Un metodo di compensazione dei tessuti per l'imaging neuronale dalle scale mesoscopiche a quelle microscopiche
10 maggio 2022
Il protocollo fornisce un metodo dettagliato di imaging neuronale nella fetta di cervello utilizzando un metodo di compensazione dei tessuti, ScaleSF. Il protocollo include la preparazione del tessuto cerebrale, la chiarificazione dei tessuti, la manipolazione di fette ripulite e l'imaging al microscopio a scansione laser confocale di strutture neuronali da mesoscopiche a livelli microscopici.
Il nostro protocollo faciliterebbe lo studio delle strutture neuronali dal circuito alle scale dei componenti, che è essenziale per una migliore comprensione delle funzioni cerebrali. La nostra tecnica di compensazione, ScaleSF, esercita una potente capacità di compensazione, nonché un alto livello di conservazione dei tessuti che è necessario per la visualizzazione simultanea di strutture su larga e piccola scala. Il nostro protocollo è particolarmente efficace nel cervello dove le cellule neuronali mostrano processi elaborati, collegamenti tremendi e organizzano strutture subcellulari fini specializzate.
Prima di iniziare l'esperimento, preparare le soluzioni Sca/eS come mostrato in questa tabella e coprire i campioni con un foglio. Iniziare la procedura aggiungendo otto millilitri ciascuno di soluzioni ScaleS0 e ScaleS4 a due pozzetti separati di una piastra di coltura cellulare a sei pozzi e preriscaldare la piastra a 37 gradi Celsius in un incubatore. Trasferire le fette di cervello nella soluzione ScaleS0 preriscaldata con una spatola e incubare le fette per due ore a 37 gradi Celsius in un incubatore vibrante a 90 RPM.
Quindi, trasferire le fette di cervello permeabilizzate in otto millilitri di PBS meno in una piastra di coltura cellulare a sei pozzetti e lavare per 15 minuti mantenendo uno shaker orbitale a 40-60 RPM. Ripetere questo passaggio due volte. Quindi, trasferire le fette di cervello in otto millilitri di soluzione ScaleS4 preriscaldata e incubare per otto-12 ore a 90 RPM a 37 gradi Celsius.
Per la preparazione della camera, stampa in 3D il telaio della camera e gli adattatori dello stadio del microscopio. Fissare il telaio della camera a una slitta di copertura utilizzando un adesivo sensibile alla pressione. Preparare l'1,5% di agarosio in soluzione ScaleS4D25(0).
Mescolare la soluzione e microonde fino a quando l'agarosio è completamente sciolto. Quindi lasciare raffreddare la soluzione a 37 gradi Celsius. Montare la fetta di cervello cancellata sul coperchio inferiore della camera di imaging con una spatola.
Rimuovere la soluzione in eccesso dalla fetta eliminata utilizzando un fazzoletto pulito. Aggiungere il gel ScaleS4 alla fetta di cervello utilizzando una micropipetta per riempire la camera di imaging. Posiziona un altro coperchio sopra con una pinza seguita da un pezzo di carta velina e un vetrino.
Trasferire la camera di imaging in un frigorifero a quattro gradi Celsius. Posizionare i pesi metallici sul vetrino e lasciarli per 30 minuti. Dopo l'incubazione, rimuovere il materiale dalla camera di imaging e rimuovere il gel in eccesso.
Posizionare la camera di imaging in una capsula di Petri di vetro da 60 millimetri e fissare il bordo della camera di imaging in più punti alla parabola con un adesivo sensibile alla pressione. Versare la soluzione ScaleS4 nel piatto e agitare delicatamente per un'ora a 40-60 RPM a 20-25 gradi Celsius. Sostituire con soluzione fresca e rimuovere le bolle d'aria sulla superficie del gel raschiando delicatamente la superficie utilizzando una punta di pipetta.
Montare la camera di imaging su uno stadio del microscopio. Preparare un microscopio a scansione laser confocale dotato di una lente obiettivo multi-immersione di 2,5 millimetri di distanza di lavoro, ingrandimento 16x e apertura numerica 0,60. Accendi tutte le apparecchiature di imaging pertinenti, come la workstation, il microscopio, lo scanner, i laser, la lampada al mercurio e avvia un software di imaging.
