Name: Un approccio fotodinamico per studiare la funzione della rottura della vescicola intracellulare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 16 s
Description: Scopri la tecnica CALI per studiare la rottura delle vescicole intracellulari nelle cellule HeLa. Questo metodo fotodinamico permette un controllo spaziotemporale preciso del danno subcellulare.

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Gli autori desiderano ringraziare l'Academia Sinica Inflammation Core Facility, IBMS per il supporto alla ricerca. La struttura principale è finanziata dall'Academia Sinica Core Facility and Innovative Instrument Project (AS-CFII-111-213). Gli autori ringraziano la Common Equipment Core Facility dell'Istituto di Scienze Biomediche (IBMS), Academia Sinica (AS) per aver assistito l'acquisizione delle immagini.

1. Preparazione delle scorte AlPcS2a
<ol><li>Sciogliere 10 mg di AlPcS2a in 400 μL di 0,1 M NaOH. Per migliorare la solubilità, riscaldare la soluzione a 50 °C e vortice.</li>
	<li>Mescolare la soluzione con 4 ml di soluzione salina tamponata fosfato (PBS). Quindi, filtrare la soluzione con un filtro da 0,22 μm per rimuovere i precipitati insolubili.</li>
	<li>Misurare la concentrazione della soluzione attraverso uno spettrofotometro UV-Vis. Il coefficiente di estinzione di AlPcS2a a 672 nm è 4 x 104 cm-1 M-1. Diluire la soluzione AlPcS2a con PBS per ottenere una soluzione da 1 mM. Preparare 1 mL di aliquote e conservare a -20 °C.</li>
</ol>2. Trasfezione
NOTA: Gal3-GFP viene applicato come indicatore per l'imaging delle cellule vive della rottura lisosomiale.
<ol><li>Mantenere la coltura cellulare HeLa in DMEM integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS). Dopo aver lavato le cellule con PBS, tripsinizzare le cellule, quindi risospendere le cellule in DMEM integrato con FBS al 10%. NOTA: il metodo è applicabile alla maggior parte delle linee cellulari collegate, comprese le linee cellulari HeLa e A549. In linea di principio, nonostante non si verifichino le celle in sospensione, i test CALI potrebbero essere eseguiti con esse.</li>
	<li>Diluire 300 ng di plasmide Gal3-GFP in 25 μL di mezzo sierico ridotto, quindi aggiungere 0,6 μL di reagente P3000. Mescolare delicatamente. Diluire 0,45 μL di reagente Lipofectamine 3000 in 25 μL di terreno sierico ridotto. Mescolare delicatamente.</li>
	<li>Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. Mescolare DNA diluito e Lipofectamine 3000 diluito, quindi incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Mescolare la miscela DNA-Lipofectamina, 3 x 105 cellule HeLa sospese e 200 μL di DMEM + 10% FBS, quindi seminare le cellule sulla regione centrale del vetro di un pulsante di vetro da 35 mm.</li>
</ol>3. Colorazione AlPcS2a
<ol><li>Per consentire l'attacco della cella, incubare le cellule a 37 °C nell'incubatore alimentato con il 5% di CO2 per almeno 4 ore.</li>
	<li>Diluire AlPcS2a in DMEM integrato con FBS al 10% per ottenere una soluzione di AlPcS2a da 1 μM. Preriscaldare il mezzo contenente AlPcS2a a bagnomaria a 37 °C. Sostituire il terreno di coltura con il terreno contenente AlPcS2a.</li>
	<li>Incubare le cellule a 37 °C nell'incubatore alimentato con il 5% di CO2 durante la notte (16-18 h).</li>
	<li>Il giorno seguente, lavare le cellule due volte con PBS per rimuovere AlPcS2a extracellulare. Sostituire il terreno con terreno fresco, quindi incubare a 37 °C per 4 ore per consentire al colorante residuo lungo la via endocitica di accumularsi nei lisosomi. NOTA: Per colorare gli endosomi, incubare le cellule in 1 μM AlPcS2a in DMEM contenente il 10% di FBS per 15 minuti a 37 °C. Quindi, lavare le cellule due volte con PBS e incubarle in un mezzo preriscaldato prima dell'imaging .</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63962/63962fig01.jpg"> Figura 1. Una figura schematica che rappresenta il danno IV selettivo con AlPcS2a. La figura mostra gli schemi del danno IV selettivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63962/63962fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63962/63962fig02.jpg"> Figura 2. Colorazione lisosomiale con AlPcS2a. I lisosomi marcati durante la notte con 1 μM AlPcS2a nelle cellule HeLa sono colorati positivamente con colorante fluorescente verde 50 nM. Barra scala: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63962/63962fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
4. Imaging del campione e illuminazione della luce
NOTA: È possibile eseguire danni IV all'interno di una regione subcellulare di una singola cellula o di tutte le cellule marcate con AlPcS2a in un piatto di coltura. L'illuminazione di massa dell'intero piatto di coltura consente lo studio quantitativo di questo danno, compresi gli studi biochimici.
<ol><li>Manipolare singole cellule danneggiando i lisosomi all'interno di una singola cellula, come descritto di seguito.<ol><li>Posiziona il piatto di cultura sul palcoscenico di un microscopio confocale. Utilizzare i laser a 488 nm e 561 nm per emozionare GFP e AlPcS2a, rispettivamente.</li>
		<li>Cerchiare una regione di interesse (ROI) 5 x 5 μm2 sulle vescicole marcate AlPcS2a selezionate per essere danneggiate.</li>
		<li>Pulse illumina il ROI con un laser a 633 nm da 0,21 mW per 70 ripetizioni. Monitorare la formazione di Gal3 puncta come indicatore di permeabilizzazione della membrana lisosomiale.</li>
	</ol></li>
	<li>Danneggiare tutte le cellule etichettate in un piatto di coltura come descritto di seguito.<ol><li>Posiziona il piatto di cultura su una piattaforma. Illuminare il piatto con 660 nm di luce LED collimata (la luce nel vicino infrarosso è la base ideale sullo spettro di eccitazione di AlPcS2a).</li>
		<li>Posizionare il piatto di coltura sul microscopio e monitorare gli indicatori di permeabilizzazione della membrana come indicato al punto 4.1.3.</li>
	</ol></li>
	<li>Valutare le lesioni delle flebo utilizzando i seguenti indicatori.<ol><li>Il contenuto dell'endosoma o del lisosoma è più altamente glicosilato, che sono esposti al citosol dopo la rottura IV. Etichettarli rapidamente usando galectine leganti i glicani citosolici, tra cui galectina-1, galectina-3, galectina-8 e galectina-916,20.</li>
		<li>La dimensione della ferita può essere determinata dal rilascio di colorante impermeabile alla membrana come descritto in21.</li>
		<li>La differenza tra endosomi e lisosomi è il loro valore di pH luminale. La rottura lisosomiale perturba il pH luminale, che può essere misurato utilizzando coloranti sensibili al pH, come il FITC-destrano3.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63962/63962fig03.jpg"> Figura 3. Il CALI mediato da AlPcS2a induce il reclutamento locale di TagRFP-galectina-3 (Gal3) nei lisosomi all'interno della regione di illuminazione. I lisosomi nelle cellule HeLa espresse da TagRFP-galectina-3 sono stati colorati durante la notte con 1 μM AlPcS2a, seguiti dall'illuminazione focalizzata con luce nel vicino infrarosso (633 nm) all'interno del quadrato giallo. Il segnale AlPcS2a all'interno del quadrato giallo viene fotosbiancato, accompagnato dalla formazione di TagRFP-galectina-3 puncta. Barra scala: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63962/63962fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

