Name: Fabbricazione di microsfere porose altamente aperte (HOPM) tramite tecnologia microfluidica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 21 s
Description: Impara a fabbricare microsfere porose altamente aperte di PLGA tramite tecnologia microfluidica per ingegneria tissutale e screening farmacologico. Questo metodo migliora il ritenzione cellulare con pori di circa 50 micrometri.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SCL, YW, RKK e AZC riconoscono il sostegno finanziario della National Natural Science Foundation of China (NSFC, 32071323, 81971734 e U1605225) e del Program for Innovative Research Team in Science and Technology dell'Università della provincia del Fujian. YSZ non era supportato da nessuno di questi programmi né riceveva pagamenti di alcun tipo; invece, il sostegno del Brigham Research Institute è riconosciuto.

1. Preparazione delle soluzioni
<ol><li>Preparare preventivamente la soluzione madre di PVA riscaldandola a bagnomaria a 80 °C e successivamente mettendola in frigorifero a 4 °C. Raffreddare a temperatura ambiente (RT) per uso sperimentale.</li>
	<li>Preparare il precursore dell'emulsione aggiungendo la soluzione acquosa di gelatina (1 mL, 7,5%, p/v) alla fase organica di PLGA (2 mL, 2%, p/v in diclorometano, DCM) (vedere Tabella dei materiali). NOTA: Generalmente, la tecnologia microfluidica coinvolge diverse fasi per formare le microsfere. La fase continua o di raccolta comprende un poli(alcool vinilico) acquoso (PVA, 600 ml, 1%, p/v).</li>
</ol>2. Assemblaggio di dispositivi microfluidici a goccia e fabbricazione di PLGA-HOPM
NOTA: gli elementi di consumo necessari per questo assieme sono elencati nella tabella dei materiali.
<ol><li>Personalizzare l'assieme del generatore di gocce.<ol><li>Costruire un generatore microfluidico co-flow utilizzando un capillare di vetro (OD, 1 mm), tubi in PVC (ID, 1 mm) e un ago erogatore da 26 G.</li>
		<li>Collegare il capillare di vetro all'estremità del tubo in PVC e quindi forare con un ago al collegamento della struttura di cui sopra.</li>
		<li>Posizionare l'altra estremità del tubo in PVC nella fase continua durante la generazione di gocce. Utilizzando la colla UV, sigillare gli spazi vuoti sul giunto dopo la polimerizzazione. NOTA: L'ago deve essere piegato curvato di circa 45° per un comodo piercing sul tubo in PVC e la punta dell'ago allungata nel tubo capillare per formare la struttura coassiale.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparare la piattaforma microfluidica a goccia.<ol><li>Utilizzare due pompe a siringa, come mostrato nella Figura 1. Utilizzare una siringa da 50 ml per caricare la fase continua e una siringa da 5 ml per la formazione dell'emulsione.</li>
		<li>Impostare le portate delle fasi continua e di dispersione rispettivamente a 2 ml/min e 0,08 mL/min.</li>
		<li>Porre un becher da 500 mL in un bagno di ghiaccio e riempirlo con una soluzione acquosa di PVA preraffreddata (fase 1.1). NOTA: L'estremità del capillare di vetro deve essere immersa nella fase di raccolta. Si consiglia di agitare (1 h, 60 rpm) il surnatante della fase di raccolta con la bacchetta di vetro dopo la formazione di emulsione-goccioline nella piattaforma. Le goccioline di emulsione sono prodotte sulla punta dell'ago. In generale, il calibro dell'ago influenza la dimensione dei PM, in cui il calibro minore corrisponde alla dimensione più piccola dei PM. Inoltre, il diametro dei pori è principalmente correlato alla concentrazione di porogeno, in grado di aumentare con un'appropriata concentrazione di gelatina1.</li>
	</ol></li>
	<li>Eseguire l'emulsione e la generazione di goccioline.<ol><li>Preparare l'emulsione seguendo i passaggi seguenti.<ol><li>Preparare l'emulsione decantando immediatamente la soluzione acquosa di gelatina nella soluzione DCM di PLGA (fase 1.2) ed emulsionando utilizzando il dispositivo ad ultrasuoni (vedere Tabella dei materiali).</li>