Impostare il collare di correzione dell'obiettivo multi-immersione su 1,47. Immergere l'obiettivo nella soluzione e lasciarlo avvicinare lentamente alla fetta. Rimuovere tutte le bolle d'aria intrappolate sulla punta della lente dell'obiettivo.
Trova le regioni di interesse nei tessuti eliminati usando l'epifluorescenza. Per impostare i parametri di acquisizione dell'immagine, in primo luogo, determinare la profondità di bit per l'acquisizione dell'immagine man mano che la dimensione dell'immagine aumenta con il bit. Quindi impostare la lunghezza d'onda di rilevamento in base allo spettro di emissione.
Impostare la risoluzione XY, la velocità di scansione e le dimensioni del foro stenopeico. Regolare anche la potenza del laser, il guadagno dell'amplificatore del rilevatore e l'offset fino a ottenere un'immagine adatta. Determinare la dimensione del titolo in base alle dimensioni del ROI, assicurando che l'intera lunghezza e larghezza del ROI vengano acquisite.
Naviga attraverso il tessuto in tutti i piani e imposta l'inizio e gli endpoint dello stack. Impostare la dimensione del gradino Z, in base alla risoluzione Z desiderata. Raccogli le immagini ed elaborale utilizzando un software di analisi delle immagini.
Utilizzando questo protocollo, è stata ottenuta la compensazione ottica di una fetta di cervello di topo di un millimetro di spessore. L'espressione di EGFP nella corteccia cerebrale dei topi PV-FGL ha mostrato che la fluorescenza e l'integrità strutturale dei tessuti sono state preservate. Le aberrazioni indotte dalla mancata corrispondenza dell'indice di rifrazione hanno causato una notevole perdita di luminosità dell'immagine e risoluzione dei neuroni positivi EGFP.
Questi neuroni sono stati chiaramente visualizzati con il microscopio a scansione laser confocale quando il collare di correzione è stato regolato per adattarsi a questa soluzione ScaleS4. La ricostruzione 3D dei neuroni marcati EGFP nella corteccia somatosensoriale primaria del topo è stata eseguita in una fetta di cervello spessa un millimetro. Singoli pergole dendritiche decorate con spine dendritiche sono state viste a un ingrandimento più elevato.
Anche l'arborizzazione terminale degli assoni e i bouton assonali sono stati osservati nelle fette. La corrispondenza dell'indice riflettente tra il fluido di imaging e la lente dell'oggetto è fondamentale per l'imaging 3D nei tessuti disboscati. La nostra tecnica faciliterebbe l'integrazione della struttura dei neuroni dal circuito alle scale dei componenti, fornendo approfondimenti sui meccanismi neuronali, informazioni sull'elaborazione nel cervello.
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Panoramica
Questo studio presenta un protocollo dettagliato per l'imaging neuronale in sezioni cerebrali mediante un nuovo metodo di chiarificazione tissutale chiamato ScaleSF. La tecnica consente una visualizzazione ad alta risoluzione delle strutture neuronali, facilitando indagini che vanno dalla scala dei circuiti a quella dei componenti, fondamentali per comprendere il funzionamento del cervello.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Tecniche di imaging
Sfondo
- Le cellule neuronali presentano processi complessi e strutture specializzate.
- Le tecniche di chiarificazione dei tessuti migliorano le capacità di imaging nelle neuroscienze.
- ScaleSF fornisce una chiarificazione efficace senza compromettere l'integrità del tessuto.
- Metodi di imaging dettagliati sono essenziali per chiarire i meccanismi neuronali.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo affidabile per l'acquisizione di immagini di strutture neuronali in sezioni cerebrali.
- Utilizzare la tecnica ScaleSF per la visualizzazione simultanea di diverse scale neuronali.
- Migliorare la comprensione dei meccanismi neuronali e dell'elaborazione delle informazioni nel cervello.
Metodi Utilizzati
- Per gli studi di imaging sono stati utilizzati fetti cerebrali es vivo.
- Il modello biologico comprendeva tessuto cerebrale di topo, in particolare topi PV-FGL.
- Non sono stati menzionati flussi di lavoro multi-omici.
- I passaggi chiave includevano la preparazione delle soluzioni, l'incubazione e l'allestimento della microscopia confocale.