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<li>Daussy, C. F., Wodrich, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((34%3BRepair+me+if+you+can%26%2334%3B%3A+membrane+damage%2C+response%2C+and+control+from+the+viral+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">34;Repair me if you can&#34;: membrane damage, response, and control from the viral perspective.</a> Cells. 9 (9), 2042(2020).</li>
<li>Hung, Y. H., Chen, L. M., Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporally+controlled+induction+of+autophagy-mediated+lysosome+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporally controlled induction of autophagy-mediated lysosome turnover.</a> Nature Communications. 4, 2111(2013).</li>
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<li>Daugelaviciene, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosome-targeted+photodynamic+treatment+induces+primary+keratinocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Photochemistry+and+Photobiology.+B%2C+Biology%22%5BJournal%5D)">Lysosome-targeted photodynamic treatment induces primary keratinocyte differentiation.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology. B, Biology. 218, 112183(2021).</li>
<li>Hong, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+galectins+control+cellular+responses+commensurate+with+cell+surface+carbohydrate+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Intracellular galectins control cellular responses commensurate with cell surface carbohydrate composition.</a> Glycobiology. 30 (1), 49-57 (2019).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

AlPcS2a si lega alla membrana plasmatica, quindi viene internalizzato dall'endocitosi e alla fine si accumula nei lisosomi. AlPcS2a può quindi essere localizzato nei compartimenti subcellulari regolando la durata dell'incubazione. Una limitazione di questa metodologia è che solo una sottopopolazione di IV potrebbe essere marcata da AlPcS2a attraverso l'endocitosi perché ci sono molte altre fonti di membrana di IV, come l'apparato ER e di Golgi. Inoltre, la marcatura selettiva di AlPcS<sub...

