Name: Ricostituzione di cortecce di actina minima legate alla membrana su doppi strati lipidici supportati (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-12T14:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: Scopri come assemblare reti di actomiosina legate alla membrana su doppi strati lipidici supportati per studiare la dinamica citoscheletrica con microscopia a fluorescenza. Questo metodo versatile consente l'aggiunta sequenziale di proteine senza compromettere l'integrità della rete.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal fondo di ricerca AXA e dal Warwick-Wellcome Quantitative Biomedicine Programme (Wellcome ISSF, RMRCB0058) per DVK, NCBS-TIFR per AB e ST e dalla borsa di studio Wellcome-DBT Margdarshi (IA/M/15/1/502018) per SM. DVK desidera anche ringraziare la Biophysical Society per aver reso possibile l'evento di networking virtuale "Challenges in understanding multi-component cytoskeletal networks from the molecular to the meso-scale", che ha contribuito alla creazione di questa raccolta di protocolli.

<ol><li>Köster, D. V., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+actin+and+the+plasma+membrane%3A+Inextricably+intertwined%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cortical actin and the plasma membrane: Inextricably intertwined.</a> Current Opinion in Cell Biology. 38, 81-89 (2016).</li>
<li>Rao, M., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+organization+of+membrane+constituents+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Active organization of membrane constituents in living cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 29, 126-132 (2014).</li>
<li>Honigmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lipid+bound+actin+meshwork+organizes+liquid+phase+separation+in+model+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A lipid bound actin meshwork organizes liquid phase separation in model membranes.</a> eLife. 3, 01671(2014).</li>
<li>Das, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stratification+relieves+constraints+from+steric+hindrance+in+the+generation+of+compact+actomyosin+asters+at+the+membrane+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Stratification relieves constraints from steric hindrance in the generation of compact actomyosin asters at the membrane cortex.</a> Science Advances. 6 (11), (2020).</li>
<li>Köster, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actomyosin+dynamics+drive+local+membrane+component+organization+in+an+in+vitro+active+composite+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Actomyosin dynamics drive local membrane component organization in an in vitro active composite layer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (12), 1645-1654 (2016).</li>
<li>Vogel, S. K., Heinemann, F., Chwastek, G., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+of+MACs+%28minimal+actin+cortices%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">The design of MACs (minimal actin cortices).</a> Cytoskeleton. 70 (11), 706-717 (2013).</li>
<li>Murrell, M., Thoresen, T., Gardel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+contractile+actomyosin+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of contractile actomyosin arrays.</a> Methods in Enzymology. 540, 265-282 (2014).</li>
<li>Mosby, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+II+filament+dynamics+in+actin+networks+revealed+with+interferometric+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Myosin II filament dynamics in actin networks revealed with interferometric scattering microscopy.</a> Biophysical Journal. 118 (8), 1946-1957 (2020).</li>
<li>Seara, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entropy+production+rate+is+maximized+in+non-contractile+actomyosin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Entropy production rate is maximized in non-contractile actomyosin.</a> Nature Communications. 9 (1), 4948(2018).</li>
<li>Linsmeier, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disordered+actomyosin+networks+are+sufficient+to+produce+cooperative+and+telescopic+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility.</a> Nature Communications. 7, 12615(2016).</li>
<li>Vogel, S. K., Petrasek, Z., Heinemann, F., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+motors+fragment+and+compact+membrane-bound+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Myosin motors fragment and compact membrane-bound actin filaments.</a> eLife. 2, 00116(2013).</li>
<li>Ditlev, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+composition-dependent+molecular+clutch+between+T+cell+signaling+condensates+and+actin%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A composition-dependent molecular clutch between T cell signaling condensates and actin.</a> eLife. 8, 42695(2019).</li>
<li>Banjade, S., Rosen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+transitions+of+multivalent+proteins+can+promote+clustering+of+membrane+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Phase transitions of multivalent proteins can promote clustering of membrane receptors.</a> eLife. 3, 04123(2014).</li>
<li>Heinemann, F., Vogel, S. K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+membrane+diffusion+modulated+by+a+minimal+actin+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Lateral membrane diffusion modulated by a minimal actin cortex.</a> Biophysical Journal. 104 (7), 1465-1475 (2013).</li>
<li>Vogel, S. K., Greiss, F., Khmelinskaia, A., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+lipid+domain+organization+by+a+biomimetic+contractile+actomyosin+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Control of lipid domain organization by a biomimetic contractile actomyosin cortex.</a> eLife. 6, 24350(2017).</li>
<li>Block, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brownian+motion+at+lipid+membranes%3A+A+comparison+of+hydrodynamic+models+describing+and+experiments+quantifying+diffusion+within+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Brownian motion at lipid membranes: A comparison of hydrodynamic models describing and experiments quantifying diffusion within lipid bilayers.</a> Biomolecules. 8 (2), 30(2018).</li>
<li>JoVE, JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Methods+Collection.+In+vitro+reconstitution+of+cytoskeleton+networks+for+biomaterials%2C+biophysics+and+active+matter+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">JoVE Methods Collection. In vitro reconstitution of cytoskeleton networks for biomaterials, biophysics and active matter research.</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2022).</li>
<li>Pardee, J. D., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+muscle+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Purification of muscle actin.</a> Methods in Enzymology. 85, 164-181 (1982).</li>
<li>Spudich, J. A., Watt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+rabbit+skeletal+muscle+contraction.+I.+Biochemical+studies+of+the+interaction+of+the+tropomyosin-troponin+complex+with+actin+and+the+proteolytic+fragments+of+myosin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin.</a> Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).</li>
<li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+purification+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Myosin purification and characterization.</a> Methods in Cell Biology. 24, 331-371 (1982).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separating+protein+with+SDS-PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Separating protein with SDS-PAGE.</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2022).</li>
<li>Bieling, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WH2+and+proline-rich+domains+of+WASP-family+proteins+collaborate+to+accelerate+actin+filament+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">WH2 and proline-rich domains of WASP-family proteins collaborate to accelerate actin filament elongation.</a> The EMBO Journal. 37 (1), 102-121 (2018).</li>