			<li>Regolare la potenza ultrasonica a 400 W e impostare il tempo di elaborazione totale su 90 s (intervallo 2 s, trattamento ad ultrasuoni 1 s), accompagnato da una costante modifica manuale della posizione della sonda.</li>
			<li>Stabilizzare l'emulsione risultante per l'aspirazione della siringa e la generazione di goccioline in circa 20 minuti. NOTA: posizionare la sonda dell'interruttore a ultrasuoni nell'interfaccia olio-acqua. Si consiglia di non lasciare che la sonda ad ultrasuoni entri in contatto con il contenitore.</li>
		</ol></li>
		<li>Eseguire la generazione di gocce.<ol><li>Caricare rapidamente l'emulsione preparata (punto 2.3.1) nella siringa da 5 mL della piattaforma microfluidica dopo il trattamento ad ultrasuoni.</li>
			<li>Introdurre l'emulsione W/O instabile (che è in corso di separazione di fase) nel dispositivo microfluidico come fase discontinua. Allo stesso tempo, utilizzare la soluzione acquosa di PVA come fase continua.</li>
			<li>Raccogliere le microsfere contenenti l'emulsione sul fondo del becher di raccolta (PVA, 1%, p/v) dopo aver iniettato le porzioni appropriate dell'emulsione nel dispositivo microfluidico.</li>
			<li>Porre il campione a 4 °C durante la notte per un'ulteriore stabilizzazione.</li>
		</ol></li>
		<li>Risciacquare e liofilizzare le microsfere preparate (PLGA-HOPM) seguendo i passaggi seguenti. NOTA: I PLGA-HOPM generati contengono pori arbitrari all'interno e alla superficie.<ol><li>Conservare le microsfere a 4 °C prima di normalizzarle a RT e agitare con una bacchetta di vetro (1 h, 60 rpm) per eliminare il DCM residuo.</li>
			<li>Filtrare accuratamente la fase di raccolta nel becher da 500 ml e lavare tre volte le microsfere raccolte con acqua deionizzata per lavare via il PVA residuo sulla superficie dei PM.</li>
			<li>Posizionare le microsfere di PLGA nel bagnomaria a 37 °C per 30 minuti per sciogliere la gelatina avvolta nella spina dorsale del PLGA.</li>
			<li>Risciacquare due volte i PLGA-HOPM risultanti con acqua deionizzata per rimuovere la gelatina residua e pre-raffreddare per la liofilizzazione a -80 °C per 24 ore.</li>
			<li>Conservare i PLGA-HOPM asciutti a -20 °C per ulteriori esperimenti.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>3. Imaging al microscopio elettronico a scansione (SEM)
<ol><li>Depositare i PLGA-HOPM sullo stadio campione di SEM (vedi Tabella dei materiali) presso RT e inserire lo stadio campione nella cella di sputter dello sputter magnetron. Accendere il trasformatore e il magnetron uno per uno. Introdurre il campione nel SEM dopo essere stato rivestito d'oro per 1 minuto.</li>
	<li>Ottenere le immagini SEM impostando la tensione di accelerazione a 5 kV.</li>
	<li>Inoltre, quantificare la dimensione delle particelle dei PLGA-HOPM utilizzando 100 PM al campo variabile dell'imaging SEM. Misurare il risultato rappresentativo per quantificare la distribuzione delle dimensioni dei pori.<ol><li>Apri la grafica con Image J e usa la "linea retta" per abbinare la barra della scala dell'immagine SEM, che fa sì che il software identifichi il pixel in lunghezza.</li>
		<li>Fare clic su analizza > impostare la scala, impostare la "distanza nota" sulla barra della scala dell'immagine SEM e fare clic su > globale OK.</li>
		<li>Fare clic su analizza > Tools > ROI manager... per misurare la dimensione dei pori o delle particelle dei PM PLGA e fare clic su aggiungi. Misurare il numero di campioni in base al requisito.</li>
		<li>Fare clic su Misura per ottenere i dati quantitativi dei grafici per ulteriori calcoli.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Coltura cellulare e imaging a fluorescenza
NOTA: Per il presente lavoro sono state utilizzate cellule staminali mesenchimali del midollo osseo di ratto (BMSC). Le celle sono state ottenute da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali).