Gli endosomi, un tipo di vescicola intracellulare (IV), sono formati dall'endocitosi e poi maturano in lisosomi. Varie vie di segnale intracellulare sono coinvolte nella formazione delle flebo; inoltre, diversi stimoli intrinseci ed estrinseci possono danneggiare le flebo (ad esempio, i patogeni possono sfuggire dalla membrana limitata durante l'infezione ed entrare nel citoplasma1). Questo di solito è accompagnato dalla rottura delle vescicole endocitotiche2. Pertanto, le tecniche per colpire e danneggiare le flebo possono essere utilizzate in studi correlati3.
La terapia fotodinamica (PDT) è una terapia dipendente dalla luce per combattere le malattie uccidendo tumori o agenti patogeni4. Nella PDT, le cellule bersaglio sono marcate con cromofori non tossici, chiamati fotosensibilizzatori, che possono essere attivati localmente dall'illuminazione della luce 5,6. I fotosensibilizzatori assorbono energia dalla luce e si trasformano in uno stato di singoletto eccitato, portando allo stato di tripletta eccitata di lunga durata. I fotosensibilizzatori dello stato di tripletto possono subire un trasferimento di elettroni o energia e formare specie reattive dell'ossigeno (ROS) in presenza di ossigeno e possono distruggere spazialmente le cellule marcate all'interno della regione di illuminazione7. La conseguenza varia a seconda della potenza della luce8. Controllando la concentrazione di fotosensibilizzatori e l'intensità dell'illuminazione della luce, le biomolecole mirate possono essere inattivate selettivamente senza lisi cellulare, definita come inattivazione della luce assistita da cromofori (CALI)9. Con il significativo sviluppo di fotosensibilizzatori in grado di marcare selettivamente vari bersagli subcellulari, CALI è diventato uno strumento prezioso per controllare l'inattivazione mediata dalla luce di biomolecole per piccole biomolecole come nucleotidi e proteine, nonché organelli come mitocondri ed endolisosomi 3,10,11,12,13.
Rispetto al CALI, vengono utilizzati anche metodi chimici o fisici per compromettere le membrane, come la tossina batterica 14,15 e il trattamento Leu-Leu-OMe16 per il danno lisosomiale. Tuttavia, questi metodi mostrano una compromissione di massa delle flebo all'interno delle cellule. Fotosensibilizzanti robusti (cioè acido disolfonico cloruro di ftalocianina Al(III) (AlPcS2a)) sono utilizzati in CALI; AlPcS2a, che colpisce i lisosomi attraverso l'endocitosi, viene utilizzato per rompere endosomi o lisosomi in una regione controllata17. AlPcS2a è un cromoforo a base di ftalocianina impermeabile alla membrana cellulare che si lega ai lipidi sulla membrana plasmatica e viene internalizzato attraverso l'endocitosi e alla fine si accumula all'interno del lisosoma attraverso la via endocitica18. Assorbe la luce all'interno di una regione spettrale del vicino infrarosso e genera ossigeno singoletto, un importante ROS generato da AlPcS2a18 eccitato. Il decadimento dell'ossigeno singoletto limita rapidamente la sua diffusione e distanza di reazione all'interno di una piccola regione nelle cellule (circa 10-20 nm)19. Regolando la durata dell'incubazione di AlPcS2a e l'illuminazione della luce, è consentito il controllo spaziotemporale del danno delle flebo all'interno di un'area subcellulare. CALI diventa quindi un potente strumento per esaminare le conseguenze del danno IV e la formazione e la regolazione delle IV.
In questo studio, viene affrontato un protocollo specifico di CALI che utilizza AlPcS2a come fotosensibilizzatore. Questo protocollo può essere applicato a vari tipi di flebo, inclusi endosomi e lisosomi, e utilizzato per esaminare le risposte di follow-up dopo la rottura della membrana. Le cellule HeLa che esprimono galectina-3 coniugata con fluorofori 16,20 rivelate dopo la rottura del lisosoma sono utilizzate per dimostrare questo protocollo.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagente</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Al(III) Cloruro di ftalocianina Acido disolfonico (AlPcS2a)</td><td>Frontier Scientific</td><td>P40632</td><td></td></tr><tr><td>Piatto di coltura</td><td>ibidi</td><td>812128-200</td><td></td></tr><tr><td>Terreno</td><td></td><td></td> di coltura <td>DMEM integrato con il 10% di FBS e 100 U/mL di penicillina G e 100 mg/mL di streptomicina</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A4736301</td><td></td></tr><tr><td>Gal3-GFP plasmide</td><td>addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000008</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker verde DND-26</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L7526</td><td>colorante fluorescente verde</td></tr><tr><td>Piastra alveolare multiparete</td><td>perkinelmer</td><td>PK-6005550</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q15895</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific 31985070</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Gibco</td><td>21600-069</td><td>137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4</td></tr><tr><td>Linea cellulare</forte> </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Linea cellulare HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td>I metodi sono applicabili alla maggior parte delle linee cellulari collegate. Le condizioni devono essere determinate individualmente.</td></tr><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 &micro; m Filtro</td><td>Merck</td><td>SLGV013SL</td><td></td></tr><tr><td>Luce LED collimata&nbsp; (660 nm)</td>La luce a infrarossi <td>Thorlabs</td><td>M660L3-C1 e DC2100</td><td>è la base ideale per lo spettro di eccitazione di AlPcS2a.</td></tr><tr><td>Microscopia confocale</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 780</td><td>Per l'imaging a lungo termine è necessario un sistema di incubazione.</td></tr><tr><td>Spettrofotometri NanoDrop 2000/2000c</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luce LED rossa</td><td>Tholabs</td><td>M660L4-C1</td><td></td></tr></tbody></table>

