruota di selezione e premendo la ruota per scegliere i parametri come segue: Modalità - LV, Tensione - 12,5 V / mm (da regolare al momento dell'iniezione), lunghezza dell'impulso - 20 ms, numero di impulsi - 5, intervallo - 200 ms, polarità - unipolare.</li>
	<li>Anestetizzare i topi usando gas isoflurano. Posizionare i topi in una scatola di induzione con il 5% di isoflurano. Confermare il piano chirurgico dell'anestesia con l'assenza del riflesso del pizzico della punta usando una pinza e ridurre l'isoflurano alla dose di mantenimento del 2%. Trasferire i topi in un cono nasale appropriato appoggiato su una piastra d'acqua circolante a 37 °C per il resto della procedura.</li>
	<li>Rimuovere i peli da entrambi gli arti posteriori usando piccoli tagliacapelli. Strofinare gli arti inferiori con alternanza 70% etanolo/betadina per sanificare l'area di iniezione.</li>
</ol>2. Iniezione/elettroporazione TA
<ol><li>Con il mouse in posizione supina, individuare il tendine TA visibile attraverso la pelle sul lato laterale della parte inferiore della gamba. Utilizzando una microsiringa da 50 μL con un ago staccabile da 30 G, inserire l'ago 1-2 mm superiore alla giunzione miotendinea con un angolo di 5° poco profondo fino a quando l'ago raggiunge l'estremità superiore del muscolo. NOTA: l'iniezione nel mezzo del muscolo è l'obiettivo.</li>
	<li>Premere lentamente lo stantuffo mentre si ritrae lentamente l'ago lungo il percorso di iniezione per erogare 50 μL di soluzione plasmidica. Il muscolo dovrebbe gonfiarsi.</li>
	<li>Impostare il timer per 1 minuto e misurare lo spessore della gamba al TA. A seconda delle dimensioni del mouse, questo può essere da 5-10 mm. Impostare gli elettrodi della pinza sullo spessore misurato e impostare la tensione dell'elettroporatore su 12,5 V/mm.</li>
	<li>Dopo 1 minuto, posizionare gli elettrodi della pinza attorno all'arto inferiore. Gli elettrodi devono essere aderenti ma non eccessivamente stretti. Erogare 5 impulsi a onda quadra, con una durata di 20 ms e intervalli di 200 ms (il muscolo dovrebbe contrarsi ad ogni impulso).</li>
	<li>Ripetete con l'arto alternativo utilizzando il vettore di controllo.</li>
	<li>Rimuovere il mouse dall'anestesia e lasciarlo recuperare su una piastra riscaldante impostata a 37 °C. Una volta recuperato, riporta il mouse nella sua gabbia.</li>
</ol>3. Iniezione/elettroporazione EDL
<ol><li>Con il mouse in posizione supina, individuare la cresta anteriore dell'osso della tibia visivamente e attraverso una delicata palpazione.<ol>
<li>Usando un bisturi, fare un'incisione superficiale attraverso la pelle sul lato laterale della cresta anteriore della tibia 5 mm inferiore al ginocchio a 2 mm superiore alla giunzione miotendinea TA.</li>
		<li>Usando piccole forbici, smussare la fascia, esponendo il muscolo TA.</li>
		<li>Ancora una volta, usando la dissezione smussata con le forbici, separare delicatamente il muscolo TA dalla tibia tirando il muscolo lateralmente, esponendo l'EDL. Piccole pinze curve possono essere utilizzate per mantenere l'AT libero dall'EDL durante la procedura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizzando una microsiringa da 50 μL con un ago staccabile da 30 G, inserire l'ago nell'EDL longitudinalmente fino a quando l'ago raggiunge l'estremità superiore del muscolo.</li>
	<li>Premere lentamente lo stantuffo mentre si ritrae lentamente l'ago lungo il percorso di iniezione per iniettare 10 μL della soluzione plasmidica (il muscolo dovrebbe gonfiarsi).</li>
	<li>Impostare un timer per 1 minuto e misurare lo spessore della gamba all'EDL. A seconda delle dimensioni del mouse, questo può essere da 5-10 mm. Impostare gli elettrodi della pinza sullo spessore misurato e impostare la tensione dell'elettroporatore su 12,5 V/mm.</li>
	<li>Dopo 1 minuto, posizionare gli elettrodi della pinza attorno all'arto inferiore. Gli elettrodi devono essere aderenti ma non eccessivamente stretti. Erogare 5 impulsi a onda quadra, con una durata di 20 ms e intervalli di 200 ms (il muscolo dovrebbe contrarsi ad ogni impulso).</li>
	<li>Chiudere l'incisione utilizzando suture di nylon monouso 4/0 non assorbibili.</li>
	<li>Ripeti con l'arto alternativo o lascia l'arto intatto come controllo assoluto.</li>
	<li>Rimuovere il mouse dall'anestesia e lasciarlo recuperare su una piastra riscaldante impostata a 37 °C. Somministrare un analgesico sottocutaneo appropriato immediatamente dopo l'intervento chirurgico e 12-24 ore dopo l'intervento chirurgico. Una volta recuperato, riporta il mouse nella sua gabbia. NOTA: Studi precedenti hanno dimostrato un deficit di contrattilità muscolare nel TA immediatamente dopo l'elettroporazione e che il recupero contrattile avviene nel corso di 3 giorni13,15. Per questo motivo, l'analisi dei muscoli TA ed EDL per l'istologia, l'espressione proteica o la contrattilità muscolare viene condotta 3-10 giorni dopo l'elettroporazione. L'espressione prolungata di EGFP è stata osservata fino a 3 settimane dopo la procedura13.</li>
</ol>