<ol><li>Coltura delle cellule nel mezzo Eagle modificato di Dulbecco integrato con L-glutammina (DMEM / F-12), siero bovino fetale al 10% (v / v) e penicillina / streptomicina all'1%. Incubare le cellule a 37 °C e 5% di CO2.</li>
	<li>Far passare i BMSC del ratto in un rapporto 1:2 dopo aver raggiunto il 90% di confluenza.</li>
	<li>Eseguire l'adesione cellulare seguendo i passaggi seguenti.<ol><li>Incubare i PLGA-HOPM con alcool etilico (5 ml, 70%, v/v) e centrifugare a 500 x g per 10 minuti a RT per sterilizzare.</li>
		<li>Lavare due volte i PLGA-HOPM sterilizzati con una soluzione tampone fosfato.</li>
		<li>Incubare gli HOPM (cinque in numero) con la sospensione cellulare (5 mL, 1 x 105 cellule/mL) in una provetta da centrifuga sterile (50 mL) in coltura dinamica per l'adesione dei BMSC ai PLGA-HEMP.</li>
		<li>Eseguire la coltura dinamica in uno shaker asettico termostatico (37 °C, 90 giri/min) posizionando una provetta da centrifuga sigillata da 50 mL nello shaker (vedere Tabella dei materiali). NOTA: La coltura dinamica intende migliorare il tasso di aderenza dei BMSC sugli scaffold, piuttosto che incubare direttamente i PM e le cellule sulla piastra di plastica. Le celle e i PM PLGA vengono aggiunti in una provetta sterile da centrifuga da 50 ml, incubando la provetta in uno shaker asettico termostatico (37 °C, 90 giri/min) e cambiando il fluido ogni 2 giorni.</li>
	</ol></li>
	<li>Eseguire il test a doppia colorazione vivo e morto.<ol><li>Risciacquare tre volte i PM carichi di cellule per eluire BMSC senza collegarli a PLGA-HEMP.</li>
		<li>Posizionare i PM carichi di celle sulla piastra di vetro da 35 mm. Aggiungere 1 mL di tampone colorante (vedere Tabella dei materiali), inclusi 1 μL di calceina-AM e ioduro di propidio (PI), rispettivamente, al campione prelavato PBS.</li>
		<li>Valutare i campioni mediante microscopia a scansione laser confocale (vedi Tabella dei materiali). Accendere la luce di eccitazione di 488 nm e 552 nm sul rilevatore corrispondente. Per l'analisi z-overlay, impostare la larghezza z per catturare i diversi strati del campione mediante il movimento dell'asse z del microscopio. NOTA: Vale la pena notare che le altre macchie possono essere opportunamente impiegate per l'analisi.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Kankala, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+porous+microcarriers+for+minimally+invasive+in+situ+skeletal+muscle+cell+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Highly porous microcarriers for minimally invasive in situ skeletal muscle cell delivery.</a> Small. 15 (25), 1901397(2019).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+endothelialized+hepatic+tumor+microtissues+for+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">Modeling endothelialized hepatic tumor microtissues for drug screening.</a> Advanced Science. 7 (21), 2002002(2020).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tripeptide-based+macroporous+hydrogel+improves+the+osteogenic+microenvironment+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Tripeptide-based macroporous hydrogel improves the osteogenic microenvironment of stem cells.</a> Journal of Materials Chemistry B. 9 (30), 6056-6067 (2021).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLGA+hybrid+porous+microspheres+as+human+periodontal+ligament+stem+cell+delivery+carriers+for+periodontal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Engineering+Journal%22%5BJournal%5D)">PLGA hybrid porous microspheres as human periodontal ligament stem cell delivery carriers for periodontal regeneration.</a> Chemical Engineering Journal. 420, 129703(2021).</li>
<li>Wei, P., Xu, Y., Zhang, H., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continued+sustained+insulin-releasing+PLGA+nanoparticles+modified+3D-printed+PCL+composite+scaffolds+for+osteochondral+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Engineering+Journal%22%5BJournal%5D)">Continued sustained insulin-releasing PLGA nanoparticles modified 3D-printed PCL composite scaffolds for osteochondral repair.</a> Chemical Engineering Journal. 422, 130051(2021).</li>
<li>Sang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatible+chitosan%2Fpolyethylene+glycol%2Fmulti-walled+carbon+nanotube+composite+scaffolds+for+neural+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Zhejiang+University-Science+B%22%5BJournal%5D)">Biocompatible chitosan/polyethylene glycol/multi-walled carbon nanotube composite scaffolds for neural tissue engineering.</a> Journal of Zhejiang University-Science B. 23 (1), 58-73 (2022).</li>