un approccio fotodinamico per studiare la funzione della rottura della vescicola intracellulare

A Photodynamic Approach to Study Function of Intracellular Vesicle Rupture

Le vescicole intracellulari (IV) si formano attraverso l'endocitosi delle vescicole nel citoplasma. La formazione IV è coinvolta nell'attivazione di varie vie di segnale attraverso la permeabilizzazione delle membrane IV e la formazione di endosomi e lisosomi. Un metodo chiamato inattivazione laser assistita da cromoforo (CALI) viene applicato per studiare la formazione di IV e i materiali nel controllo della regolazione IV. CALI è una metodologia fotodinamica basata sull'imaging per studiare la via di segnalazione indotta dalla permeabilizzazione della membrana. Il metodo consente la manipolazione spaziotemporale dell'organello selezionato da permeabilizzare in una cellula. Il metodo CALI è stato applicato per osservare e monitorare molecole specifiche attraverso la permeabilizzazione di endosomi e lisosomi. La rottura della membrana delle flebo è nota per reclutare selettivamente proteine leganti i glicani, come la galectina-3. Qui, il protocollo descrive l'induzione della rottura IV da parte di AlPcS2a e l'uso della galectina-3 come marcatore per marcare i lisosomi alterati, che è utile nello studio degli effetti a valle della rottura della membrana IV e dei loro effetti a valle in varie situazioni.

È stata mostrata una figura schematica che rappresenta il danno IV indotto da AlPcS2a, inclusi endosoma e lisosoma (Figura 1).
I marcatori disponibili in commercio possono essere utilizzati per determinare le condizioni di colorazione di AlPcS2a . Ad esempio, AlPcS2a puncta e colorante fluorescente verde22 colocalizzazione (Figura 2).
La galectina-3 m...

L'inattivazione laser assistita da cromoforo mediata da AlPcS2a (CALI) è un potente strumento per studiare il danno spaziotemporale delle vescicole intracellulari (IV) nelle cellule vive.

Un approccio fotodinamico per studiare la funzione della rottura della vescicola intracellulare

Intracellular vesicles (IVs) are formed through endocytosis of vesicles into cytoplasm. IV formation is involved in activating various signal pathways ...