<ol><li>Dodd, S., Hain, B., Judge, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+prevents+disuse+muscle+atrophy+in+senescent+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">Hsp70 prevents disuse muscle atrophy in senescent rats.</a> Biogerontology. 10, 605-611 (2009).</li>
<li>Dodd, S. L., Gagnon, B. J., Senf, S. M., Hain, B. A., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ros-mediated+activation+of+NF-kappaB+and+Foxo+during+muscle+disuse%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+and+Nerve%22%5BJournal%5D)">Ros-mediated activation of NF-kappaB and Foxo during muscle disuse.</a> Muscle and Nerve. 41 (1), 110-113 (2010).</li>
<li>Dodd, S. L., Hain, B., Senf, S. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp27+inhibits+IKK%CE%B2-induced+NF-%CE%BAB+activity+and+skeletal+muscle+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Hsp27 inhibits IKKβ-induced NF-κB activity and skeletal muscle atrophy.</a> The FASEB Journal. 23 (10), 3415-3423 (2009).</li>
<li>Hain, B. A., Dodd, S. L., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IkappaBalpha+degradation+is+necessary+for+skeletal+muscle+atrophy+associated+with+contractile+claudication%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Regulatory%2C+Integregrative+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">IkappaBalpha degradation is necessary for skeletal muscle atrophy associated with contractile claudication.</a> American Journal of Physiology Regulatory, Integregrative and Comparative Physiology. 300 (3), 595-604 (2011).</li>
<li>Houston, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+protein+70+overexpression+does+not+attenuate+atrophy+in+botulinum+neurotoxin+type+A-treated+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Heat shock protein 70 overexpression does not attenuate atrophy in botulinum neurotoxin type A-treated skeletal muscle.</a> Journal of Applied Physiology. 119 (1), 83-92 (2015).</li>
<li>Reed, S. A., Sandesara, P. B., Senf, S. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+FoxO+transcriptional+activity+prevents+muscle+fiber+atrophy+during+cachexia+and+induces+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Inhibition of FoxO transcriptional activity prevents muscle fiber atrophy during cachexia and induces hypertrophy.</a> The FASEB Journal. 26 (3), 987-1000 (2012).</li>
<li>Senf, S. M., Dodd, S. L., McClung, J. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+overexpression+inhibits+NF-kappaB+and+Foxo3a+transcriptional+activities+and+prevents+skeletal+muscle+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Hsp70 overexpression inhibits NF-kappaB and Foxo3a transcriptional activities and prevents skeletal muscle atrophy.</a> The FASEB Journal. 22 (11), 3836-3845 (2008).</li>
<li>Blaveri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+repair+of+dystrophic+mouse+muscle%3A+studies+on+isolated+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Patterns of repair of dystrophic mouse muscle: studies on isolated fibers.</a> Developmental Dynamics. 216 (3), 244-256 (1999).</li>
<li>Fewell, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+the+treatment+of+hemophilia+B+using+PINC-formulated+plasmid+delivered+to+muscle+with+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for the treatment of hemophilia B using PINC-formulated plasmid delivered to muscle with electroporation.</a> Molecular Therapy. 3 (4), 574-583 (2001).</li>
<li>Wolff, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+gene+transfer+into+mouse+muscle+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct gene transfer into mouse muscle in vivo.</a> Science. 247 (4949), 1465-1468 (1990).</li>
<li>Aihara, H., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+muscle+by+electroporation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into muscle by electroporation in vivo.</a> Nature Biotechnology. 16 (9), 867-870 (1998).</li>
<li>Mir, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+gene+transfer+into+skeletal+muscle+mediated+by+electric+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (8), 4262-4267 (1999).</li>
<li>Schertzer, J. D., Plant, D. R., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+plasmid-based+gene+transfer+for+investigating+skeletal+muscle+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Optimizing plasmid-based gene transfer for investigating skeletal muscle structure and function.</a> Molecular Therapy. 13 (4), 795-803 (2006).</li>
