Consegna mediata lentivirale di shRNA a hESC e NPC utilizzando polietilenimina polimerica cationica a basso costo (PEI)

La trasfezione delle cellule HEK293T deve essere eseguita al 90% di confluenza. Inoltre, l'uso di un filtro legante a basso contenuto proteico da 0,45 micron per la filtrazione vettoriale lentivirale e l'uso di un cuscino di saccarosio per l'ultracentrifugazione sono essenziali. Inizia coltivando cellule HEK293T in mezzo DMEM contenente il 10% di FBS e 1X di penicillina streptomicina a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato con un'atmosfera di 5% di anidride carbonica e 21% di ossigeno fino a quando le cellule raggiungono il 90% di confluenza prima di seminare per la trasfezione.

Semina quattro volte 10 alle sei cellule in 10 millilitri di terreno di coltura completo in una piastra di coltura tissutale da 100 millimetri e cresci durante la notte in un incubatore di colture tissutali umidificate con un'atmosfera di 5% di anidride carbonica e 21% di ossigeno. Per ogni trasfezione, diluire un milligrammo per millilitro di scorte di DNA plasmidico in un millilitro di mezzi DMEM privi di siero in tubi di centrifuga da 1,5 millilitri seguendo il rapporto tra plasmidi di ingresso e imballaggio come descritto nel manoscritto di testo. Ruotare il tubo per 10 secondi e ruotare a 10.000 volte G per 30 secondi a temperatura ambiente per raccogliere.

Quindi, aggiungere 70 microlitri di un milligrammo per millilitro di soluzione madre di polimero polietileneimina, o PEI, al tubo. Ancora una volta, vortice e girare brevemente il tubo. Per la transezione a base di lipofetamina, diluire i vettori in 500 microlitri di mezzi DMEM privi di siero contenenti 45 microlitri di reagente P forniti nel kit.

Quindi, diluire 70 microlitri di reagente L utilizzando 500 microlitri dello stesso mezzo. Incubare entrambi i tubi a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi, combinare il contenuto di entrambi i tubi e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti per consentire la formazione di complessi.

Quindi, aggiungere un millilitro di DNA PEI o dna lipofectamine complessi alla piastra contenente cellule e incubare per sei ore a 37 gradi Celsius con un'atmosfera di 5% di anidride carbonica e 21% di ossigeno. Dopo l'incubazione, sostituire il mezzo con 10 millilitri di terreno di crescita fresco completo e restituire la piastra all'incubatore. Dopo due giorni di trasfezione, raccogliere i mezzi contenenti virus e sovrapporre le cellule con 10 millilitri di mezzi di crescita freschi e completi.

Ancora una volta, dopo tre giorni di trasfezione, raccogliere i media contenenti virus e combinarli con i media raccolti al punto temporale di due giorni. Centrifugare il surnatante virale a 2.000 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius per pellettizzare i detriti cellulari. Filtrare il surnatante utilizzando un filtro a bassa legatura proteica da 0,45 micron e conservare a quattro gradi Celsius fino a quando non è pronto per l'ultracentrifugazione.

Sterilizzare le coppette dei tubi ultracentrifuga lavando con etanolo al 70% per 10 minuti. Asciugare all'aria, chiudere e posizionare le tazze a quattro gradi Celsius. Aggiungere 36 millilitri a mezzi filtrati contenenti particelle lentivirali a un tubo ultracentrifugale sterile.

Riempire cinque millilitri di una stripette sterile con quattro millilitri di soluzione sterile al 20% di saccarosio preparata in PBS e dispensarla sul fondo del tubo contenente vettori lentivirali o LVS. Assicurarsi che la soluzione di saccarosio non debba essere miscelata con il fluido e faccia un gradiente nella parte inferiore del tubo. Bilanciare tutti i tubi ultracentrifuga utilizzando supporti DMEM privi di siero, posizionare i tubi in tazze fredde ultracentrifuga e chiudere i coperchi.

Ruotare i tubi a 125.000 volte G per due ore a quattro gradi Celsius. Dopo la rotazione, scartare con cura il surnatante invertendo il contenuto del tubo in un contenitore contenente candeggina senza disturbare il pellet. Contrassegnare il pellet se visibile.

Posizionare il tubo ultracentrifuga in un tubo sterile da 50 millilitri e aggiungere 200 microlitri di DPBS sterile nella parte superiore del pellet. Posizionare il tubo a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno seguente, mescolare delicatamente il contenuto di un tubo tubando su e giù prima di girare a 13.000 volte G in una centrifuga da tavolo per pellettizzare eventuali detriti.

Trasferire il surnatante in un nuovo tubo e aliquotare la preparazione del virus. Infine, conservare i tubi a meno 80 gradi Celsius. Dopo la trasfezione, è stata osservata un'abbondante espressione di GFP nelle cellule HEK293T.

L'espressione di proteine virali ha portato alla formazione di sincizia delle cellule HEK293T in cui sono fuse singole cellule. Dopo l'infezione, è stata osservata una marcata espressione di GFP anche nelle cellule progenitrici neurali infettate da virus. La misurazione del titolo LVS tra il pei a basso costo e il reagente lipofectamine 3000 non ha mostrato alcuna differenza significativa nel titolo virale.

I titoli virali per i vettori basati su PLK 0.1 sono mostrati qui. Le cellule trasfettate lentivirali hanno mostrato una vitalità cellulare superiore all'80% rispetto alle cellule non trasdotte, mentre nessuna cellula è sopravvissuta al trattamento. L'analisi Western blot ha mostrato un'abbondante espressione di L-2-idrossiglutarato deidrogenasi in cellule trasdotte con una spina dorsale vettoriale vuota.

Tuttavia, non è stata osservata alcuna espressione nelle cellule trasdotte con un vettore che trasporta RNA a forcina corta. Il vantaggio principale di questa tecnica è l'uso di polimero cationico a basso costo polietileneimmina per produrre particelle lentivirali co-trasfezionando celle HEK293T utilizzando vettori di ingresso e confezionamento.