Dimostrazione dell'allineamento delle sequenze per prevedere lo strumento di suscettibilità tra le specie per una rapida valutazione della conservazione delle proteine

Nel contesto della sicurezza chimica, il protocollo SeqAPASS fornisce un processo rapido e semplificato per valutare la conservazione delle proteine attraverso la diversità delle specie, per l'estrapolazione sia della tossicità che della conoscenza dei percorsi biologici. SeqAPASS è stato sviluppato come un'interfaccia web semplificata, trasparente e user-friendly per una rapida estrapolazione tra specie, destinata sia ai ricercatori che ai responsabili delle decisioni. Lo strumento affronta la sfida di estrapolare le conoscenze sulla tossicità chimica utilizzando le informazioni disponibili sulla sensibilità delle specie, per prevedere costantemente la suscettibilità chimica per centinaia di migliaia di specie che non potrebbero mai essere testate in un ambiente di laboratorio.

Per iniziare a lavorare con lo strumento SeqAPASS, passare innanzitutto a seqapass.epa.gov. Gli utenti esistenti possono selezionare il pulsante di accesso al tuo account. I nuovi utenti possono creare un account selezionando il link sulla home page.

Dopo aver effettuato l'accesso allo strumento SeqAPASS, vai alla scheda Richiedi esecuzione SeqAPASS. SeqAPASS include diverse risorse utili per aiutare gli utenti a identificare un target proteico di query. È possibile accedervi facendo clic sui pulsanti a discesa sotto Identifica un bersaglio proteico.

Una volta identificato un bersaglio proteico, fare clic su Per specie o Per adesione in Confronta sequenze di amminoacidi primari. Ad esempio, per analizzare la conservazione del recettore mu degli oppioidi, fare clic su Per adesione e immettere il numero di adesione nella casella di adesione della proteina. A meno che l'utente non abbia già identificato un'adesione proteica, si consiglia l'opzione di ricerca delle specie.

Selezionare Esegui richiesta per avviare la query. Una volta inviata la query, selezionare la scheda SeqAPASS Run Status nella parte superiore della pagina per visualizzare lo stato dell'esecuzione inviata. Il tempo di completamento dipenderà dall'utilizzo corrente dell'utensile.

Nella scheda Visualizza report SeqAPASS, sono elencate tutte le esecuzioni condotte con un determinato account. Selezionare Visualizza report per visualizzare i dati nel browser Web e fare clic su Richiedi report selezionato per aprire la pagina Query Protein Information di livello uno e visualizzare i risultati e le opzioni di personalizzazione dei dati. Per sviluppare ed eseguire un'analisi SeqAPASS di livello due, valutando la conservazione di domini proteici specifici, fare clic sul segno più accanto all'intestazione di livello due nella pagina Informazioni sulle proteine della query di livello uno per popolare il menu di query di livello due.

Fare clic sulla casella Seleziona dominio per popolare un elenco di domini funzionali per la proteina della query. Una volta identificato un dominio dal database dei domini conservati NCBI e selezionato nell'elenco a discesa SeqAPASS, avviare la query di livello due. Questa operazione viene eseguita facendo clic sul pulsante Esegui richiedi dominio.

Fare clic su Aggiorna esecuzioni di livello due e tre per popolare i dati di livello due. In Visualizza dati di livello due fare clic sulla casella Seleziona dominio completato per selezionare l'accesso al dominio completato. È quindi possibile fare clic sul pulsante Visualizza dati di livello due per aprire i risultati.

I dati vengono visualizzati nella scheda Visualizza SeqAPASS per il livello selezionato, per prima cosa, diamo un'occhiata ai dati di livello uno. Nella pagina Query Protein Information selezionare il pulsante di opzione accanto al report principale o completo per visualizzare i dati in formato condensato o espanso. Le specie avranno una previsione di suscettibilità di sì o no, indicando se la proteina è conservata rispetto alla sequenza di query.

All'interno del rapporto, fare clic sull'accesso proteico appropriato o sull'ID della specie per collegarsi ai database NCBI e accedere a ulteriori informazioni. Per esplorare i dati di tossicità corrispondenti per le specie con previsioni di suscettibilità, scorrere fino al lato destro della tabella Risultati per visualizzare la colonna ECOTOX. Fare clic sui collegamenti per aprire la specie in questione all'interno della knowledge base di ECOTOXicology, dove è possibile trovare i dati sulla tossicità Oltre ai rapporti completi e primari, è possibile visualizzare un rapporto di riepilogo dei dati selezionando Visualizza rapporto di riepilogo di livello uno.

Il rapporto di riepilogo visualizza metriche di riepilogo e previsioni di suscettibilità tra i gruppi tassonomici. I dati in qualsiasi formato di report possono essere facilmente scaricati. Con il tipo di report desiderato selezionato, fare clic su Scarica tabella per salvarlo come file di foglio di calcolo.