<li>Ghasemian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+characterization+within+a+spinner+flask+and+a+rotary+wall+vessel+for+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Engineering+Journal%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic characterization within a spinner flask and a rotary wall vessel for stem cell culture.</a> Biochemical Engineering Journal. 157, 107533(2020).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimally+invasive+co-injection+of+modular+micro-muscular+and+micro-vascular+tissues+improves+in+situ+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Minimally invasive co-injection of modular micro-muscular and micro-vascular tissues improves in situ skeletal muscle regeneration.</a> Biomaterials. 277, 121072(2021).</li>
<li>Kang, S. W., Bae, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservable+and+tumorigenic+three-dimensional+tumor+culture+in+porous+poly%28lactic-co-glycolic+acid%29+microsphere%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Cryopreservable and tumorigenic three-dimensional tumor culture in porous poly(lactic-co-glycolic acid) microsphere.</a> Biomaterials. 30 (25), 4227-4232 (2009).</li>
<li>Fan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoporous+silicon-PLGA+composite+microspheres+for+the+double+controlled+release+of+biomolecules+for+orthopedic+tissue+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Mesoporous silicon-PLGA composite microspheres for the double controlled release of biomolecules for orthopedic tissue Engineering.</a> Advanced Functional Materials. 22 (2), 282-293 (2012).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+balance+regulation+via+antagonist-functionalized+injectable+microsphere+for+nucleus+pulposus+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Metabolism balance regulation via antagonist-functionalized injectable microsphere for nucleus pulposus regeneration.</a> Advanced Functional Materials. 30 (52), 2006333(2020).</li>
<li>Yao, R., Zhang, R., Lin, F., Luan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+cell%2Fhydrogel+microspheres+induce+the+formation+of+fat+lobule-like+microtissues+and+vascularized+adipose+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Injectable cell/hydrogel microspheres induce the formation of fat lobule-like microtissues and vascularized adipose tissue regeneration.</a> Biofabrication. 4 (4), 045003(2012).</li>
<li>Sikavitsas, V. I., Bancroft, G. N., Mikos, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+three-dimensional+cell%2Fpolymer+constructs+for+bone+tissue+engineering+in+a+spinner+flask+and+a+rotating+wall+vessel+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Formation of three-dimensional cell/polymer constructs for bone tissue engineering in a spinner flask and a rotating wall vessel bioreactor.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 62 (1), 136-148 (2002).</li>
<li>Kim, T. K., Yoon, J. J., Lee, D. S., Park, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas+foamed+open+porous+biodegradable+polymeric+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Gas foamed open porous biodegradable polymeric microspheres.</a> Biomaterials. 27 (2), 152-159 (2006).</li>
<li>Wang, C. Y., Liao, H. F., Sheu, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+recombinant+human+macrophage+colony-stimulating+factor+production+using+culture+systems+with+porous+polymeric+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Taiwan+Institute+of+Chemical+Engineers%22%5BJournal%5D)">Enhancement of recombinant human macrophage colony-stimulating factor production using culture systems with porous polymeric microspheres.</a> Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers. 41 (2), 203-208 (2010).</li>
<li>Amoyav, B., Benny, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+based+fabrication+and+characterization+of+highly+porous+polymeric+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers%22%5BJournal%5D)">Microfluidic based fabrication and characterization of highly porous polymeric microspheres.</a> Polymers. 11 (3), 419(2019).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+fabrication+of+inhalable+large+porous+microspheres+loaded+with+H2S-releasing+aspirin+derivative+for+pulmonary+arterial+hypertension+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Microfluidic fabrication of inhalable large porous microspheres loaded with H2S-releasing aspirin derivative for pulmonary arterial hypertension therapy.</a> Journal of Controlled Release. 329, 286-298 (2021).</li>
<li>Qu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+open-porous+PLGA+microspheres+as+cell+carriers+for+cartilage+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Injectable open-porous PLGA microspheres as cell carriers for cartilage regeneration.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 109 (11), 2091-2100 (2021).</li>
<li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+droplet-based+functional+materials+for+cell+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic droplet-based functional materials for cell manipulation.</a> Lab on a Chip. 21 (22), 4311-4329 (2021).</li>