<li>Shrivastava, R., Köster, D., Kalme, S., Mayor, S., Neerathilingam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailor-made+ezrin+actin+binding+domain+to+probe+its+interaction+with+actin+in-vitro%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tailor-made ezrin actin binding domain to probe its interaction with actin in-vitro.</a> PLoS One. 10 (4), 0123428(2015).</li>
<li>Nye, J. A., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+control+of+histidine-tagged+protein+surface+density+on+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Kinetic control of histidine-tagged protein surface density on supported lipid bilayers.</a> Langmuir. 24 (8), 4145-4149 (2008).</li>
<li>Honigmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+STED-FCS+reveals+spatiotemporal+heterogeneity+of+lipid+interaction+in+the+plasma+membrane+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Scanning STED-FCS reveals spatiotemporal heterogeneity of lipid interaction in the plasma membrane of living cells.</a> Nature Communications. 5, 5412(2014).</li>
<li>Selden, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+programmed+cell+adhesion+with+membrane-anchored+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Chemically programmed cell adhesion with membrane-anchored oligonucleotides.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (2), 765-768 (2012).</li>
<li>Seu, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+surface+treatment+on+diffusion+and+domain+formation+in+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Effect of surface treatment on diffusion and domain formation in supported lipid bilayers.</a> Biophysical Journal. 92 (7), 2445-2450 (2007).</li>
<li>Kang, M., Day, C. A., Kenworthy, A. K., DiBenedetto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+equation+to+extract+diffusion+coefficients+from+confocal+FRAP+data%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Simplified equation to extract diffusion coefficients from confocal FRAP data.</a> Traffic. 13 (12), 1589-1600 (2012).</li>
<li>Kang, M., Day, C. A., Kenworthy, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+computational+framework+for+D%28t%29+from+Fluorescence+Recovery+after+Photobleaching+data+reveals+various+anomalous+diffusion+types+in+live+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">A novel computational framework for D(t) from Fluorescence Recovery after Photobleaching data reveals various anomalous diffusion types in live cell membranes.</a> Traffic. 20 (11), 867-880 (2019).</li>
<li>Lorén, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+recovery+after+photobleaching+in+material+and+life+sciences%3A+Putting+theory+into+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Fluorescence recovery after photobleaching in material and life sciences: Putting theory into practice.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (3), 323-387 (2015).</li>
<li>Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+motors+robustly+drive+active+gels+to+a+critically+connected+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Physics%22%5BJournal%5D)">Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state.</a> Nature Physics. 9 (7), 1-7 (2013).</li>
<li>Andrecka, J., Spillane, K. M., Ortega-Arroyo, J., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+and+control+of+Supported+lipid+bilayer+formation+with+interferometric+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Direct observation and control of Supported lipid bilayer formation with interferometric scattering microscopy.</a> ACS Nano. 7 (12), 10662-10670 (2013).</li>
<li>Lin, W. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+membrane+formation%2C+characterization%2C+functionalization%2C+and+patterning+for+application+in+biological+science+and+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Supported membrane formation, characterization, functionalization, and patterning for application in biological science and technology.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 2 (4), 235-269 (2010).</li>
<li>Richter, R. P., Bérat, R., Brisson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+solid-supported+lipid+bilayers%3A+An+integrated+view%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Formation of solid-supported lipid bilayers: An integrated view.</a> Langmuir. 22 (8), 3497-3505 (2006).</li>
<li>Sapuri-Butti, A. R., Butti, R. C., Parikh, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+supported+membranes+on+topographically+patterned+polymeric+elastomers+and+their+applications+to+microcontact+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Characterization of supported membranes on topographically patterned polymeric elastomers and their applications to microcontact printing.</a> Langmuir. 23 (25), 12645-12654 (2007).</li>
<li>Leptihn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+droplet+interface+bilayers+from+the+contact+of+aqueous+droplets+in+oil%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).</li>
<li>Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulated+actomyosin+patterns+drive+cell-like+membrane+shape+changes%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes.</a> iScience. 25 (5), 104236(2022).</li>
<li>Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+encapsulation+of+reconstituted+cytoskeleton+inside+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (177), e63332(2021).</li>
<li>Murrell, M., Chen, S., Sun, Z. G. In vitro reconstitution of actin cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMurrell%2C+M+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22">Journal of Visualized Experiments</a>. , (2022).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Questo protocollo presenta una piattaforma versatile e un punto di partenza per progettare esperimenti per studiare l'interfaccia membrana-corteccia delle cellule. I passaggi critici sono la preparazione di vetrini puliti, utilizzando lipidi freschi per una formazione efficiente di SUV (entrambi influenzano la qualità degli SLB) e l'uso di proteine miosina II appena riciclate per la riorganizzazione dinamica dei filamenti di actina. Quando si visualizzano dinamiche per un lungo periodo, è molto importante incorporare un sistema scavenger di ossigeno (ad esempio, acido protocatechuico e protocatechuato 3 4-diossigenasi 5,31).
Il design a camera aperta consente l'aggiunta sequenziale di componenti a un sistema esistente senza indurre flussi lipidici. Questo può essere un vantaggio importante rispetto agli approcci a camera chiusa comunemente usati o al lavoro che utilizza proteine incapsulate all'interno dei liposomi36. Effetti contrari come la deformazione della membrana indotta da proteine non possono essere studiati con doppi strati lipidici adsorbiti di vetro.
I doppi strati lipidici possono essere formati con una vasta gamma di composizioni lipidiche. Inizia con l'adsorbimento delle vescicole lipidiche sulla superficie del vetro idrofilo, seguito dalla rottura spontanea della vescicola dovuta alle interazioni superficie-vescicola e vescicola-vescicola diretta o dalle vescicole adsorbite che raggiungono una copertura critica dopo di che una piccola frazione di vescicole si rompe, formando bordi attivi, che alla fine porta alla formazione del doppio strato32 . Oltre al vetro, vari substrati possono essere utilizzati per formare doppi strati lipidici supportati, come mica (ad esempio, per microscopia a forza atomica), substrati morbidi (ad esempio, poli-di-metil-silossano), cuscini polimerici33,34,35, che si estendono tra i fori delle griglie di microscopia elettronica 14. I doppi strati dell'interfaccia a goccia sono un altro metodo interessante per creare doppi strati lipidici stabili e indipendenti36. L'inclusione di reti di acto-miosina in vescicole o emulsioni è un metodo molto potente per studiare questo sistema minimo in una geometria simile a una cella37,38, e che è descritto in dettaglio altrove 39.

