Strumenti microfluidici per sondare le interazioni fungine-microbiche a livello cellulare

Utilizzando i dispositivi microfluidici presentati, possiamo esaminare le interazioni dinamiche tra funghi e altri microbi con un preciso controllo spaziale e ambientale, nonché l'imaging ad alta risoluzione a livello di singola cellula. È importante sottolineare che la crescita fungina può essere confinata e diretta all'interno del canale microfluidico. Consente di ottenere immagini time lapse di alta qualità.

Pertanto, le complessità delle interazioni fungino-fungine e fungino-batterico possono essere esplorate. Comprendere le interazioni microbiche fungine è un passo essenziale per definire e preservare il microbioma del suolo. Queste conoscenze possono essere sfruttate per lo sviluppo di nuovi agenti di biocontrollo con un'agricoltura sostenibile.

Per iniziare, preparare circa 40 grammi di poli(dimetilsilossano) o PDM, mescolando accuratamente la base e l'agente polimerizzante in un rapporto 10 a 1 usando una spatola in un bicchiere di plastica pulito. Per rimuovere tutte le bolle d'aria, posizionare la tazza in una camera a vuoto per un'ora. Successivamente, utilizzando del nastro trasparente, fissare lo stampo master in un supporto di plastica e utilizzare aria filtrata compressa per rimuovere eventuali particelle di polvere, quindi versare i PDM sul centro dello stampo master e lasciarlo depositare.

Per evitare l'assestamento di particelle di polvere sulla superficie dei PDM, coprire liberamente lo stampo principale con un coperchio di plastica, quindi trasferire lo stampo principale in un forno e polimerizzare durante la notte a 70 gradi Celsius. Dopo aver rimosso lo stampo master dal forno e averlo lasciato raffreddare, staccare i PDM polimerizzati dallo stampo master e dal telaio in plastica senza danneggiare lo stampo master nei PDM. Quindi, per mantenere una superficie priva di polvere, posizionare del nastro trasparente sui microcanali in rilievo nei PDM.

Quindi, utilizzare una ghigliottina montata o una lama di rasoio per tagliare i PDM in lastre come indicato dal design. Quando si taglia l'apertura laterale della lastra PDM utilizzata per il dispositivo di interazione batterico-fungino, o dispositivo BFI, assicurarsi che i microcanali siano completamente aperti. Tuttavia, per le lastre PDM utilizzate nell'assemblaggio del dispositivo di interazione fungo-fungo, o FFI, ogni angolo deve essere tagliato in modo che si adatti a una capsula di Petri con fondo di vetro.

Quindi, utilizzare una fresa di precisione per perforare i fori di ingresso o di uscita in base al design del dispositivo. Quindi, immergere le lastre PDM in una soluzione di idrossido di sodio molare 0,5. Risciacquare le lastre in acqua sterile a doppio distillato prima di trasferirle in una soluzione di etanolo al 70%.

Dopo aver rimosso l'etanolo e risciacquato nuovamente le lastre con acqua sterile a doppia distillazione, immergere le lastre in acqua sterile a doppio distillato e sonicare per cinque minuti, quindi rimuovere la lastra PDM dall'acqua, asciugarle con aria filtrata compressa e metterle in una piastra di Petri quadrata sterile. Quindi, incubare la piastra di Petri con lastra PDM in un forno a 70 gradi Celsius per un'ora. Una volta che le lastre si sono raffreddate in un ambiente privo di polvere, eliminare la polvere dalla loro superficie usando nastro adesivo e aria filtrata compressa.

Per attivare le superfici delle lastre PDM e delle piastre di Petri con fondo di vetro, che verranno successivamente incollate tra loro, posizionarle in un detergente al plasma con le superfici da attivare rivolte verso l'alto. Dopo aver rimosso la lastra PDM nelle piastre di Petri dal detergente al plasma, incollarle delicatamente posizionando le superfici attivate in contatto conforme tra loro. Legare la lastra BFI e FFI PDM con piastre di Petri di 35 millimetri e 55 millimetri di diametro, rispettivamente per verificare il successo dell'incollaggio, provare a estrarre il laboratorio PDM dalla sua capsula di Petri con una pinzetta.