<li>Kawakatsu, T., Kikuchi, Y., Nakajima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular-sized+cell+creation+in+microchannel+emulsification+by+visual+microprocessing+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Oil+Chemists%27+Society%22%5BJournal%5D)">Regular-sized cell creation in microchannel emulsification by visual microprocessing method.</a> Journal of the American Oil Chemists' Society. 74 (3), 317-321 (1997).</li>
<li>Yu, Y., Shang, L., Guo, J., Wang, J., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+capillary+microfluidics+for+spinning+cell-laden+microfibers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Design of capillary microfluidics for spinning cell-laden microfibers.</a> Nature Protocols. 13 (11), 2557-2579 (2018).</li>
<li>Ye, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photonic+crystal+microcapsules+for+label-free+multiplex+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Photonic crystal microcapsules for label-free multiplex detection.</a> Advanced Materials. 26 (20), 3270-3274 (2014).</li>
<li>Zhong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zn%2FSr+dual+ions-collagen+co-assembly+hydroxyapatite+enhances+bone+regeneration+through+procedural+osteo-immunomodulation+and+osteogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Bioactive+Materials%22%5BJournal%5D)">Zn/Sr dual ions-collagen co-assembly hydroxyapatite enhances bone regeneration through procedural osteo-immunomodulation and osteogenesis.</a> Bioactive Materials. 10, 195-206 (2022).</li>
<li>Poole, C. A., Brookes, N. H., Clover, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratocyte+networks+visualized+in+the+living+cornea+using+vital+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Keratocyte networks visualized in the living cornea using vital dyes.</a> Journal of Cell Science. 106 (2), 685-692 (1993).</li>
<li>Gentile, P., Chiono, V., Carmagnola, I., Hatton, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+poly%28lactic-co-glycolic%29+acid+%28PLGA%29-based+biomaterials+for+bone+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">An overview of poly(lactic-co-glycolic) acid (PLGA)-based biomaterials for bone tissue engineering.</a> International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 3640-3659 (2014).</li>
<li>Lanao, R. P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physicochemical+properties+and+applications+of+Poly%28lactic-co-glycolic+acid%29+for+use+in+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B-Reviews%22%5BJournal%5D)">Physicochemical properties and applications of Poly(lactic-co-glycolic acid) for use in bone regeneration.</a> Tissue Engineering Part B-Reviews. 19 (4), 380-390 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo articolo descrive una strategia efficiente per fabbricare architetture basate su PLGA, vale a dire i PLGA-OPM. Va notato che diversi passaggi critici devono essere presi con attenzione, tra cui evitare la volatilizzazione del solvente del PLGA e regolare delicatamente la potenza ultrasonica nella posizione target durante la preparazione dell'emulsione. Inoltre, l'uscita del liquido della siringa da 20 mL può essere regolata in una certa misura per risolvere la separazione di fase dei precursori emulsionati. Tuttav...

Le microsfere cariche di cellule offrono vantaggi favorevoli, come una maggiore capacità di ritenzione cellulare in situ, una consegna efficiente delle cellule e la successiva capacità di proliferazione cellulare in vivo1. Ad oggi, sono state avanzate numerose indagini per lo sviluppo di una struttura di impalcatura di successo per supportare un ambiente favorevole per le cellule per la rigenerazione dei tessuti o applicazioni di screening farmacologico2. Tuttavia, l'ambiente di ipossia è spesso inevitabile negli interni a causa di insufficienti forniture di nutrienti / ossigeno e accumulo di rifiuti metabolici3. Per ovviare a questi problemi, sono state sviluppate microsfere altamente porose (PM) utilizzando vari biomateriali 4,5,6. Inoltre, nella coltura dinamica, gli scaffold soffrono di eccessivo sforzo di taglio7 e lo stato instabile del terreno di coltura potrebbe rompere la fedeltà dei PM. In alternativa, il poli(acido lattico-co-glicolico) (PLGA) potrebbe essere utilizzato per trattare PM con buona resistenza meccanica per coltura dinamica1. Ad esempio, abbiamo dimostrato la co-iniezione di PMs altamente aperti (HOPM) PLGA carichi di mioblasti di topo (C2C12) e microrod cavi carichi di poli(glicole etilenico) carichi di poli(glicole etilenico) di topo per guarire la perdita muscolare volumetrica, ottenendo un notevole miglioramento della rigenerazione del muscolo scheletrico in situ 8.