La membrana plasmatica di una cellula animale vivente interagisce costantemente con il citoscheletro di actina adiacente e insieme formano un materiale composito attivo che soddisfa una moltitudine di funzioni cellulari 1,2. Per studiare i processi a questa interfaccia membrana lipidica-actina, la ricostituzione delle reti citoscheletriche in cima ai doppi strati lipidici supportati (SLB) si è dimostrata molto utile. Questo approccio sistemico minimale consente il controllo preciso dei componenti della rete del citoscheletro e della composizione lipidica. Rispetto alle membrane lipidiche autoportanti delle vescicole unilamellari giganti, la geometria planare delle SLB consente un uso efficiente di tecniche di microscopia all'avanguardia come la super-risoluzione3,4, la fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF)5,6,7 o lo scattering interferometrico 8 studiare l'organizzazione spaziale e la dinamica delle reti citoscheletriche. TIRF fornisce il più alto contrasto per i componenti marcati con fluorescenza, poiché il segnale delle molecole marcate non legate nella soluzione che contribuiscono al segnale di fondo è minimo.
Qui, descriviamo un protocollo di base per la formazione di reti di actomiosina legate a doppi strati lipidici supportati, che sono ampiamente utilizzati sul campo per studiare la fisica delle reti attive quasi-2D 9,10,11 e il loro effetto sull'organizzazione della membrana 3,5,12,13,14,15,16 (Figura 1 ). Questo approccio non è limitato alle reti basate sull'actina, ma può anche essere adattato facilmente per esplorare microtubuli, filamenti intermedi o reti composite di natura mista e per studiare una varietà di interazioni tra proteine della membrana lipidica e componenti citoscheletrici utilizzando metodi di microscopia sensibili alla superficie.
Per mantenere questo protocollo focalizzato, abbiamo escluso una descrizione dettagliata della purificazione e dell'etichettatura delle proteine di actina e miosina o dettagli su come sintonizzare e controllare la contrattilità e l'organizzazione delle reti di actomiosina. Si dovrebbe fare riferimento ad altri protocolli che sono pubblicati insieme a questo nella JoVE Methods Collection, In Vitro Reconstitution of Cytoskeleton Networks for Biomaterials, Biophysics and Active Matter Research17.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63968/63968fig01.jpg"> Figura 1: Schema del sistema composito attivo in vitro di actina-membrana. Creato con Biorender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63968/63968fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>1,2 dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N- (lissimina rodamina B sulfonil)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810158</td><td>16:0 RhoPE</td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3- [((N-(5-ammino-1 carbossipentyl) acido iminodiacetico) succinil] (sale di nichel)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>790404</td><td>DGS-NTA-Ni2+</td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375</td><td>DOPC</td></tr><tr><td>1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850355</td><td>DPPC</td></tr><tr><td>Fiale di vetro ambrato</td><td>ThermoFisher</td><td>B7990-2A</td><td></td></tr><tr><td>ATP sale disodico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>Camera cellulare Attofluor</td><td>ThermoFisher</td><td>A7816</td><td></td></tr><tr><td>Sonicatore da bagno</td><td>GT Sonic</td><td>1860QTS</td><td></td></tr><tr><td>beta-caseina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6905</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>ThermoFisher</td><td>12135</td><td></td></tr><tr><td>cloroformio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>650471</td><td>in alternativa da Electron Microscopy Sciences, 50980296</td></tr><tr><td>Vetrini, #1, diametro 25 mm, Gold Seal</td><td>Harvard Apparatus</td><td>64-0705B</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini, #1, 40x22 mm, Gold Seal</td><td>ThermoFisher</td><td>48404-031</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>G12635</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Himedia</td><td>MB130</td><td></td></tr><tr><td>Siringhe in vetro a tenuta di gas, con ago di rimozionebla, smussato, volumi 10 & micro; L, 100 & micro; L, 500 & micro; L</td><td>Hammilton</td> serie <td></td><td>1700</td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Hellma Analytics</td><td>Z805939</td><td>soluzione detergente</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Himedia</td><td>RM380</td><td></td></tr><tr><td>KaH2PO4</td><td>ThermoFisher</td><td>G13405</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>ThermoFisher</td><td>G13305</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>ThermoFisher</td><td>G26708</td><td></td></tr><tr><td>Estrusore di lipidi</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>61000-1EA</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ThermoFisher</td><td>G15535</td><td></td></tr><tr><td>Sonicatore di micropunte</td><td>Sonics</td><td>VC750</td><td>3 mm Diametro della punta</td></tr><tr><td>Na2CO3</td><td>ThermoFisher</td><td>G15955</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Himedia</td><td>GRM853</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>ThermoFisher</td><td>G15825</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>ThermoFisher</td><td>G27815</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Ti Eclipse Microscopio TIRF</td><td>Nikon</td><td></td><td>Con un'unità TIRF collegata tramite una fibra ottica a risparmio di polarizzazione a un combinatore laser monolitico Agilent MLC400 con linee laser multiple con un obiettivo a olio Nikon 100X, 1,45 NA con due fotocamere EMCCD da 512 x 512 pixel (Photometrics Evolve 512) con un obiettivo a olio Nikon 100X, 1,45 NA con due fotocamere EMCCD da 512 x 512 pixel (Photometrics Evolve 512)</td></tr><tr><td>NOA88</td><td>Norland Products</td><td>8801</td><td></td></tr><tr><td>PTFE Coated Tweezer Style #2A</td><td>Structure Probe</td><td>0S2AT-XD</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuga refrigerata</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>ThermoFisher</td><td>G15925</td><td></td></tr><tr><td>L'illuminatore UV</td><td>Novascan</td><td>PSD PRO-UV</td><td>necessita di vuoto e alimentazione O2</td></tr></tbody></table>

ricostituzione di cortecce di actina minima legate alla membrana su doppi strati lipidici supportati

Reconstitution of Membrane-Tethered Minimal Actin Cortices on Supported Lipid Bilayers

