Un approccio fotodinamico per studiare la funzione della rottura della vescicola intracellulare
17 marzo 2023
L'inattivazione laser assistita da cromoforo mediata da AlPcS2a (CALI) è un potente strumento per studiare il danno spaziotemporale delle vescicole intracellulari (IV) nelle cellule vive.
L'endocitosi della vescicola nella citoplasia provoca la formazione di vescicole intracellulari. La permeabilizzazione della vescicola attiva varie vie del segnale. L'inattivazione laser assistita da cromofori viene utilizzata per studiare le conseguenze della rottura della vescicola intracellulare.
Un controllo spaziale e temporale del danno subcellulare alle vescicole intracellulari può essere ottenuto regolando le condizioni erette e l'illuminazione della luce. Per iniziare, mantenere la coltura cellulare HeLa in DMEM integrata con 10% FBS. Dopo aver lavato le cellule con PBS, tripsinizzare le cellule.
Quindi risospendere le cellule in DMEM integrate con 10% FBS. Diluire 300 nanogrammi di plasmide Gal3-GFP in 25 microlitri di terreno sierico ridotto. Quindi aggiungere 0,6 microlitri di reagente P3000.
E mescolare delicatamente, seguito da vortice la soluzione. Diluire 0,45 microlitri di reagente Lipofectamine 3000 in 25 microlitri di mezzo sierico ridotto e mescolare delicatamente. Incubare per cinque minuti a temperatura ambiente.
Quindi mescolare DNA diluito e Lipofectamine 3000 diluito e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver miscelato la miscela di DNA lipofectamina, 300.000 cellule HeLa sospese e 200 microlitri di DMEM con il 10% di FBS, seminare le cellule sulla regione centrale del vetro di un piatto di vetro da 35 millimetri. Per consentire l'attaccamento delle cellule, incubare le cellule a 37 gradi Celsius nell'incubatore fornito con il 5% di anidride carbonica per almeno quattro ore.
Diluire AlPcS2a in DMEM integrato con 10% FBS per ottenere una soluzione di AlPcS2a monomolare. Preriscaldare il mezzo contenente AlPcS2a a bagnomaria a 37 gradi Celsius e sostituire il terreno di coltura con il terreno contenente AlPcS2a. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius nell'incubatore fornito con il 5% di anidride carbonica durante la notte.
Il giorno seguente, lavare le cellule due volte con PBS per rimuovere AlPcS2a extracellulare dopo aver sostituito il mezzo con terreno fresco. Incubare a 37 gradi Celsius per quattro ore per consentire al colorante residuo lungo la via endocitica di accumularsi nei lisosomi. Per manipolare le singole cellule danneggiando i lisosomi, posizionare il piatto di coltura sul palcoscenico di un microscopio confocale.
Utilizzare i laser a 488 nanometri e 561 nanometri per emozionare GFP e AlPcS2a, rispettivamente. Cerchia una regione quadrata di cinque per cinque micrometri di interesse sulle vescicole etichettate AlPcS2a che sono selezionate per essere danneggiate. Quindi l'impulso illumina la regione di interesse con un laser a 633 nanometri da 0,21 milliwatt o 70 ripetizioni.
Monitorare la formazione di Gal3 puncta come indicatore di permeabilizzazione della membrana lisosomiale. La colorazione lisosomiale con AlPcS2a nelle cellule HeLa è stata eseguita utilizzando marcatori disponibili in commercio ed è stata colorata positivamente con colorante fluorescente verde. I lisosomi nelle cellule HeLa espresse da TagRFP-Galectin3 sono stati colorati con AlPcS2a.
Seguita dalla focalizzazione dell'illuminazione con luce nel vicino infrarosso, i risultati indicano che l'inattivazione laser assistita da cromofori basata su AlPcS2a è stata in grado di controllare la rottura lisosomiale locale all'interno della regione di interesse, lasciando intatto il resto dei lisosomi. Questo passaggio è importante perché il tempo di incubazione determinerà gli endosomi o i lisosomi in piedi. Ad esempio, le persone possono determinare la dimensione di dal rilascio di colorante impermeabile alla membrana.
Inoltre può utilizzare coloranti sensibili al pH come il destrano FITC per differenziare endosomi e lisosomi. Questa tecnica è utile per iniziare gli effetti a valle della rottura della membrana della vescicola intracellulare. E ci sono effetti a valle in varie situazioni.
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Panoramica
La inattivazione assistita da cromoforo mediante laser (CALI) mediata da AlPcS 2a viene utilizzata per studiare i danni spazio-temporali dei vescicoli intracellulari in cellule vive. Questa tecnica consente un controllo preciso sui danni subcellulari, fornendo informazioni sulle conseguenze della rottura dei vescicoli.
Componenti Chiave dello Studio
Settore Scientifico
- Biologia Cellulare
- Neuroscienze
- Microscopia a Cellule Vive
Sfondo
- L'endocitosi porta alla formazione di vescicole intracellulari.