In particolare, i PM sono caratterizzati da ampie aree superficiali e da elevate porosità, che è di interesse specifico per l'adesione cellulare e la crescita verso la consegna cellulare minimamente invasiva9. In considerazione di questi aspetti, sono stati impiegati vari materiali biocompatibili per fabbricare i PM10,11. Questi PM progettabili in cocoltura con cellule offrono un'adesione eccellente, una notevole resistenza meccanica e finestre altamente interconnesse, che potrebbero migliorare la proliferazione cellulare per riparare i tessuti danneggiati12. A questo proposito, sono state sviluppate anche varie tecnologie per fabbricare sfere porose13,14. Da un lato, i PM sono stati prodotti utilizzando agenti che formano gas, come NH4HCO3, che sono stati trattenuti a causa dell'insufficiente interconnettività15,16,17. D'altra parte, i PM sono stati direttamente tranciati dopo l'emulsione, il che ha portato a PM polidispersi18. Alla fine, la tecnologia microfluidica a goccia basata sull'approccio del modello di emulsione è forse un metodo efficiente per costruire PM, poiché spesso si traduce in particelle di dimensioni uniformi19. In particolare, gli attributi morfologici delle microsfere spesso dipendono dalla qualità delle goccioline di emulsione generate (cioè acqua-in-olio, W/O, o olio-in-acqua, O/W), che possono influenzare significativamente gli attributi dei biomateriali20. Vale la pena notare che la piattaforma microfluidica preprogettata può essere applicata per generare le microfibre o le microsfere. In un esempio, Yu et al. hanno dimostrato la produzione di strutture microfibrose cariche di cellule basate su piattaforme microfluidiche capillari, che potrebbero essere utilizzate per assemblare reti cellulari per imitare i tessuti naturali21. In un altro caso, Ye et al. hanno fabbricato microcapsule di cristalli fotonici mediante la replicazione modello di perle di cristallo colloidale di silice attraverso tecnologie microfluidiche, che potrebbero superare molti limiti delle attuali tecniche che richiedono un'etichettatura complessa e un apparato specifico22.
In effetti, la logica alla base dell'utilizzo di questa tecnica è dovuta a vari vantaggi, come la sua natura facile, che non richiede attrezzature sofisticate e la sua convenienza nel sintetizzare PM di dimensioni uniformi per la consegna di cellule e applicazioni di medicina rigenerativa. In questo contesto, con componenti predefiniti di emulsione-templating, i PM con elevate porosità e interconnettività possono essere comodamente ottenuti da un dispositivo microfluidico assemblato da tubi di poli(cloruro di vinile) (PVC), un capillare di vetro e un ago. Un precursore di emulsione W/O viene preparato omogeneizzando una soluzione acquosa di gelatina e una soluzione organica di PLGA. Iniettando selettivamente la porzione applicabile dell'emulsione nella piattaforma microfluidica, vengono fabbricati i PM con dimensioni uniformi delle particelle e pori interconnessi attraverso la superficie fino all'interno. Il presente protocollo mira a fabbricare i PLGA-HOPM mediante emulsione-templating nella piattaforma microfluidica. Si ritiene che questo protocollo consenta la produzione riproducibile di PLGA-HOPM e sarà potenzialmente applicabile nei loro campi correlati di ingegneria tissutale e screening farmacologico.