La superficie di una cellula vivente fornisce una piattaforma attiva versatile per numerosi processi cellulari, che derivano dall'interazione della membrana plasmatica con la corteccia di actina sottostante. Negli ultimi decenni, sistemi minimali ricostituiti basati su doppi strati lipidici supportati in combinazione con reti di filamenti di actina si sono dimostrati molto strumentali nel districare i meccanismi di base e le conseguenze delle reti di actina legate alla membrana, nonché nello studio delle funzioni delle singole proteine associate alla membrana. Qui, descriviamo come ricostituire tali sistemi compositi attivi in vitro che consistono in doppi strati lipidici supportati da fluidi accoppiati tramite proteine leganti l'actina associate alla membrana a filamenti di actina dinamici e motori di miosina che possono essere facilmente osservati tramite microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale. Un design a camera aperta consente di assemblare il sistema in modo graduale e di controllare sistematicamente molti parametri come la concentrazione della proteina linker, la concentrazione di actina, la lunghezza del filamento di actina, il rapporto actina / miosina e i livelli di ATP. Infine, discutiamo come controllare la qualità del sistema, come rilevare e risolvere i problemi comuni e alcune limitazioni di questo sistema rispetto alla superficie della cellula vivente.

Per la rappresentazione, qui viene mostrato un tipico profilo postbleach della 1a immagine dopo il photobleaching (immagine a t = 0 s nella Figura 3A) e il suo adattamento alla seguente funzione28 (vedi Figura 6A):
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/63968/63968eq04.jpg" style="margin: auto;">
Il valore di r e (23,94 μm) calcolato dall'adattamento a questa curva è molto simile all'r e calcolato al punto 2.8.4. (23,24 μm). Qui, K è un parametro di profondità della candeggina che può essere stimato direttamente da F0 (descritto nel passaggio 2.8.4.). Analogamente, la Figura 6B mostra il profilo di recupero e il relativo adattamento alla seguente funzione28:
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/63968/63968eq05.jpg" style="margin: auto;">
Troviamo che il valore adattato del coefficiente di diffusione è 1,34 μm 2/s, un valore che concorda strettamente con il valore di 1,39 μm 2/s che viene calcolato dalla formula nel passo2.8.4. Qui, MF sta per la frazione mobile del doppio strato lipidico che rappresenta la frazione della popolazione sbiancata che recupera. La mobilità delle molecole ancorate ai lipidi dipende, naturalmente, dalla composizione lipidica e dal suo stato fisico (fase liquida o gel). Per i nostri esperimenti che utilizzano membrane lipidiche basate su DOPC, la mobilità dovrebbe essere &gt;1 μm2 / s e la frazione mobile non dovrebbe essere inferiore a 0,9 per indicare un buon doppio strato lipidico. Si consiglia l'uso del metodo manuale senza montaggio per un rapido test della qualità e della mobilità del doppio strato. Il metodo di adattamento può essere utile per automatizzare l'analisi per molte curve FRAP. Inoltre, se si desidera eseguire un esperimento FRAP più sofisticato per caratterizzare sistematicamente la diffusione nel sistema, raccomandiamo al lettore di questa recensione di Lorén et al.30 per maggiori dettagli sui modelli di adattamento e sulle potenziali insidie nella progettazione sperimentale.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63968/63968fig06.jpg"> Figura 6: Quantificazione del coefficiente di diffusione dei doppi strati lipidici. (A) Profilo della prima immagine dopo il fotosbiancamento (t = 0 s nella figura 3A) e sua corrispondenza con l'equazione 4 per calcolare il raggio effettivo di candeggina. (B) Il profilo di recupero della regione sbiancata e la sua idoneità all'equazione 5 per calcolare il coefficiente di diffusione e la frazione mobile. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63968/63968fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
Un risultato tipico degli esperimenti sopra descritti che mostra l'assemblaggio dinamico e l'organizzazione di una rete di acto-miosina collegata su un doppio strato lipidico supportato ripreso dalla microscopia TIRF è rappresentato nella Figura 7 e nel Video supplementare S1.
La Figura 7 mostra un montaggio di immagini della proteina linker, F-actina e miosina-II.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63968/63968fig07.jpg"> Figura 7: I flussi contrattili di actomiosina guidano il clustering locale della proteina linker membrana-actina HYE. Istantanee TIRF di HYE (marcato YFP), filamenti di actina (marcati con Atto-635 maleimide) e filamenti di miosina II (marcati con Atto-565 maleimmide) dopo aggiunta di miosina II a un SLB contenente HYE e F-actina. Il tempo è indicato in alto: 0 min è immediatamente prima che i miofilamenti fluorescenti inizino a comparire nel campo TIRF. HYE e F-actina sono distribuiti omogeneamente sul doppio strato lipidico prima dell'aggiunta di miosina (0 min). L'attività della miosina induce flussi contrattili di actomosisina, che emergono in strutture simili ad aster allo stato stazionario (15 min), guidando il raggruppamento locale della componente accoppiata della membrana (HYE). La riga più bassa è una fusione di immagini di actina (gialla) e miosina II (magenta) che mostrano l'organizzazione di actina e miosina in diversi punti temporali. Le immagini utilizzate per realizzare questi montaggi sono state corrette nelle Figi per il segnale di fondo, i modelli di intensità non uniformi e il movimento traslazionale. Barra della scala = 10 μm. Per informazioni dettagliate, vedere Video supplementare S1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63968/63968fig07large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Nome buffer</td>
			<td colspan="2">Composizione</td>
		</tr><tr><td>Tampone di reidratazione lipidica</td>
			<td colspan="2">50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5% saccarosio, pH 7,5</td>
		</tr><tr><td>Tampone di formazione SLB</td>
			<td colspan="2">50 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 5-6</td>
		</tr><tr><td>Buffer di archiviazione SLB</td>
			<td colspan="2">50 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,2</td>
		</tr><tr><td>Tampone di diluizione delle proteine</td>
			<td colspan="2">20 mM HEPES, 100 mM KCl, 1mM TCEP o DTT, pH 7,2</td>
		</tr><tr><td>1X ME o tampone a scambio ionico actina</td>
			<td colspan="2">50 mM MgCl2, 0,2 mM EGTA, 10 mM HEPES, pH 7,2 (conservare a 4°C)</td>
		</tr><tr><td>1X tampone di polimerizzazione KMEH o actina</td>
			<td colspan="2">50 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 50 mM HEPES, pH 7,2</td>
		</tr><tr><td>Stock ATP da 100 mM</td>
			<td colspan="2">100 mM di sale disodico ATP, 50 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 2 mM EGTA, pH 7,5 (conservare a -20°C)</td>
		</tr><tr><td>2x buffer di destinazione</td>
			<td colspan="2">2x KMEH, 2 mg/ml BSA, 2mM ATP, 5mM TCEP (conservato a 4°C)</td>
		</tr><tr><td>G-buffer</td>
			<td colspan="2">2 mM Tris, 0,1 mM CaCl2, 0,2 mM ATP, 0,5 mM TCEP, 0,04 % NaN3, pH 8 (conservare a 4°C)</td>
		</tr><tr><td>Tampone di miosina II</td>
			<td colspan="2">500 mM KCl, 1 mM EDTA, 10-20 mM Hepes, pH 7,0</td>
		</tr><tr><td>Tampone cromatografico con filtrazione su gel</td>
			<td colspan="2">50 mM Tris-HCl, 150-300 mM NaCl, 5 mM TCEP, 0,1% Tween-20, pH 7,5</td>
		</tr><tr><td>Tamponamento delle proteine Tampone di stoccaggio</td>