<li>Hain, B. A., Xu, H., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+REDD1+prevents+chemotherapy-induced+muscle+atrophy+and+weakness+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cachexia%2C+Sarcopenia+and+Muscle%22%5BJournal%5D)">Loss of REDD1 prevents chemotherapy-induced muscle atrophy and weakness in mice.</a> Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 12 (6), 1597-1612 (2021).</li>
<li>Schertzer, J. D., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmid-based+gene+transfer+in+mouse+skeletal+muscle+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Plasmid-based gene transfer in mouse skeletal muscle by electroporation.</a> Methods in Molecular Biology. 433, 115-125 (2008).</li>
<li>Roche, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+and+histological+changes+in+skeletal+muscle+following+in+vivo+gene+transfer+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 301 (5), 1239-1250 (2011).</li>
<li>Hain, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zoledronic+Acid+Improves+Muscle+Function+in+Healthy+Mice+Treated+with+Chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Zoledronic Acid Improves Muscle Function in Healthy Mice Treated with Chemotherapy.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 35 (2), 368-381 (2020).</li>
<li>Hain, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((REDD1+deletion+attenuates+cancer+cachexia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">REDD1 deletion attenuates cancer cachexia in mice.</a> Journal of Applied Physiology. 131 (6), 1718-1730 (2021).</li>
<li>Hain, B. A., Xu, H., Wilcox, J. R., Mutua, D., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy-induced+loss+of+bone+and+muscle+mass+in+a+mouse+model+of+breast+cancer+bone+metastases+and+cachexia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cachexia%2C+Sarcopenia+and+Muscle+Rapid+Communications%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy-induced loss of bone and muscle mass in a mouse model of breast cancer bone metastases and cachexia.</a> Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle Rapid Communications. 2 (1), (2019).</li>
<li>Waning, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excess+TGF-beta+mediates+muscle+weakness+associated+with+bone+metastases+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Excess TGF-beta mediates muscle weakness associated with bone metastases in mice.</a> Nature Medicine. 21, 1262-1271 (2015).</li>
<li>Bonetto, A., Andersson, D. C., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+muscle+mass+and+strength+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bonekey+Reports%22%5BJournal%5D)">Assessment of muscle mass and strength in mice.</a> Bonekey Reports. 4, 732(2015).</li>
<li>Senf, S. M., Dodd, S. L., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOXO+signaling+is+required+for+disuse+muscle+atrophy+and+is+directly+regulated+by+Hsp70%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">FOXO signaling is required for disuse muscle atrophy and is directly regulated by Hsp70.</a> American Journal of Physiology Cell Physiology. 298 (1), 38-45 (2010).</li>
<li>Rana, Z. A., Ekmark, M., Gundersen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexpression+after+electroporation+of+plasmid+mixtures+into+muscle+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica%22%5BJournal%5D)">Coexpression after electroporation of plasmid mixtures into muscle in vivo.</a> Acta Physiologica. 181 (2), 233-238 (2004).</li>
<li>Sokolowska, E., Blachnio-Zabielska, A. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Critical+Review+of+Electroporation+as+A+Plasmid+Delivery+System+in+Mouse+Skeletal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">A Critical Review of Electroporation as A Plasmid Delivery System in Mouse Skeletal Muscle.</a> Integrative Journal of Molecular Science. 20 (11), (2019).</li>
<li>Molnar, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+the+efficacy%2C+longevity%2C+and+safety+of+electroporation-assisted+plasmid-based+gene+transfer+into+mouse+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Factors influencing the efficacy, longevity, and safety of electroporation-assisted plasmid-based gene transfer into mouse muscles.</a> Molecular Therapy. 10 (1), 447-455 (2004).</li>
</ol>

