Preparazione del tessuto miocardico umano per la coltivazione a lungo termine

Utilizzando questo protocollo, le fette di tessuto ventricolare sinistro umano possono essere coltivate ex vivo in una camera biomimetica. L'applicazione di pre e postcarico migliora la somiglianza dell'ambiente fisiologico. Questa tecnica consente la registrazione continua della contrazione tissutale.

I protocolli di stimolazione definiti dall'utente consentono la valutazione dei parametri di contrazione vitale come il potenziamento post-pausa, la soglia di stimolazione, la relazione forza-frequenza e il periodo refrattario. La coltivazione a lungo termine di fette miocardiche, utilizzando questa configurazione, aprirà la strada alla futura ricerca ex vivo, facilitando questo screening per gli effetti terapeutici e cardiotossici dei farmaci in medicina cardiovascolare. Per iniziare, immergere le camere di coltivazione e gli elettrodi di grafite in un litro di una soluzione di isopropanolo al 10% e agitare durante la notte.

Il giorno seguente, trasferire le camere in una soluzione di isopropanolo al 100% per 3 minuti, quindi lasciare asciugare all'aria le camere e gli elettrodi di grafite sotto una cappa a flusso laminare. Collegare un circuito stampato a ciascuna camera in base alle posizioni disponibili sul bilanciere. Posizionare due elettrodi di grafite sul circuito stampato secondo le istruzioni del produttore, quindi posizionare un coperchio della capsula di Petri da 35 millimetri sulla camera per prevenire l'infezione.

Quindi, riempire il vassoio di taglio fino al 90-95% con tampone di affettatura. Trasferire il campione di tessuto in una capsula di Petri da 100 millimetri riempita con tampone di affettatura a freddo e posizionare la piastra su una piastra di raffreddamento a 4 gradi Celsius. Rimuovere le trabecole endocardiche tenendo l'endocardio con una pinzetta, quindi utilizzare le forbici per tagliare via circa 3 millimetri di tessuto endocardico.

Fissare il campione di tessuto tagliato, lato endocardico fino a un cerotto di gomma di 2 per 2 centimetri utilizzando quattro aghi da 0,9 per 70 millimetri calibro 20 che sono fissati in posizione quadrata. Assicurarsi che il bordo diagonale di ciascuna punta dell'ago sia rivolto verso l'interno, migliorando la fissazione e prevenendo danni al miocardio. Usando un bisturi, tagliare via tutto il tessuto in eccesso al di fuori dei quattro quadrati dell'ago.

Usando una pinzetta, posizionare il campione tagliato su un pezzo di tessuto sterile per 10 secondi per rimuovere il tampone di affettamento in eccesso. Quindi, rimuovere la siringa di agarosio dal bagno d'acqua e immergere il campione in agarosio. Lasciare solidificare l'agarosio per cinque minuti su una piastra di raffreddamento.

Il lato endocardico del campione deve essere visibile nell'agarosio. Usando una pinzetta, posizionare il lato epicardico del campione contenuto nell'agarosio sopra l'area incollata, quindi premere delicatamente il campione contenente agarosio dall'alto con uno strumento smussato senza tagliare o danneggiare l'agarosio. Lasciare solidificare la colla per 1 minuto.

Impostare l'ampiezza della vibrazione su 1 millimetro, la velocità di taglio iniziale a 0,07 millimetri al secondo e lo spessore della fetta a 300 micron. Dopo aver collegato il sistema di coltivazione a un computer, avviare il programma software corrispondente. Impostare la velocità del bilanciere a 60 giri/min e preimpostare i parametri di stimolazione.

Per le fette cardiache umane, impostare la stimolazione standard su impulsi bifasici con 50 milliampere o corrente costituiti da corrente positiva di 3 millisecondi, pausa di 1 millisecondo e un impulso di 3 millisecondi di corrente invertita a una velocità di stimolazione di 30 battiti al minuto o bpm, quindi controllare gli indicatori degli elettrodi del software e verificare che gli elettrodi delle camere di coltivazione funzionino correttamente. Usando una pinzetta, separare l'agarosio dal tessuto. Evitare di toccare il tessuto e maneggiarlo con attenzione poiché qualsiasi danno al tessuto ridurrà il tasso di successo della coltivazione.