			<td colspan="2">10 mM Tris· Cl, 50 mM NaCl, 1 mM TCEP, pH 7,5, 20% glicerolo</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Elenco delle composizioni di buffer utilizzate in questo protocollo.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Problemi comuni e relativa risoluzione dei problemi</td>
			<td>Problema</td>
			<td colspan="4">Causa</td>
			<td colspan="4">Possibili soluzioni</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>Il doppio strato lipidico non mostra diffusione</td>
			<td colspan="4">La causa più probabile di questo problema è il vetro di copertura sporco che può verificarsi quando la soluzione detergente è invecchiata o il riscaldamento non ha avuto luogo durante la sonicazione del bagno. Questi strati bistrati hanno un aspetto "vescicolare" perché le vescicole scoppiate si attaccano al vetro di copertura ma non si fondono tra loro. L'utilizzo di MLV più vecchi di 6 settimane o SUV più vecchi di 6 giorni, o l'aggiunta di basse quantità di SUV può anche portare alla formazione di un doppio strato vescicolare.</td>
			<td colspan="4">Utilizzare una soluzione detergente fresca. Assicurarsi che il riscaldatore sia acceso e che la temperatura sia compresa tra 45-65°C. Utilizzare miscele lipidiche fresche. (L'uso di una sonda lipidica fluorescente rispetto a una sonda proteica fluorescente a volte può manifestarsi in modo diverso. Ad esempio, se il doppio strato ha difetti di subdiffrazione e la fase di passivazione superficiale viene saltata (o non funziona), la sonda lipidica mostrerà una distribuzione uniforme dell'intensità, ma la sonda proteica fluorescente potrebbe mostrare punti fluorescenti luminosi.)</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>Il doppio strato lipidico ha chiazze luminose</td>
			<td colspan="4">La lunga incubazione di SUV per la formazione di due strati può creare un doppio strato lipidico che è complessivamente diffuso, ma con occasionali chiazze luminose. Questi cerotti possono essere doppi strati multistrato che possono attirare grandi quantità di sonda fluorescente.</td>
			<td colspan="4">15-20 minuti di incubazione con SUV sono sufficienti. Assicurarsi che la sonda non si stia aggregando: una rapida rotazione dura della proteina linker (300 x g per 15 minuti a 4 °C) può rimuovere gli aggregati</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>Il doppio strato lipidico ha buchi scuri</td>
			<td colspan="4">Ciò accade quando il doppio strato è costituito da vecchi SUV e ripreso per ore prolungate (&gt; 4 ore dopo la formazione), o il pH della soluzione cambia drasticamente a causa di immagini prolungate (ad esempio, nello stato ATP elevato e in presenza di alcuni scavenger di ossigeno), o quando la superficie è eccessivamente passivata con beta-caseina (aggiungendo troppa beta-caseina per più di 10-15 minuti e o non lavandola via).</td>
			<td colspan="4">Utilizzare lipidi freschi. Riduci la frequenza dei fotogrammi dell'immagine o il tempo effettivo di illuminazione laser. Utilizzare buffer con capacità di buffering superiore.</td>
		</tr><tr><td>4</td>
			<td>Il doppio strato lipidico mostra una diffusione lenta</td>
			<td colspan="4">I doppi strati lipidici con alta percentuale di colesterolo, lipidi saturi lunghi o lipidi carichi si diffondono più lentamente.</td>
			<td colspan="4">In questi casi, preparare il campione ad alta temperatura. Si può anche usare una composizione lipidica semplice e testata come controllo insieme a composizioni lipidiche complesse e non testate. Assicurati che il vetro sia pulito.</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>L'actina non polimerizza</td>
			<td colspan="4">Il buffer target è vecchio, lo stock di G-actina è troppo vecchio, la vecchia e la nuova G-actina sono state copolimerizzate.</td>
			<td colspan="4">Assicurarsi che il Ca 2+ sia sostituito da Mg2+ prima della polimerizzazione (utilizzando il tampone ME). Utilizzare brodo fresco di ATP-Mg2+. Utilizzare G-actina appena riciclata. Assicurarsi che la concentrazione di F-actina (in termini di G-actina) aggiunta al doppio strato sia superiore a 0,2 μM. Per concentrazioni più basse, utilizzare F-actina stabilizzata con falloidina.</td>
		</tr><tr><td>6</td>
			<td>L'actina non si lega al doppio strato</td>
			<td colspan="4">Il linker membrana-actina non viene aggiunto o aggiunto a concentrazioni molto basse, questo può essere dedotto dalla fluorescenza della proteina linker. Se la fluorescenza è decente, il linker membrana-actina ha perso la capacità di legare l'actina. Inoltre, se la proteina linker è legata in modo non specifico alla superficie del vetro (quando il doppio strato è cattivo), potrebbe non reclutare filamenti di actina.</td>
			<td colspan="4">Assicurarsi che il doppio strato si stia diffondendo. Utilizzare proteine linker fresche</td>
		</tr><tr><td>7</td>
			<td>Il segnale fluorescente F-actina è debole</td>
			<td colspan="4">Il rapporto tra actina marcata e actina scura è troppo basso. L'actina marcata o l'actina non etichettata sono troppo vecchie e non sono copolimerizzanti tra loro.</td>
			<td colspan="4">Riciclare di nuovo l'actina e riprovare la ploymerizzazione con actina appena riciclata. Il fotodanneggiamento può distruggere o depolimerizzare la F-actina; Se possibile, utilizzare coloranti rossi o rossi per l'actina (e la miosina).</td>
		</tr><tr><td>8</td>
			<td>La miosina non mostra contrattilità</td>
			<td colspan="4">si può osservare che dopo aver aggiunto ATP al sistema infuso di miosina, non vi è contrattilità dell'acto-miosina.</td>
			<td colspan="4">Controlla se la concentrazione di miosina o il livello di purezza sono buoni. Utilizzare miosina appena riciclata (utilizzare entro 6 settimane dopo il riciclaggio). L'aggiunta di ATP fresco al mix di miosina può aiutare. Tamponi di degasaggio e utilizzo di spazzini di ossigeno, ecc. può ridurre il fotodanneggiamento dei motori.  Ulteriori informazioni possono essere trovate nei protocolli di Plastino et al. o Stam et al. della stessa raccolta di metodi</td>
		</tr><tr><td>9</td>
			<td>Il vetro di copertura non è idrofilo</td>
			<td colspan="4">Il vetro di copertura non viene pulito correttamente.</td>
			<td colspan="4">Il vetro di copertura idrofilo pulito è fondamentale per la formazione del doppio strato lipidico. Un'utile lettura visiva dell'idrofilia del vetro di copertura dopo il protocollo di pulizia è osservare la bagnatura del vetro da parte dell'acqua. Aggiungere un piccolo volume d'acqua a un coprislip piatto. L'acqua rimarrà sotto forma di una goccia rotonda se il coprislip non viene pulito correttamente. Tuttavia, lo stesso volume d'acqua si diffonderà e formerà uno strato sottile, su un coverglass idrofilo trattato. Questo comportamento bagnante dell'acqua sulla superficie del vetro di copertura può essere utilizzato per accertare se le fasi di pulizia con la soluzione detergente/NaOH hanno funzionato.</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 2: Guida alla risoluzione dei problemi che riepiloga i problemi comuni e le soluzioni corrispondenti. 
Video supplementare S1: I flussi contrattili di actomiosina guidano il clustering locale della proteina linker membrana-actina HYE. Timelapse TIRF di HYE (marcato YFP), filamenti di actina (marcati con Atto-635 maleimide) e filamenti di miosina II (marcati con Atto-565 maleimmide) dopo aggiunta di miosina II a un SLB contenente HYE e F-actina. Il tempo è indicato in alto: 0 min è immediatamente prima che i miofilamenti fluorescenti inizino a comparire nel campo TIRF. Barra di scala = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63968/S1Movie_Act_myo_Hye_merge_timestamp_15fps.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

