Determinazione dell'affinità di legame (K_D) degli anticorpi radiomarcati contro gli antigeni immobilizzati

Questo metodo può determinare l'affinità di legame di un anticorpo radiomarcato per il suo antigene. Misurerà anche la specificità del binding. Il vantaggio principale di questo semplice metodo è la caratterizzazione specifica dell'affinità di legame del solo anticorpo radiomarcato senza interferenze da parte dell'anticorpo parentale non coniugato.

Questa tecnica convalida quantitativamente la capacità di un anticorpo radiomarcato di legarsi al suo bersaglio. Questo è importante per le applicazioni nell'imaging nucleare e nella terapia nucleare in una varietà di malattie. A dimostrare la procedura sarà Erika Belitzky, una post-laurea associata del mio laboratorio.

Per iniziare, preparare un tampone di immobilizzazione aggiungendo 191 milligrammi di bicarbonato di sodio e 23,9 milligrammi di carbonato di sodio a un tubo conico da 50 millilitri. Quindi, aggiungere 40 millilitri di acqua da 18 megaohm e sciogliere vorticosamente. Ora, regola il pH a 9,0 prima di portare il volume totale a 50 millilitri.

Quindi, preparare 200 millilitri di tampone di lavaggio aggiungendo 200 millilitri di PBS e 100 microlitri di Tween 20 a una bottiglia da 250 millilitri. Preparare anche 50 millilitri di tampone legante aggiungendo 50 milligrammi di BSA e 25 microlitri di Tween da 20 a 50 millilitri di PBS e mescolare per vortice. Aggiungere 1,5 grammi di BSA a 50 millilitri di PBS per preparare il tampone di blocco e vortice delicatamente per mescolare.

Diluire l'antigene nel tampone di immobilizzazione. Quindi, prendi una piastra a fondo piatto frangibile, a 96 pozzetti, e aggiungi 100 microlitri di antigene sul fondo di ogni pozzetto di 24 pozzetti in un array otto per tre. Coprire la piastra con nastro sigillante e incubare a quattro gradi Celsius durante la notte.

Il giorno dopo, lavare il piatto tre volte con tampone di lavaggio. Capovolgere rapidamente la piastra nel lavandino per smaltire il liquido e picchiettare la piastra su una pila di asciugamani di carta per rimuovere il liquido in eccesso. Quindi, ai pozzetti contenenti l'antigene, aggiungere 300 microlitri di tampone di lavaggio per pozzo utilizzando una pipetta multicanale.

Aggiungere 300 microlitri di tampone bloccante per pozzetto sia a 24 pozzi rivestiti di antigene che a 24 pozzetti vuoti della piastra a 96 pozzetti. Quindi, incubare la piastra per un'ora a temperatura ambiente e lavare ogni pozzetto della piastra tre volte con 300 microlitri di tampone di lavaggio. Effettuare tre diluizioni seriali dell'anticorpo radiomarcato nel tampone di legame per otto righe designate come da A a H sulla piastra.

In primo luogo, calcolare il volume di anticorpi radiomarcati di riserva necessari per produrre una soluzione da 1,2 millilitri della prima concentrazione. Quindi, aggiungere 800 microlitri di tampone legante ai tubi di microcentrifuga etichettati da B a H e aggiungere il volume richiesto di tampone di legame a un tubo di microcentrifuga etichettato A.Aggiungere delicatamente il volume calcolato di anticorpo radiomarcato di serie al tubo A e al vortice. Quindi, girare verso il basso usando un mini-microcentrifuga per raccogliere tutto il liquido sul fondo del tubo.

Quindi, aggiungere 400 microlitri di liquido da due A al tubo B.Dopo il vortice, ruotarlo verso il basso usando un mini-microcentrifuga. Allo stesso modo, aggiungere la soluzione dal tubo B al tubo C, da C a D, fino al tubo H.Aggiungere 100 microlitri di ogni diluizione per pozzetto a tre pozzetti immobilizzati con antigene e tre pozzetti bloccati solo con BSA. Ora, aggiungi 100 microlitri di ogni diluizione ai tubi microcentrifuga etichettati come standard A allo standard H e salva questi tubi come standard di anticorpi radiomarcati da dosare nel contatore gamma.

Incubare la piastra per un'ora a 37 gradi Celsius con un leggero dondolio. Etichettare i tubi microcentrifuga per ciascun pozzetto come descritto nel manoscritto. Aspirare l'anticorpo radiomarcato dai pozzetti della piastra a 96 pozzetti usando un aspiratore a vuoto.

Ora, utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 300 microlitri di tampone di lavaggio a ciascun pozzetto. Aspirare il tampone di lavaggio e ripetere il lavaggio altre quattro volte. Rompere i pozzetti negli appositi tubi microcentrifuga.

Contare la radioattività nei tubi con l'antigene contrassegnato come H1, H2, H3, da H3 ad A1, A2, A3, e poi con BSA contrassegnato solo come H4, H5, H6, ad A4, A5, A6 usando un contatore gamma. Amivantamab radiomarcato ha mostrato un legame specifico per le proteine EGFR e cMET. Affinità di legame simili sono state mantenute anche da fabbriche radiomarcate a braccio singolo legate alle proteine EGFR e cMET.

I grafici di legame della saturazione hanno mostrato che quando le concentrazioni di anticorpi radiomarcati erano troppo basse, la saturazione non era raggiunta, come indicato dalla curva lineare. Le concentrazioni di anticorpi radiomarcati troppo elevate hanno portato alla saturazione senza una crescita logaritmica distinta, come mostrato dal plateau orizzontale. Inoltre, è stato osservato un elevato legame non specifico a causa di alte concentrazioni di anticorpi radiomarcati.

Questa procedura può richiedere più tentativi per ottimizzare l'intervallo di concentrazione per ogni specifico anticorpo radiomarcato. Utilizza i dati dei risultati negativi per progettare esperimenti futuri. Una volta che l'affinità di legame è nota, può essere utilizzata come punto di riferimento per altri saggi in vitro come parte della caratterizzazione di un anticorpo radiomarcato.