B.A.H. e D.L.W non rivendicano conflitti di interesse.

Il trasferimento genico in vivo nel muscolo scheletrico potenziato dall'elettroporazione è uno strumento utile e relativamente semplice per modulare l'espressione proteica nel muscolo. Abbiamo mostrato i passaggi necessari per ottenere un trasferimento genico efficiente nei muscoli EDL e TA e dimostrato che la misurazione della contrattilità dell'EDL è praticabile seguendo la procedura. Questa tecnica non richiede vettori virali più complicati e consente il confronto trasfettato e non trasfettato dell'area della...

L'elettroporazione del DNA plasmidico nel muscolo scheletrico in vivo è uno strumento importante per valutare i cambiamenti nella fisiologia del muscolo scheletrico e nella segnalazione molecolare modulando l'espressione genica in una varietà di condizioni fisiologiche e fisiopatologiche 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Il trasferimento genico sperimentale nel muscolo scheletrico è stato dimostrato già nel 1990 da Wolff et al., dove sia l'RNA che il DNA sono stati trasferiti con successo senza elettroporazione e l'espressione della luciferasi è stata mantenuta per almeno 2 mesi10. L'efficienza di trasfezione relativamente bassa con la sola iniezione è problematica, e Aihara e Miyazaki hanno dimostrato un aumento del trasferimento genico con l'elettroporazione nel 1998 elettroporando un costrutto pCAGGS-IL-5 nel muscolo tibiale anteriore (TA) e misurando l'espressione sierica di IL-511. Da quel momento, molti studi hanno studiato l'efficacia di diverse concentrazioni di DNA, volumi e parametri di elettroporazione per garantire la massima efficienza di trasferimento genico. Mir et al. hanno testato diversi parametri di elettroporazione, tra cui tensione, numero di impulsi, durata e frequenza dell'impulso, nonché concentrazione di DNA, e hanno determinato che una maggiore tensione, numero di impulsi e concentrazione di DNA hanno contribuito ad aumentare l'efficienza dell'elettroporazione12. Un avvertimento importante per l'alta tensione di elettroporazione è che, mentre facilita l'aumento dell'assorbimento del DNA nelle miofibre, provoca anche danni muscolari, che possono confondere i risultati. Schertzer et al. hanno dimostrato che l'elettroporazione a 200 V ha causato danni in circa il 50% delle miofibre 3 giorni dopo l'elettroporazione, mentre solo il 10% delle miofibre è stato danneggiato a 50 V13. Abbiamo preso in considerazione le variabili che influenzano il trasferimento efficiente del DNA rispetto al danno muscolare e abbiamo scoperto che una tensione di 125 V per centimetro di larghezza della pinza è sufficiente per realizzare un efficace trasferimento genico.
L'analisi dell'area della sezione trasversale delle fibre muscolari e la contrattilità dell'intero muscolo dopo l'elettroporazione sono aspetti importanti del metodo per misurare i cambiamenti nelle dimensioni e nella funzione muscolare dovuti alla modulazione genica. Noi e altri abbiamo precedentemente dimostrato che l'elettroporazione dei vettori di controllo da sola non causa una diminuzione dell'area della miofibra. Il costrutto della proteina fluorescente verde (EGFP) è stato un utile indicatore fluorescente della trasfezione del DNA in questi studi13,14. Numerosi studi hanno studiato la contrattilità in situ del TA dopo elettroporazione e hanno trovato risultati variabili. Uno studio ha dimostrato che l'elettroporazione a 75 V / cm ha causato una riduzione di circa il 30% della forza tetanica 3 giorni dopo l'elettroporazione, e da 7 giorni dopo l'elettroporazione, la forza tetanica è tornata al livello di controllo, mentre l'elettroporazione a 50 V / cm non ha compromesso la forza13,15. Un altro studio ha dimostrato che c'è stata una perdita del 30% di forza tetanica 3 ore dopo 180 V / cm di elettroporazione, che è tornata ai livelli di forza fittizia dopo 7 giorni16.
Nella seguente procedura dettagliata, dimostriamo l'iniezione e l'elettroporazione di un plasmide pcDNA3-EGFP nei muscoli TA ed estensore digitorum longus (EDL) dei topi. Dimostriamo anche che questo metodo non influisce sulla contrattilità del muscolo intero EDL. L'obiettivo è dimostrare un efficace assorbimento del plasmide nelle miofibre senza causare perdita di funzione.