Questo protocollo descrive la formazione di doppi strati lipidici supportati e l'aggiunta di filamenti citoscheletrici e proteine motorie per studiare la dinamica delle reti citoscheletriche ricostituite e legate alla membrana utilizzando la microscopia a fluorescenza.

Ricostituzione di cortecce di actina minima legate alla membrana su doppi strati lipidici supportati

The surface of a living cell provides a versatile active platform for numerous cellular processes, which arise from the interplay of the plasma membrane ...

Qui, dimostriamo una procedura relativamente semplice e diretta per assemblare reti di actomiosina legate alla membrana e studiare la dinamica utilizzando tecniche microscopiche avanzate di luce. Il vantaggio principale è che il nostro test consente l'aggiunta sequenziale di proteine e piccole molecole senza disturbare le reti legate alla membrana. Questo metodo può essere facilmente adattato per studiare altre proteine citoscheletriche o reti composite.La parte più critica del protocollo è garantire che il doppio strato lipidico supportato sia formato correttamente, quindi prima abbiamo dovuto padroneggiare questo passaggio prima di iniziare ad aggiungere le proteine citoscheletriche. Per iniziare, prendi da tre a cinque coprivetrini rettangolari e mettili all'interno di un barattolo di coplin. Accendere il sonicatore del bagno e impostare la temperatura su 65 gradi Celsius.Riempire il barattolo di coplin con una soluzione detergente al 2% per immergere completamente i vetrini di copertura e posizionarlo nel sonicatore per 30 minuti in modalità full pulse. Utilizzare una pinza smussata con rivestimento in PTFE per rimuovere i coperchi uno per uno. Risciacquarli accuratamente con acqua distillata e metterli in un altro barattolo di coplin riempito con due normali idrossido di sodio.Sonica i coperchi per 20 minuti in modalità full pulse. Rimuovere i coperchi, sciacquare abbondantemente con acqua distillata e metterli in un altro barattolo di coplin pieno di acqua distillata. Prima di iniziare l'esperimento, prendi il barattolo in una cappa chimica dotata di una fornitura di gas azoto.Utilizzare guanti e pinze per rimuovere i coprivetrini per asciugarli sotto il flusso di azoto. Asciugare entrambi i lati e posizionarli su una griglia di plastica pulita con un coperchio. Posizionare la scatola con i vetrini di copertura in un essiccatore per evitare il contatto con particelle di polvere, quindi prendere tubi PCR autoclavati e tagliare i coperchi e le metà coniche inferiori con una lama chirurgica affilata.Prendi i tubi cilindrici tagliati a metà, applica l'adesivo polimerizzabile UV sul bordo liscio di ciascun tubo tagliato e posizionalo invertito su un coprivetrino appena pulito in modo che il bordo si trovi piatto sul coprivetrino. Non spostare il cilindro lateralmente una volta posizionato sul vetrino di copertura per assicurarsi che la colla non si riversi nello spazio centrale della camera. Inserire i coperchi dei cuscinetti della camera all'interno di un detergente ad ozono UV con un apporto di ossigeno e vuoto.Accendere la luce UV e illuminare per tre-cinque minuti per consentire all'adesivo di polimerizzare. Estrarre i vetrini di copertura e testare le camere per le perdite, quindi scartare le camere che perdono. Lavare ogni camera con tampone di formazione SLB, lasciando 100 microlitri di tampone all'estremità.Segnare il livello del tampone a 100 microlitri con un pennarello permanente, quindi aggiungere due microlitri di cloruro di calcio molare 0,1 alla camera, seguiti da otto microlitri della soluzione SUV in ciascuna camera e incubare per 15 minuti a 25 gradi Celsius. Rimuovere 50 microlitri del tampone di formazione SLB, lasciando solo 50 microlitri nella camera del campione, quindi aggiungere 100 microlitri di un XKMEH alla camera e mescolare delicatamente. Rimuovere 100 microlitri del tampone senza toccare il fondo.Ripetere i lavaggi da otto a 10 volte aggiungendo 100 microlitri di un XKMEH e rimuovendo 100 microlitri. Aggiungere 10 microlitri di un milligrammo per millilitro di beta-caseina al doppio strato, mescolare delicatamente e incubare per cinque a 10 minuti a temperatura ambiente. Lavare via la beta-caseina tre volte con un XKMEH e riportare il livello del tampone al segno di 100 microlitri.Durante l'incubazione della beta-caseina, estrarre un'aliquota della proteina linker membrana-actina per meno 80 gradi Celsius scongelata rapidamente a 37 gradi Celsius, quindi tenerla sul ghiaccio. Diluire l'aliquota con tampone di diluizione proteica fino ad una concentrazione di un micromolare. Aggiungere la proteina linker alla soluzione ad una concentrazione finale definita e mescolare delicatamente.Incubare per 30-40 minuti a temperatura ambiente e lavare da tre a cinque volte con un tampone XKMEH per rimuovere la proteina HSE non legata. Riportare il livello del tampone in ogni camera al segno di 100 microlitri. Il campione è ora pronto per l'imaging.Accendi il microscopio, i laser di eccitazione e le telecamere di rilevamento. Assicurati che il laser sia allineato, che l'obiettivo sia pulito e che il software sia pronto per acquisire immagini. Mettere l'olio sull'obiettivo 100 volte, montare il campione sul palco del microscopio e focalizzare l'obiettivo