<table><tbody><tr><td>Provetta da centrifuga</td><td>Solarbio, Pechino, Cina</td><td></td><td>5 mL & 50 mL (sterilità)</td></tr><tr><td>Microscopia confocale a scansione laser</td><td>Leica, Wetzlar, Germania</td><td></td><td>TCS SP8</td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, Cina</td><td>20161110</td> Ago di erogazione <td>di grado di ricerca</td></tr><tr><td></td><td>Kindly, Shanghai, Cina</td><td></td><td>26 G, ID: 250 &mu; m, OD: 460 &mu; m</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco; Life Technologies Corporation, Calsbad, USA</td><td>15400054</td><td>DMEM/F-12 50/50, 1x (Dulbecco's Mod. Di Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) con L-glutammina</td></tr><tr><td>alcol etilico</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, Cina</td><td>20210918</td><td>Grado di ricerca</td></tr><tr><td>Acido etil-endiamminotetraacetico (EDTA)-tripsina</td><td>Industrie biologiche, Kibbutz Beit-Haemek, Isra</td><td></td><td>Tripsina (0,25%), EDTA (0,02%)</td></tr><tr><td>Siero bovino fetale (FBS)</td><td>Industrie biologiche, Kibbutz Beit-Haemek, Isra</td><td></td> Liofilizzatore di <td>grado di ricerca</td></tr><tr><td></td><td>Bilon, Shanghai, Cina</td><td></td><td>FD-1B-50</td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA</td><td>lotto # SZBF2870V</td><td>Dalla pelle di maiale, Tipo A</td></tr><tr><td>Piastra inferiore in vetro</td><td>Biosharp, Hefei, Cina</td><td></td><td>BS-15-GJM, 35 mm</td></tr><tr><td>Capillare in vetro</td><td>Huaou, Jiangsu, Cina</td><td></td><td>0,9-1,1 e volte; 120 mm</td></tr><tr><td>Agitatore per incubatore</td><td>Zhicheng, Shanghai, Cina</td><td>ZWYR-200D</td><td></td></tr><tr><td>Kit per l'imaging di cellule morte vive</td><td>Solarbio, Pechino, Cina</td><td>60421211112</td><td>Fluorescenza verde in cellule vive (es/em 488 nm/515 nm). Fluorescenza rossa in cellule morte (es/em 570 nm/602 nm)</td></tr><tr><td>Centrifuga a bassa velocità</td><td>Xiangyi, Hunan, Cina</td><td></td><td>TD5A</td></tr><tr><td>Magnetron sputter</td><td>Riye electric Co. Ltd, Suzhou, Cina</td><td>MSP-2S</td><td></td></tr><tr><td>Pompa di iniezione a microflusso</td><td>Harvard Apparatus, Holliston, USA</td><td></td><td>Harvard Pump 11 Plus</td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina</td><td>Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra</td><td>2135250</td><td>di grado di ricerca</td></tr> soluzione <tr><td>salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Servicebio Technology Co., Ltd. Wuhan, Cina</td><td>GP21090181556</td><td>PBS 1x, grado di coltura, senza calcio, senza magnesio</td></tr><tr><td>Acido poli(lattico-co-glicolico)</td><td>Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA</td><td>lotto # MKCF9651</td><td>66&ndash; 107 kDa, lattide: glicolide 75:25</td></tr><tr><td>Poly(alcol vinilico)</td><td>Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA</td><td>lotto # MKCK4266</td><td>13-13 kDa, 98% tubo in PVC idrolizzato</td></tr><tr><td></td><td>Shenchen, Shanghai, Cina</td><td></td><td>Diametro interno, ID: 1 mm</td></tr><tr><td>Cellule staminali mesenchimali mesenchimali del midollo osseo di ratto</td><td>Procell, Wuhan, Cina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio elettronico a scansione</td><td>Phenom pure, Eindhoven, Paesi Bassi</td><td></td><td>Impostare la tensione di accelerazione a 5 kV</td></tr><tr><td>Syrine per scopi medici</td><td>Gentilmente, Shanghai, Cina</td><td></td><td>5 mL e 50 mL (con l'ago)</td></tr><tr><td>Temperatura bagno d'acqua</td><td>Mingxiang, Shenzhen, Cina</td><td></td><td>36 W</td></tr><tr><td>Trasformatore</td><td>Riye electric Co. Ltd, Suzhou, Cina</td><td>SZ-2KVA</td><td></td></tr><tr><td>Interruttore a ultrasuoni</td><td>JY 92-IID, Scientz, Ningbo, Cina</td><td></td><td>JY 92-IID</td></tr><tr><td>Colla a polimerizzazione UV</td><td>Zhuolide, Foshan, Cina</td><td></td><td>D-3100</td></tr></tbody></table>

fabbricazione di microsfere porose altamente aperte (hopm) tramite tecnologia microfluidica

Fabricating Highly Open Porous Microspheres (HOPMs) via Microfluidic Technology