L'endocitosi della vescicola nella citoplasia provoca la formazione di vescicole intracellulari. La permeabilizzazione della vescicola attiva varie vie del segnale. L'inattivazione laser assistita da cromofori viene utilizzata per studiare le conseguenze della rottura della vescicola intracellulare.Un controllo spaziale e temporale del danno subcellulare alle vescicole intracellulari può essere ottenuto regolando le condizioni erette e l'illuminazione della luce. Per iniziare, mantenere la coltura cellulare HeLa in DMEM integrata con 10% FBS. Dopo aver lavato le cellule con PBS, tripsinizzare le cellule.Quindi risospendere le cellule in DMEM integrate con 10% FBS. Diluire 300 nanogrammi di plasmide Gal3-GFP in 25 microlitri di terreno sierico ridotto. Quindi aggiungere 0,6 microlitri di reagente P3000.E mescolare delicatamente, seguito da vortice la soluzione. Diluire 0,45 microlitri di reagente Lipofectamine 3000 in 25 microlitri di mezzo sierico ridotto e mescolare delicatamente. Incubare per cinque minuti a temperatura ambiente.Quindi mescolare DNA diluito e Lipofectamine 3000 diluito e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver miscelato la miscela di DNA lipofectamina, 300.000 cellule HeLa sospese e 200 microlitri di DMEM con il 10% di FBS, seminare le cellule sulla regione centrale del vetro di un piatto di vetro da 35 millimetri. Per consentire l'attaccamento delle cellule, incubare le cellule a 37 gradi Celsius nell'incubatore fornito con il 5% di anidride carbonica per almeno quattro ore.Diluire AlPcS2a in DMEM integrato con 10% FBS per ottenere una soluzione di AlPcS2a monomolare. Preriscaldare il mezzo contenente AlPcS2a a bagnomaria a 37 gradi Celsius e sostituire il terreno di coltura con il terreno contenente AlPcS2a. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius nell'incubatore fornito con il 5% di anidride carbonica durante la notte.Il giorno seguente, lavare le cellule due volte con PBS per rimuovere AlPcS2a extracellulare dopo aver sostituito il mezzo con terreno fresco. Incubare a 37 gradi Celsius per quattro ore per consentire al colorante residuo lungo la via endocitica di accumularsi nei lisosomi. Per manipolare le singole cellule danneggiando i lisosomi, posizionare il piatto di coltura sul palcoscenico di un microscopio confocale.Utilizzare i laser a 488 nanometri e 561 nanometri per emozionare GFP e AlPcS2a, rispettivamente. Cerchia una regione quadrata di cinque per cinque micrometri di interesse sulle vescicole etichettate AlPcS2a che sono selezionate per essere danneggiate. Quindi l'impulso illumina la regione di interesse con un laser a 633 nanometri da 0,21 milliwatt o 70 ripetizioni.Monitorare la formazione di Gal3 puncta come indicatore di permeabilizzazione della membrana lisosomiale. La colorazione lisosomiale con AlPcS2a nelle cellule HeLa è stata eseguita utilizzando marcatori disponibili in commercio ed è stata colorata positivamente con colorante fluorescente verde. I lisosomi nelle cellule HeLa espresse da TagRFP-Galectin3 sono stati colorati con AlPcS2a.Seguita dalla focalizzazione dell'illuminazione con luce nel vicino infrarosso, i risultati indicano che l'inattivazione laser assistita da cromofori basata su AlPcS2a è stata in grado di controllare la rottura lisosomiale locale all'interno della regione di interesse, lasciando intatto il resto dei lisosomi. Questo passaggio è importante perché il tempo di incubazione determinerà gli endosomi o i lisosomi in piedi. Ad esempio, le persone possono determinare la dimensione di dal rilascio di colorante impermeabile alla membrana.Inoltre può utilizzare coloranti sensibili al pH come il destrano FITC per differenziare endosomi e lisosomi. Questa tecnica è utile per iniziare gli effetti a valle della rottura della membrana della vescicola intracellulare. E ci sono effetti a valle in varie situazioni.

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Segnaliamo i metodi per la caratterizzazione della rottura della membrana plasmatica MLKL-mediata in necroptosis compreso formazione immagine convenzionale e confocale microscopia di cellule vive, microscopia elettronica, e associazione basata su NMR del lipido.

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Il test di perdita di fluorescenza è un metodo semplice che consente di studio delle interazioni peptidi/membrana al fine di comprendere il loro coinvolgimento in diversi processi biologici e in particolare la capacità dei peptidi penetranti nelle cellule di disturbare i doppio strati dei fosfolipidi durante un processo di traslocazione cellulare diretta.

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Il metodo di puntura termoplasmonica integra microscopia confocale, pinzette ottiche e nanoparticelle d'oro per studiare le risposte proteiche durante la riparazione della membrana plasmatica nelle cellule e nelle vescicole unilamellari giganti. La tecnica consente una puntura di membrana rapida e localizzata, consentendo l'identificazione di proteine chiave e dei loro ruoli funzionali nell'intricato meccanismo di riparazione della membrana plasmatica.

Un approccio termoplasmonico per lo studio della riparazione della membrana plasmatica in cellule viventi e membrane modello

Questo protocollo descrive un metodo di imaging su cellule vive per monitorare la permeabilizzazione della membrana lisosomiale durante la necroptosi, utilizzando sonde fluorescenti che rilevano cambiamenti nell'integrità e nell'acidificazione della membrana lisosomiale.

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Scopri la tecnica CALI per studiare la rottura delle vescicole intracellulari nelle cellule HeLa. Questo metodo fotodinamico permette un controllo spaziotemporale preciso del danno subcellulare.

Un approccio fotodinamico per studiare la funzione della rottura della vescicola intracellulare

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