sul doppio strato.Assicurarsi che la posizione del laser sia tale da subire una riflessione interna totale sul campione. Utilizzare un'eccitazione a 488 nanometri. Per determinare l'integrità del doppio strato, eseguire un rapido test FRAP selezionando una regione di interesse sul bistrato e registrando alcune immagini del campo visivo utilizzando condizioni di imaging che forniscono un rapporto segnale/rumore di cinque a uno o superiore.Mettere in pausa la registrazione e chiudere il diaframma di campo del microscopio TIRF per focalizzare un raggio laser concentrato su una piccola regione circolare del doppio strato per sbiancare localmente i fluorofori. Accendere il laser alla sua massima potenza per fotosbiancare la piccola regione da tre a 10 secondi, quindi spegnere il laser. Riaprire il diaframma di campo al suo raggio originale, regolare nuovamente le condizioni di imaging alle impostazioni pre-candeggina e riprendere immediatamente la registrazione del recupero del segnale fluorescente nel campo visivo.Controlla se il bilayer è fluido e salva le immagini come file TIF a 16 bit. Mescolare G-actina non etichettata e marcata con fluorescenza in un rapporto molare di 10 a uno e rabboccare con G-buffer in modo che la concentrazione di G-actina sia di 20 micromolari. Aggiungere un decimo di 10 volte il tampone ME alla miscela per una soluzione una tantum e incubare per due minuti a temperatura ambiente.Quindi, scongelare rapidamente la fiala di tappatura delle scorte proteiche a 37 gradi Celsius, quindi tenerla in ghiaccio. Diluire con G-buffer in modo tale che la concentrazione della proteina di tappatura sia ora il doppio della concentrazione finale desiderata, quindi aggiungere un volume uguale della soluzione proteica di copertura diluita alla miscela di actina. Infine, aggiungere un volume uguale di tampone target fresco due volte al mix di reazione.Il volume finale della soluzione dovrebbe essere quattro volte il volume della miscela di actina. Assicurarsi che la concentrazione finale dei componenti sia quella descritta nel manoscritto testuale. Incubare i campioni al buio a 25 gradi Celsius per 45-60 minuti per consentire la polimerizzazione.Pipettare delicatamente cinque actina polimerizzata micromolare con una punta di pipetta smussata e aggiungerla a un tubo PCR autoclavato pulito. Aggiungere un XKMEH al tubo per rendere il volume finale più di 20 microlitri e mescolare delicatamente per evitare di tagliare F-actina. Dalla camera di campionamento montata, rimuovere un volume uguale del buffer.Aggiungere la soluzione polimerizzata di actina alla camera e pipettare delicatamente su e giù tre volte senza toccare il doppio strato sul fondo. Montare il campione sul microscopio TIRF e lasciarlo riposare per 20-30 minuti. Registra alcune immagini da diversi campi visivi dopo che l'aggiunta di F-actin ha raggiunto uno stato stazionario.Dopo 30 minuti di incubazione dell'actina, montare nuovamente il campione sul microscopio. Controllare il segnale sulla proteina linker e sui canali F-actina. Regolare le condizioni di imaging, se necessario.Seleziona una buona regione per una registrazione time-lapse lunga. Registra da 10 a 15 fotogrammi da 0,1 a 0,2 hertz prima dell'aggiunta di miosina e metti in pausa la registrazione. Pipettare il volume richiesto di miosina muscolare riciclata due dal flaconcino di riserva con una punta di pipetta smussata e aggiungere a un tubo PCR autoclavato pulito.Aggiungere immediatamente un XKMEH al tubo per rendere il volume più di 20 microlitri e mescolare delicatamente. Rimuovere con cautela un volume uguale del tampone KMEH dalla camera del campione montata senza disturbarlo e aggiungere delicatamente la soluzione di miosina alla camera del campione. Non pipettare su e giù, poiché disturberebbe i filamenti legati alla superficie.Riprendi immediatamente la registrazione time-lapse e salva tutte le immagini, quindi scatta immagini di sfondo per tutti i canali utilizzando un campione solo buffer. Salva tutte le immagini come file TIF. Il valore adattato del coefficiente di diffusione era di 1,34 micrometri quadrati al secondo, che concordava strettamente con il valore calcolato basato sulla formula di 1,39 micrometri quadrati al secondo.Il profilo di linea dopo il fotosbiancamento e il profilo di recupero della regione sbiancata si adattano rispettivamente alle equazioni quattro e cinque. La frazione mobile del doppio strato lipidico che rappresenta la frazione della popolazione sbiancata che recupera era maggiore di 0,9, indicando un buon doppio strato lipidico. L'attività della miosina ha indotto flussi di actomiosina contrattile che sono emersi in strutture astro-simili allo stato stazionario, guidando il raggruppamento locale della componente della membrana accoppiata.Si può usare una varietà di tecniche di microscopia come la microscopia a scattering interferometrico per studiare la dinamica delle reti di actomiosina non etichettate senza indurre alcun danno fotografico, o utilizzare la microscopia a fluorescenza a super risoluzione. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori interessati a capire come i complessi proteici di membrana interagiscono con una rete dinamica di actomiosina per modulare la loro architettura e composizione.