<table><tbody><tr><td>Sutura in nylon 4-0 (non assorbibile)</td><td>Ethicon</td><td>662G</td><td>Sutura per chiudere l'incisione cutanea</td></tr><tr><td>50&micro; l Siringa Hamilton</td><td>Microsiringa</td><td>Hamilton</td><td>80501</td></tr><tr><td>Topi C57BLl/6NHsd</td><td>Envigo</td><td>044</td><td>Topi femmina di 12 settimane utilizzati per la sperimentazione</td></tr><tr><td>Elettrodo calibro</td><td>BTX</td><td>45-0102</td><td>1,0 cm x 1,0 cm in acciaio inox</td></tr><tr><td>Controllo dinamico dei muscoli Acquisizione/analisi dei dati</td><td>Aurora Scientific</td><td>605A</td><td>Software utilizzato per la misurazione e l'analisi della contrattilità muscolare</td></tr><tr><td>ECM 830 Sistema di elettroporazione</td><td>BTX</td><td>45-0662</td><td>Elettroporatore</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>Kit di purificazione dei plasmidi</td></tr><tr><td>Forbici extra strette</td><td>Fine Science Tools</td><td>14088-10</td><td>Forbici per dissezione smussata</td></tr><tr><td>Trasduttore di forza</td><td>Aurora Scientific</td><td>407A</td><td>Per misurare la forza da EDL</td></tr><tr><td>Micro-Masquito Hemastats</td><td>Fine Science Tools</td><td>13010-12</td><td>Ematostati per l'espressione del</td></tr><tr><td>vettore di espressione dei mammiferi pcDNA3.1</td><td>Fisher Scientific</td><td>V79020</td><td>Vettore di controllo</td></tr><tr><td>del plasmide di espressione pcDNA3-EGFP</td><td>Addgene</td><td>13031</td><td>Plasmide per l'espressione di GFP</td></tr><tr><td>Pinze curve Semken</td><td>Fine Science Tools</td><td>11009-13</td><td>Pinze per chirurgia</td></tr><tr><td>Lame chirurgiche in acciaio inossidabile n. 10</td><td>Becton Dickinson</td><td>37 1210</td><td>Lame per bisturi</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. media</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td>Terreni di congelamento per istologia</td></tr><tr><td>Germe di grano Agglutinina - Texas Red</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>W21405</td><td>Colorazione della membrana per la sezione trasversale del muscolo</td></tr></tbody></table>