Per visualizzare i dati di livello due, scorrere fino alla parte superiore della scheda Visualizza SeqAPASS e selezionare Livello due. I dati SeqAPASS di livello due vengono visualizzati in report come quello del livello uno ed è disponibile anche nella parte inferiore della pagina Query Protein Information. Selezionare il pulsante di opzione accanto al tipo di report desiderato per visualizzare i dati.

I rapporti di livello due mostrano informazioni simili a quelle del livello uno, con informazioni aggiuntive sul dominio proteico. I dati SeqAPASS possono essere facilmente visualizzati per facilitare l'interpretazione. Fare clic sul segno più accanto a Visualizzazione, seguito dal pulsante Visualizza dati, per aprire un BoxPlot interattivo in una nuova scheda.

Nella nuova scheda, selezionare il pulsante BoxPlot. Nella parte superiore della pagina BoxPlot, le opzioni di controllo possono aiutare l'utente a personalizzare il grafico. Gli utenti possono aggiungere o rimuovere gruppi tassonomici dal grafico, possono selezionare le specie da visualizzare in una legenda, scegliere come visualizzare i nomi delle specie ed evidenziare sottoinsiemi di specie specifiche, come specie minacciate o in via di estinzione.

Le visualizzazioni possono essere facilmente esportate e salvate. Fate clic su Scarica BoxPlot (Download BoxPlot) per selezionare un tipo di file e scaricare la figura. Prima del download, gli utenti possono personalizzare la risoluzione del tipo di file dell'immagine.

Sebbene le impostazioni predefinite del report siano sufficienti per la maggior parte delle analisi, i parametri possono essere modificati utilizzando i sottomenu nella parte superiore del menu Query Protein Information. Per registrare le impostazioni correnti del report, fare clic sul pulsante Scarica impostazioni report correnti per scaricare un file che acquisisce le impostazioni correnti applicate. Questo può essere fatto per il livello uno e il livello due.

Qui l'esempio è per il livello uno. Per avviare un'analisi SeqAPASS di livello tre, passare alla pagina Informazioni sulle proteine della query di livello uno e fare clic sul segno più accanto all'intestazione di livello tre per popolare il menu di query di livello tre che consente di confrontare i singoli residui di amminoacidi. Prima di poter condurre un'analisi di livello tre, è necessario identificare specifici residui di amminoacidi attraverso una revisione della letteratura esistente.

Fare clic sul segno più accanto a Esplora riferimenti per aprire lo strumento Esplora riferimenti. In questo modo è possibile generare una stringa booleana predefinita per eseguire query sulla documentazione disponibile. Fai clic sul link Genera Google Scholar per generare una stringa di ricerca bibliografica.

Questo può essere copiato e utilizzato per cercare i database di letteratura desiderati. In alternativa, selezionando Cerca in Google Scholar, verrà eseguita automaticamente una ricerca nella letteratura di Google Scholar utilizzando la stringa di ricerca predefinita. Una volta selezionati i residui di aminoacidi, gli utenti possono impostare un'analisi di livello tre.

Selezionare la sequenza di modelli a cui verranno allineate e confrontate le specie selezionate dall'utente. Facoltativamente, è possibile immettere sequenze di modelli aggiuntive nella casella Confronti aggiuntivi. Prima di allineare sequenze specifiche, gli utenti devono immettere un nome di esecuzione definito dall'utente.

Questo verrà utilizzato per identificare l'esecuzione. Selezionare il gruppo tassonomico nella casella Scegli gruppo tassonomico. Va notato che questo processo sarà ripetuto per tutti i gruppi tassonomici per i quali l'utente vorrebbe valutare per la conservazione.

Una volta selezionate tutte le specie desiderate per l'allineamento alla sequenza del modello, selezionare Richiedi esecuzione residui. Una volta che tutte le specie sono state allineate, fare clic su Aggiorna esecuzioni di livello due e tre per popolare il menu Seleziona nome corsa di livello tre con i processi di livello tre completati. I dati di livello tre possono essere visualizzati per singolo gruppo tassonomico o per più gruppi tassonomici.

Fare clic su Combina dati di livello tre per aprire la finestra di dialogo combinata di livello tre e analizzare contemporaneamente più gruppi tassonomici. Utilizzando la finestra di dialogo Combina report di livello tre, selezionare il modello di livello tre da utilizzare come base per il confronto. Quindi, scegli quali lavori completati confrontare.

Ordinare i processi di livello tre in base alle esigenze e fare clic su Visualizza dati di livello tre per creare una pagina di report di livello tre. Nella pagina Informazioni sulle proteine del modello di livello tre, vengono visualizzate le posizioni degli amminoacidi precedentemente identificate dalla sequenza del modello e possono essere selezionate per l'allineamento. Immettete le posizioni nella casella di testo separate da virgole o, in alternativa, selezionatele dall'elenco dei residui.