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Biologia

Descriviamo un protocollo per la preparazione di doppi strati lipidici supportati e la sua caratterizzazione utilizzando la microscopia a forza atomica e la spettroscopia a forza.

Atomic Force Microscopy Imaging e Spettroscopia Forza supportati doppi strati lipidici

Qui, vi presentiamo un protocollo per rilevare, eventi di fusione singoli SNARE-mediata tra liposomi e bistrati supportati in canali microfluidica utilizzando TIRFM polarizzata, con sensibilità singola molecola e ~ 15 risoluzione temporale msec. Lipidi e il rilascio del carico solubili possono essere rilevati simultaneamente. dimensioni liposomi, diffusività dei lipidi, e poro di fusione proprietà sono misurate.

Fusion SNARE-mediata del singolo proteoliposomi con bilayers Tethered supportati in una cella di flusso Microfluidic monitorati da polarizzata microscopia TIRF

Questo articolo descrive un metodo per valutare le interazioni e gli assemblaggi di proteine integrali di membrana in vitro con vari fattori partner in un ambiente lipidico-prossimale.

Utilizzando impalcatura liposomi per ricostituire interazioni proteina-proteina lipidi-prossimale In Vitro

Forniamo un protocollo per in vitro test di auto-organizzazione della mente e la mia su un doppio strato lipidico supportati in una camera aperta. Inoltre, descriviamo come racchiudere il dosaggio del lipido-clad PDMS microcompartments per simulare condizioni in vivo di confinamento di reazione.

In Vitro Ricostituzione di Self-Organizing pattern proteico su lipidici supportati

La fusione mitocondriale è un'importante reazione omeostatica alla base delle dinamiche mitocondriali. Descritto qui è un sistema di ricostituzione in vitro per studiare la fusione mitocondriale interno-membrana che può risolvere il tethering della membrana, docking, emifusione, e l'apertura pore. Viene discussa la versatilità di questo approccio nell'esplorazione dei sistemi a membrana cellulare.

Una piattaforma di membrana modello per la ricostituzione delle dinamiche della membrana mitocondriale

Questo protocollo descrive la formazione di vescicole unilipidiche e multilipidiche, doppi strati lipidici supportati e doppi strati lipidici sospesi. Questi modelli in vitro possono essere adattati per incorporare una varietà di tipi di lipidi e possono essere utilizzati per studiare varie interazioni molecolari e macromolecole.

Assemblaggio di modelli di doppio strato lipidico supportati e sospesi per lo studio delle interazioni molecolari

Questo articolo introduce un metodo semplice per la produzione rapida di vescicole unilamellari giganti con proteine citoscheletriche incapsulate. Il metodo si rivela utile per la ricostituzione bottom-up delle strutture citoscheletriche nelle interazioni confinamento e citoscheletro-membrana.

Incapsulamento rapido del citoscheletro ricostituito all'interno di vescicole unilamellari giganti

In questo manoscritto, dimostriamo le tecniche sperimentali per incapsulare il citoscheletro F-actina in vescicole lipidiche unilamellari giganti (chiamate anche liposomi) e il metodo per formare uno strato di F-actina che imita la corteccia nel foglietto interno della membrana liposomiale.

In vitro Ricostituzione del citoscheletro di actina all'interno di vescicole unilamellari giganti

Questo protocollo è una guida per la visualizzazione dinamica di actina e microtubuli utilizzando un test di microscopia a fluorescenza interna totale (TIRF) in vitro .

Visualizzazione delle dinamiche di accoppiamento di actina e microtubuli in vitro mediante microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF)

La ricostituzione senza cellule è stata uno strumento chiave per comprendere l'assemblaggio del citoscheletro e il lavoro nell'ultimo decennio ha stabilito approcci per studiare la dinamica della settina in sistemi minimi. Qui sono presentati tre metodi complementari per osservare l'assemblaggio della settina in diversi contesti di membrana: doppi strati planari, supporti sferici e supporti per aste.

Ricostituzione dell'assemblaggio di septina alle membrane per lo studio delle proprietà e delle funzioni biofisiche

Qui, presentiamo metodi per la preparazione di assemblaggi di actina quasi bidimensionali (2D) entangled, reticolati e a cristalli liquidi da proteine purificate.

Regolazione delle modalità di contrattilità e deformazione di assemblaggi attivi basati su actina in vitro: dalle reti attive bidimensionali alle gocce di cristalli liquidi

Scopri come assemblare reti di actomiosina legate alla membrana su doppi strati lipidici supportati per studiare la dinamica citoscheletrica con microscopia a fluorescenza. Questo metodo versatile consente l'aggiunta sequenziale di proteine senza compromettere l'integrità della rete.

Ricostituzione di cortecce di actina minima legate alla membrana su doppi strati lipidici supportati

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