- La ricostruzione tridimensionale delle strutture neuronali è stata eseguita mediante microscopia a scansione laser confocale.
Risultati principali
- Il metodo ScaleSF ha preservato la fluorescenza e l'integrità strutturale dei tessuti cerebrali.
- La chiara visualizzazione dei neuroni positivi per EGFP ha permesso un'analisi dettagliata delle strutture dendritiche e assonali.
- I risultati sottolineano l'importanza dell'abbinamento dell'indice di rifrazione per un'efficace acquisizione di immagini.
- L'acquisizione di immagini in 3D ha catturato con successo la complessità delle morfologie neuronali.
Conclusioni
- Questo studio dimostra l'efficacia di ScaleSF nell'immagine neuronale.
- Tecniche di imaging migliorate permetteranno una migliore comprensione dei circuiti e dei meccanismi neuronali.
- Il protocollo apre nuove strade per l'esplorazione dettagliata dei processi neuronali in condizioni fisiologiche e patologiche.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'imaging neuronale ad alta risoluzione su scale che vanno da mesoscopiche a microscopiche è fondamentale per la validazione degli obiettivi e la riduzione del rischio meccanicistico nella scoperta di farmaci per il sistema nervoso centrale. Il protocollo di chiarificazione tissutale ScaleSF consente una visualizzazione robusta dei circuiti neuronali e delle strutture subcellulari, sostenendo la fiducia predittiva nei processi di scoperta precoce e nelle neuroscienze traslazionali. Questa capacità migliora il processo decisionale sul portafoglio fornendo approfondite informazioni strutturali essenziali per la ricerca e sviluppo basata su ipotesi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi della connettività neuronale e dell'architettura dei circuiti per la validazione degli obiettivi.
- Supporta la riduzione del rischio meccanicistica preservando le fini caratteristiche subcellulari durante l'acquisizione delle immagini.
- Facilita la previsione affidabile nella selezione degli obiettivi del sistema nervoso centrale attraverso una mappatura strutturale completa.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara sezioni cerebrali trasparentizzate e strutturalmente integre per saggi di imaging quantitativo.
- Standardizza le condizioni di imaging per garantire riproducibilità e confrontabilità tra esperimenti.
- Fornisce output di imaging ad alto contenuto e scalabili, adatti per flussi di lavoro di screening successivi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea le immagini strutturali a modelli neuronali rilevanti per la malattia, garantendo continuità traslazionale.
- Permette la ricostruzione tridimensionale delle morfologie neuronali per informare la validazione preclinica.
- Supporta un avanzamento adeguato ai rischi fornendo un contesto anatomico dettagliato per gli studi sui biomarcatori.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo di chiarificazione e imaging dei tessuti si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione iniziale del bersaglio fino alla ricerca preclinica nei portafogli di neuroscienze.
- Biologia della scoperta: Fornisce una visualizzazione ad alta risoluzione per la verifica di ipotesi e la chiarificazione di percorsi nei circuiti neurali.
- Screening: Offre output di imaging riproducibili e quantitativi per lo sviluppo di saggi e la valutazione di composti.
- Analisi: Permette l'acquisizione e l'analisi tridimensionale di strutture neuronali per un confronto robusto dei dati.
- Ricerca traslazionale: Collega la fase di scoperta a quella preclinica supportando studi strutturali rilevanti per le malattie.
- Riutilizzo aziendale: Offre un protocollo standardizzato e riutilizzabile per diverse applicazioni di imaging del sistema nervoso centrale.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella ricerca sul sistema nervoso centrale.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la scalabilità dei flussi di lavoro per l'imaging neuronale.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione e l'efficienza del capitale fornendo dati strutturali dettagliati in una fase precoce del processo.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e la progressione di programmi per il sistema nervoso centrale con adeguamento del rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nel chiarimento tissutale, nella microscopia confocale e nell'analisi delle immagini.
- Richiede l'accesso a obiettivi a immersione multipla e camere di imaging compatibili.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per i parametri di acquisizione e la preparazione dei campioni.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per diversi tipi di tessuto o modelli di malattia.
- Un preciso abbinamento dell'indice di rifrazione è fondamentale per ottenere una qualità ottimale delle immagini.