elettroporazione del dna plasmidico nel muscolo scheletrico del topo

Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle

La modulazione transitoria dell'espressione genica nel muscolo scheletrico murino mediante elettroporazione plasmidica è uno strumento utile per valutare la fisiologia normale e patologica. La sovraespressione o l'abbattimento dei geni bersaglio consente ai ricercatori di manipolare singoli eventi molecolari e, quindi, comprendere meglio i meccanismi che influenzano la massa muscolare, il metabolismo muscolare e la contrattilità. Inoltre, l'elettroporazione dei plasmidi del DNA che codificano i tag fluorescenti consente ai ricercatori di misurare i cambiamenti nella localizzazione subcellulare delle proteine nel muscolo scheletrico in vivo. Una valutazione funzionale chiave del muscolo scheletrico include la misurazione della contrattilità muscolare. In questo protocollo, dimostriamo che gli studi di contrattilità dell'intero muscolo sono ancora possibili dopo l'iniezione di DNA plasmidico, l'elettroporazione e la modulazione dell'espressione genica. L'obiettivo di questa procedura didattica è dimostrare il metodo passo-passo dell'elettroporazione del plasmide del DNA nel muscolo scheletrico del topo per facilitare l'assorbimento e l'espressione nelle miofibre dei muscoli tibiale anteriore ed estensore digitorum longus, nonché dimostrare che la contrattilità del muscolo scheletrico non è compromessa dall'iniezione e dall'elettroporazione.

L'elettroporazione per facilitare il trasferimento genico nel muscolo scheletrico è una tecnica utile utilizzata per valutare i cambiamenti nella fisiologia muscolare. Abbiamo dimostrato una procedura dettagliata e passo-passo per realizzare un trasferimento genico efficiente sia nei muscoli TA che EDL. Le differenze nell'efficienza di trasfezione si verificano a causa di una serie di variabili. Tra queste variabili ci sono i parametri di elettroporazione (impulsi, tensione, durata dell'impulso, ecc.), La dimensione del ...

L'elettroporazione del DNA plasmidico nel muscolo scheletrico è un metodo praticabile per modulare l'espressione genica senza compromettere la contrattilità muscolare nei topi.

Elettroporazione del DNA plasmidico nel muscolo scheletrico del topo

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological ...

Il trasferimento genico mediato dall'elettroporazione nel muscolo è una tecnica facile ed efficiente per studiare i cambiamenti nella fisiologia muscolare. Abbiamo scoperto che l'elettroporazione non compromette la contrattilità muscolare. L'elettroporazione di costrutti genici in muscolo in vivo è una procedura semplice ed efficiente che non richiede un confezionamento più esteso di costrutti genici in vettori virali.È difficile visualizzare, isolare e iniettare l'EDL a causa della sua posizione e delle sue piccole dimensioni. Praticare su una carcassa di topo e l'iniezione di inchiostro biologico come l'inchiostro dell'India può aiutare a fornire prove di iniezione sufficiente. A dimostrare la procedura sarà Brian Hain, un post doc del mio laboratorio.Prima di iniettare il topo, confermare il piano chirurgico dell'anestesia usando una pinza con l'assenza del riflesso del pizzico della punta, quindi trasferire il mouse su un cono nasale appoggiato su una piastra d'acqua circolante a 37 gradi Celsius per il resto della procedura. Una volta che il topo è posto in posizione supina, rimuovere i peli da entrambi gli arti posteriori utilizzando piccoli tagliacapelli, quindi disinfettare

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Si descrivono le modalità dettagliate per la trasfezione efficiente di DNA plasmidico nelle fibre dei muscoli piedi di topi dal vivo utilizzando elettroporazione e la successiva visualizzazione di espressione della proteina usando la microscopia a fluorescenza.

Transfection DNA dei mammiferi muscoli scheletrici con In Vivo Elettroporazione

Questo video dimostra la consegna di DNA plasmidico nelle cellule neuronali cerebellari di embrioni murini utilizzando l'elettroporazione in utero. Questo metodo è utile per comprendere la funzione in vivo dei geni nel normale sviluppo cerebrale e i cambiamenti nell'espressione genica delle cellule neuronali durante la progressione tumorale.