- La permeabilizzazione delle vescicole attiva diverse vie di segnalazione.
- Il CALI è un metodo per studiare gli effetti della rottura delle vescicole.
- Il controllo spaziale e temporale viene ottenuto mediante illuminazione con luce.
Scopo dello studio
- Studiare la dinamica del danno ai vescicoli intracellulari.
- Comprendere le vie di segnalazione attivate dalla rottura dei vescicoli.
- Perfezionare le tecniche per lo studio delle interazioni in cellule vive.
Metodi Utilizzati
- Coltura di cellule HeLa in DMEM con FBS al 10%.
- Lavaggio delle cellule con PBS prima dell'esperimento.
- Tripsinizzazione delle cellule per l'analisi.
- Applicazione di CALI per indurre danni localizzati.
Risultati principali
- Dimostrato un controllo efficace sui danni ai vescicoli.
- Identificati i principali percorsi di segnalazione attivati dopo la rottura.
- Convalidato l'utilizzo della CALI nello studio di cellule vive.
- Forniti spunti sui meccanismi alla base della funzione vescicolare.
Conclusioni
- CALI è uno strumento prezioso per lo studio della dinamica intracellulare.
- I risultati migliorano la comprensione della segnalazione correlata alle vescicole.
- Studi futuri possono basarsi su questi metodi per ottenere approfondimenti più dettagliati.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Direttiva
L'inattivazione laser assistita da cromoforo (CALI) consente un'induzione precisa e spazio-temporale della rottura delle vescicole intracellulari, fornendo un sistema controllato per analizzare gli eventi di permeabilizzazione della membrana. Questo approccio supporta la riduzione del rischio meccanicistica e la validazione degli obiettivi, permettendo una manipolazione e un monitoraggio selettivi dell'integrità endosomiale e lisosomiale in cellule vive. Il metodo aumenta la fiducia predittiva nella fase iniziale della scoperta, collegando la rottura delle vescicole ai segnali downstream e al reclutamento molecolare.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette un'analisi diretta dell'integrità della membrana delle vescicole e del suo ruolo nelle vie di segnalazione.
- Consente la validazione funzionale del reclutamento di proteine leganti i glicani, come la galectina-3, in seguito alla rottura delle vescicole.
- Facilita la riduzione dei rischi meccanicistici isolando gli effetti della permeabilizzazione mirata degli organelli.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce una piattaforma per lo sviluppo di saggi quantitativi basati sull'imaging per monitorare la rottura delle vescicole e il reclutamento molecolare.
- Permette la standardizzazione dei saggi mediante l'induzione controllata e localizzata della permeabilizzazione della membrana.
- Consente una valutazione riproducibile degli effetti dei composti sulla stabilità endosomiale e lisosomiale.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a modelli rilevanti per le malattie in cui l'integrità delle vescicole influisce sulla segnalazione cellulare e sulla patologia.
- Permette una transizione continua dalla scoperta alla validazione preclinica, consentendo studi sugli effetti a valle della rottura delle vescicole.
- Facilita decisioni di avanzamento basate sulla valutazione del rischio, fornendo informazioni meccanicistiche sulle risposte cellulari.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo approccio fotodinamico si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica consentendo la manipolazione e la rilevazione guidate da ipotesi degli eventi di rottura delle vescicole.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sul ruolo della permeabilizzazione delle vescicole nella segnalazione e nel reclutamento di proteine.
- Screening: Fornisce output quantitativi e riproducibili di imaging per lo sviluppo di saggi e la valutazione di composti.
- Analisi: Offre endpoint misurabili come la formazione di puncta di galectina-3 e il rilascio di colorante per analisi comparative.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati meccanicistici a modelli cellulari rilevanti per le malattie in cui è implicata la rottura delle vescicole.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma modulare e riutilizzabile per lo studio della dinamica delle membrane in diversi tipi cellulari e condizioni.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica negli studi sui segnali correlati alle vescicole.
- Valore operativo: Standardizza l'induzione e la misurazione della rottura delle vescicole per ottenere risultati riproducibili.
- Valore strategico: Orienta le decisioni di avanzamento o interruzione chiarificando le conseguenze funzionali della permeabilizzazione della membrana.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei bersagli e dei percorsi influenzati dall'integrità delle vescicole, adeguata al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'immagine di cellule vive e nella manipolazione fotodinamica.
- Necessita dell'accesso a microscopia confocale e infrastrutture per l'illuminazione laser.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per i protocolli di acquisizione e analisi delle immagini.
- Adattabile a diverse linee cellulari e marcatori di organelli, purché dotate di controlli appropriati.
- Dipende da una calibrazione precisa dei parametri laser e delle concentrazioni dei coloranti per garantire la riproducibilità.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:44
Transfection and AlPcS2a Staining
3:00
Sample Imaging and Light Illumination
3:47
Results: AlPcS2a-Mediated Chromophore‐Assisted Laser Inactivation for Studying patiotemporal Damage of Intracellular Vesicles in Live Cells
4:25
Conclusion