Per attaccare due triangoli di plastica a un campione, posizionare 1 microlitro di colla su un coperchio sterile della capsula di Petri. Usa una pinzetta agganciata per raccogliere un triangolo di plastica autoclavato. Immergere rapidamente il bordo anteriore del triangolo nella colla e incollare il triangolo sul campione perpendicolare all'allineamento dei cardiomiociti.

Ripetere l'operazione per l'altro triangolo. Usando un bisturi, tagliare il tessuto che supera la larghezza del triangolo e posizionare la fetta con i due triangoli montati nel vassoio di taglio contenente il tampone di affettatura. Rimuovere la camera di coltivazione a riempimento medio dall'incubatore.

Selezionare una fetta preparata e inserirla nella camera collegando un triangolo a ciascun perno. Regolare la distanza tra i pin di montaggio in base alle dimensioni del campione. Assicurarsi che il campione sia immerso nel mezzo.

Dopo aver posizionato la parabola sul bilanciere, diminuire il precarico ruotando la vite di regolazione in senso antiorario fino a quando la linea di base del grafico corrispondente sullo schermo del computer non cambia più, quindi aumentare attentamente il precarico o la tensione ruotando la vite di regolazione in senso orario. Per le camere con elevata rigidità, continuare fino a quando la linea di base corrispondente nel grafico non è aumentata da 1.000 a 1.200 unità corrispondenti a un precarico di millinewton. Dopo aver preparato il terreno di coltivazione fresco, preriscaldare il mezzo a bagnomaria o in un incubatore ad aria calda a 37 gradi Celsius per 30-45 minuti.

Rimuovere il mezzo dalla camera, lasciando circa 0,8 millilitri nella camera, quindi aggiungere 1,6 millilitri di mezzo fresco alla stessa camera, per un volume totale di mezzo a 2,4 millilitri per camera. Infine, posizionare il coperchio della camera indietro e posizionare la camera di coltivazione nella rispettiva posizione. La lettura della contrazione di cinque fette miocardiche durante una stimolazione tipica consisteva in quattro sezioni distinte di potenziamento post-pausa, soglia di stimolazione, relazione forza-frequenza e periodo refrattario.

Rispetto al controllo, la forza di contrazione delle fette trattate con calcio antagonisti, nifedipina e calciseptina, è diminuita entro 10 minuti. Al contrario, l'agonista del canale del calcio voltaggio-dipendente, Bay-K8644, ha aumentato la forza di contrazione. Il potenziamento post-pausa delle fette di controllo e trattate è stato valutato per il rilascio intracellulare di calcio dal reticolo sarcoplasmatico.

La sezione di controllo non ha mostrato alcuna modifica. In presenza di calciseptina e nifedipina, l'inibizione dei canali del calcio di tipo L ha portato al potenziamento della prima contrazione dopo una pausa di 50 secondi, riflettendo un maggiore contributo relativo del rilascio intracellulare di calcio alla contrattilità totale. L'effetto opposto è stato osservato con Bay-K8644, che stimola l'ingresso del calcio extracellulare attraverso i canali del calcio di tipo L.

Nell'analisi della relazione forza-frequenza, non è stato osservato alcun cambiamento nella fetta di controllo. Il trattamento con calciseptina non ha modificato la capacità della fetta di seguire gli stimoli in caso di aumento della frequenza di stimolazione quando si confrontano i dati pre e post-trattamento. Rispetto alla calciseptina, la nifedipina ha impedito un aumento della contrattilità a velocità di stimolazione più elevate e ha ridotto la velocità massima di cattura a 80 bpm.

Con Bay-K8644, è stato osservato un aumento della forza di contrazione a frequenze di stimolazione molto basse. Tuttavia, a frequenze superiori a 50 bpm, la forza di contrazione era inferiore rispetto alla condizione di pre-trattamento. Il tessuto asportato deve essere rapidamente trasferito a 4 gradi cardioplegia.

Dopo l'affettamento, i triangoli di plastica devono essere attaccati perpendicolarmente alla direzione della fibra. Il precarico non deve superare i 1500 millinewton. La coltura a fette biomimetiche può aiutare i ricercatori a utilizzare manipolazioni genetiche e terapie cellulari per studiare la rigenerazione e la riparazione nel miocardio umano adulto.