Consegna genica basata sull'elettroporazione in utero: una tecnica per iniettare DNA plasmidico nelle cellule cerebellari embrionali di embrioni murini

I progenitori miogenici derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) sono promettenti candidati per le strategie di terapia cellulare per il trattamento delle distrofie muscolari. Questo protocollo descrive i trapianti e le misurazioni funzionali necessarie per valutare l'innesto e la differenziazione dei mesoangioblasti derivati dall'iPSC (un tipo di progenitori muscolari) nei modelli di topo di rigenerazione muscolare acuta e cronica.

Trapianto di progenitori miogenici pluripotenti derivati da cellule staminali indotte simili a mesoangioblasti nei modelli di topo di rigenerazione muscolare

La superficie piale è una zona progenitore unico nel SNC che sta ricevendo crescente attenzione. Qui, noi dettaglio un metodo per la manipolazione genetica rapido di questa zona progenitore utilizzando un metodo di elettroporazione modificato. Questa procedura può essere utilizzata per indagini cellulari e molecolari delle linee cellulari e vie di segnalazione coinvolte nella differenziazione cellulare e per chiarire il destino e le proprietà delle cellule figlie.

Neonatale Pial elettroporazione Surface

Questo articolo descrive microiniezione ed elettroporazione di topo testicolo in vivo come una tecnica di trasfezione per le cellule testicolari di topo per studiare processi unici di spermatogenesi. Il protocollo presentato prevede fasi di preparazione capillare di vetro, microiniezione attraverso il dotto efferente, e trasfezione mediante elettroporazione.

In Vivo Microiniezione e Elettroporazione di mouse Testicolo

Questo protocollo utilizza l'elettroporazione per introdurre ed esprimere proteine marcate in fluorescenza nelle fibre muscolari del topo. Dopo il recupero dopo l'elettroporazione, le fibre vengono isolate. Le singole fibre vengono quindi visualizzate utilizzando la microscopia confocale ad alta risoluzione per visualizzare la struttura muscolare.

Elettroporazione DNA, isolamento e imaging di miofibre

Descriviamo un metodo novello per la consegna del plasmide del DNA nelle cellule uroteliali del mouse della vescica in vivo tramite cateterizzazione dell'uretra e l'elettroporazione. Offre un modo veloce e conveniente per la generazione di modelli murini autoctoni di malattie di vescica.

Nuovo metodo di consegna plasmide DNA Urothelium della vescica del Mouse mediante elettroporazione

La fluorometria funzionale sito-diretta è un metodo per studiare i movimenti del dominio proteico in tempo reale. La modifica di questa tecnica per la sua applicazione nelle cellule native consente ora il rilevamento e il tracciamento dei movimenti di singoli sensori di tensione dai canali Ca2+ voltaggio-dipendenti nelle fibre muscolari scheletriche isolate murine.

Fluorometria funzionale sito-diretta in cellule native per studiare l'eccitabilità del muscolo scheletrico

Qui, presentiamo un protocollo che combina l'elettroporazione e la denervazione in vivo del muscolo elevatore cranico auris longus (LAL). Questa procedura consente lo studio del potenziale ruolo delle proteine di derivazione muscolare nella rigenerazione della sinapsi neuromuscolare.

Elettroporazione combinata in vivo e reinnervazione a breve termine del muscolo scheletrico elevatore cranico Auris Longus

Qui, presentiamo un approccio di terapia genica che somministra chitosano rivestito di ABE direttamente al midollo osseo mediante iniezione intraossea.

Miglioramento della consegna e dell'espressione genica mediante iniezione intraossea di plasmidi editor di base adenina incapsulati con nanoparticelle di chitosano

Impara l'elettroporazione del DNA plasmidico nel muscolo scheletrico del topo per studiare la fisiologia muscolare. Questa tecnica consente il trasferimento genico efficiente senza compromettere la contrattilità muscolare.

Elettroporazione del DNA plasmidico nel muscolo scheletrico del topo

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