Una volta immesse tutte le posizioni, selezionare Copia nell'elenco dei residui per spostare i residui nella casella di selezione. Una volta selezionate e controllate l'accuratezza di tutte le posizioni degli amminoacidi, fare clic su Aggiorna rapporto per aggiornare le sequenze allineate con le posizioni specificate. Scorri fino alla fine della pagina per visualizzare un rapporto dei risultati.

Come i livelli precedenti, selezionare il pulsante di opzione accanto al report principale o completo per selezionare il tipo di report. I rapporti di livello tre mostrano specie e proteine simili e includono informazioni di allineamento e conservazione per ciascun residuo di amminoacidi valutato. Per salvare il report, fare clic su Scarica tabella nella parte inferiore del report e salvarlo come file di foglio di calcolo.

Gli utenti possono anche selezionare Visualizza report di riepilogo di livello tre per visualizzare e scaricare una tabella di report di riepilogo. Per visualizzare una visualizzazione per i dati di livello tre, fare clic sul segno più accanto all'intestazione della visualizzazione e selezionare Visualizza dati per aprire una nuova pagina. Fare clic su Mappa termica nella pagina delle informazioni di visualizzazione per aprire l'immagine interattiva e i controlli.

Nella pagina di visualizzazione in Controlli, selezionare i gruppi tassonomici da visualizzare nella mappa termica, spostarli utilizzando il pulsante freccia e riordinarli se lo si desidera. Per impostazione predefinita, la visualizzazione della mappa di calore visualizza il nome comune della specie, le previsioni di suscettibilità complessiva e lo stato di corrispondenza di ciascun residuo di amminoacidi. Le opzioni per la manipolazione delle impostazioni della mappa di calore si trovano nei menu espandibili sotto l'intestazione Controllo.

In Opzioni report è possibile selezionare un report semplice o completo e alternare le specie visualizzate tra nomi comuni o scientifici. In Selezioni facoltative, sottoinsiemi di specie, come candidati ortolog, specie minacciate, specie in via di estinzione e organismi modello comuni, possono essere selezionati ed evidenziati nella mappa di calore. In Impostazioni mappa di calore, le informazioni visualizzate sulla mappa di calore possono essere personalizzate, deselezionando e selezionando le caselle.

Le previsioni di suscettibilità e il testo di suscettibilità possono essere rimossi e gli allineamenti degli amminoacidi e le informazioni sugli amminoacidi possono essere rimossi. Per salvare la visualizzazione della mappa di calore, fare clic su Scarica mappa di calore e scegliere il tipo di file desiderato. SeqAPASS dispone di un rapporto di riepilogo delle decisioni, che consente agli utenti di valutare rapidamente le previsioni di suscettibilità tra livelli e specie contemporaneamente.

Facendo clic su Push Level to DS Report nelle pagine Risultati o Visualizzazione dati, i dati vengono trasferiti nella scheda Report DS, dove è possibile combinare e visualizzare tutti i livelli di analisi. I risultati dell'analisi di livello uno per il recettore mu degli oppioidi mostrano un cutoff di suscettibilità del 55% con somiglianze percentuali per mammiferi, uccelli, rettili, anfibi e la maggior parte delle specie ittiche che cadono al di sopra di questo limite e ricevono una previsione di suscettibilità di Sì. Quelle caselle completamente al di sotto del limite ricevono una previsione di suscettibilità di un no.

L'analisi di livello due per il dominio funzionale degli oppioidi mu ha identificato un cutoff di suscettibilità più elevato dell'88% di somiglianza con mammiferi, uccelli, rettili, anfibi e la maggior parte delle specie ittiche al di sopra di questo limite, fornendo un'altra linea di prova per la conservazione o il recettore mu oppioide tra i vertebrati. All'interno dell'analisi di livello tre, tutte le specie valutate hanno portato a una previsione di suscettibilità di sì. Poiché questi aminoacidi sono importanti nel legame sia dei forti agonisti del recettore mu oppioide che dei forti antagonisti, questi dati suggeriscono che i composti oppioidi che prendono di mira i recettori umani possono interagire in modo simile con i recettori tra le specie di vertebrati.

Il terzo livello di SeqAPASS è utile per la generazione di ipotesi. Anche se i residui di amminoacidi critici non sono noti per la proteina di interesse, lo strumento può essere utilizzato per esaminare le specie e identificare dove esiste la conservazione o è meno conservata. Queste ipotesi possono quindi essere testate con tecniche di biologia molecolare, come gli studi di mutagenesi sito-diretta.

L'obiettivo iniziale di SeqAPASS era sugli obiettivi chimici. Tuttavia, la nostra ricerca si sta espandendo per esplorare gli enzimi metabolizzanti primari, le proteine di trasporto e le proteine coinvolte nel bioaccumulo.