Visualizza attentamente il dispositivo con l'occhio o al microscopio generico per garantire che non ci sia collasso delle prese d'ingresso o dei microcanali di inoculazione. Per condizioni sature di acqua o ricche di sostanze nutritive, pipettare 100 microlitri della soluzione desiderata per riempire i dispositivi BFI immediatamente dopo l'incollaggio. Per i dispositivi FFI, aggiungere 30 microlitri del supporto in ogni ingresso.

Infine, aggiungere da 100 a 200 microlitri di acqua sterile a doppia distillazione alla capsula di Petri per mantenere l'umidità. Tuttavia, per le condizioni di acqua insatura, basta aggiungere da 100 a 200 microlitri di acqua sterile a doppia distillazione alla capsula di Petri per mantenere l'umidità. Per l'inoculazione fungina, all'interno di una cappa a flusso laminare, utilizzando una piralide di sughero sterilizzata, rimuovere un tappo di agar da una colonia alla periferia di una coltura di tre giorni, assicurandosi di mantenere intatto il fronte ifale in crescita.

Quindi introdurre il tappo di agar nell'ingresso fungino del dispositivo BFI e / o FFI con il lato micelio verso il basso nella parte anteriore ifale orientata verso le aperture dei microcanali per incoraggiare l'infiltrazione ifale dei canali. Per il dispositivo FFI, introdurre un altro tappo di agar con una seconda specie fungina nell'ingresso opposto. Quindi, sigillare la capsula di Petri con una pellicola trasparente e incubare a 25-28 gradi Celsius al buio fino all'imaging.

Per l'inoculazione batterica, dopo aver rimosso il dispositivo BFI dall'incubatore, pipettare 10 microlitri di una sospensione batterica nell'ingresso batterico in un ambiente sterile. Una volta che la capsula di Petri è sigillata con una pellicola trasparente, conservare il dispositivo in posizione verticale a 25 gradi Celsius al buio fino all'inizio dell'imaging. Utilizzando questo protocollo, l'interazione tra il fungo Coprinopsis cinerea e il batterio Bacillus subtilis potrebbe essere visualizzata con successo.

È stato osservato che in presenza del batterio, il tasso di crescita del fungo ha iniziato a diminuire drasticamente dopo circa cinque ore di coinoculazione. Inoltre, le ife fungine associate ai batteri avevano un aspetto sottile e trasparente. La microscopia a fluorescenza time lapse ha anche rivelato il collasso delle ife fungine dopo cinque ore di coinoculazione con Bacillus subtilis.

Tuttavia, da sei ore in poi, anche la popolazione batterica ha iniziato a diminuire. La visualizzazione delle interazioni fungo-fungo ha mostrato che Fusarium graminearum ha fortemente inibito la crescita di Trichoderma rossicum, che era evidente usando la microscopia a fluorescenza. Questo protocollo ha inoltre rivelato significativi cambiamenti morfologici nel fungo Verticillium longisporum in presenza di batteri Pseudomonas synxantha e Pseudomonas fluorescens.

La tecnica di imaging dinamico ad alta risoluzione utilizzata nello studio ha anche rivelato la formazione di setti in Fusarium graminearum in presenza del fungo Clonostachys rosea. L'etichettatura a fluorescenza ha permesso la quantificazione dinamica della proliferazione ifale di Clonostachys rosea nel dispositivo FFI. Questi dispositivi possono essere adattati e modificati dall'utente per incorporare diverse specie di interesse e affrontare le loro specifiche domande sperimentali riguardanti le interazioni microbiche fungine.

Sia i dispositivi BFI che FFI hanno spinto le frontiere scientifiche, rivelando come i funghi propagano segnali di difesa e nutrienti all'attacco di funghi, virus, nematodi e consentendo indagini sulla dispersione batterica.