Rispetto agli scaffold di massa e all'iniezione diretta di cellule da sole, le unità modulari iniettabili hanno raccolto un enorme interesse nella riparazione dei tessuti malfunzionanti grazie alla praticità nel confezionamento delle cellule, al miglioramento della ritenzione cellulare e alla minima invasività. Inoltre, la conformazione porosa di questi vettori su microscala potrebbe migliorare lo scambio del mezzo e migliorare il livello di nutrienti e forniture di ossigeno. Il presente studio illustra la fabbricazione conveniente di microsfere porose altamente aperte (PLGA-HOPM) a base di acido poli(lattico-co-glicolico) mediante la facile tecnologia microfluidica per applicazioni di rilascio cellulare. I PLGA-HOPM monodispersi risultanti possedevano dimensioni delle particelle di ~400 μm e pori aperti di ~50 μm con finestre interconnesse. In breve, le goccioline di olio emulsionato (soluzione PLGA in diclorometano, DCM), avvolte con la fase acquosa di gelatina al 7,5% (p/v), sono state introdotte nella soluzione acquosa a flusso continuo di poli(alcool vinilico) (PVA) all'1% (p/v) attraverso l'ugello coassiale nella configurazione microfluidica personalizzata. Successivamente, le microsfere sono state sottoposte a procedure di estrazione con solvente e liofilizzazione, con conseguente produzione di HOPM. In particolare, varie formulazioni (concentrazioni di PLGA e porogeno) e parametri di lavorazione (potenza emulsionante, agometro e portata della fase dispersa) svolgono un ruolo cruciale nelle qualità e nelle caratteristiche dei HOPM PLGA risultanti. Inoltre, queste architetture potrebbero potenzialmente incapsulare vari altri segnali biochimici, come i fattori di crescita, per la scoperta di farmaci estesi e applicazioni di rigenerazione dei tessuti.

Sulla base di lavori precedenti che hanno ottimizzato i parametri principali1, il PLGA è stato sciolto nel solvente DCM evaporabile. L'emulsione primaria W/O è stata preparata mediante omogeneizzazione con gelatina sotto trattamento con sonda ad ultrasuoni. La struttura fluidica co-flow personalizzata è stata assemblata in modo semplicistico, in cui è stata impiegata una siringa per introdurre costantemente i flussi. Inoltre, sono state eseguite sufficienti procedure di risciacquo per eliminare PV...

Il presente protocollo descrive la fabbricazione di microsfere porose altamente aperte (HOPM) a base di acido poli(lattico-co-glicolico) attraverso la tecnologia microfluidica facile basata sulla formulazione a singola emulsione. Queste microsfere hanno potenziali applicazioni nell'ingegneria tissutale e nello screening dei farmaci.

Fabbricazione di microsfere porose altamente aperte (HOPM) tramite tecnologia microfluidica

Compared to bulk scaffolds and direct injection of cells alone, the injectable modular units have garnered enormous interest in repairing malfunctioned ...

In questo protocollo, dimostriamo una procedura efficace per la fabbricazione di microsfere porose altamente aperte basate su PLGA, che offrono diversi vantaggi come la praticità delle celle di imballaggio, una migliore ritenzione cellulare e una minima invasività. Le microsfere porose monodisperse ad alta apertura basate su PLGA risultanti possedevano dimensioni delle particelle di circa 400 micrometri e pori aperti di circa 50 micrometri con finestre interconnesse per una migliore efficacia di ritenzione cellulare. Questi microcarrier minimamente invasivi possono supportare una piattaforma di un intricato modello tumorale 3D per lo screening dei farmaci e strumenti facili per costruire micro tessuti carichi di cellule per la rigenerazione dei tessuti.Questo approccio è abbastanza semplice, in quanto il dispositivo microfluidico può essere assemblato da tubi di cloruro di polivinile, un capillare di vetro e un ago. A dimostrare la procedura sarà Sheng-Chang Luo, uno studente di dottorato in laboratorio. Inizia costruendo un generatore microfluidico a flusso co-flow usando un capillare di vetro, tubi di cloruro di polivinile e un ago di erogazione calibro 26.Quindi collegare il capillare di vetro all'estremità del tubo di cloruro di polivinile e perforare la connessione tra i due con un ago. Per la generazione di gocce, posizionare l'altra estremità del tubo di cloruro di polivinile nella fase continua e polimerizzare con la colla ultravioletta per sigillare gli spazi sul giunto. Ora prendi una siringa da 50 millilitri per caricare la fase continua e una siringa da cinque millilitri per la formazione dell'emulsione.Quindi impostare le portate della fase continua a due millilitri al minuto e le fasi di dispersione a 0,08 millilitri al minuto. Posizionare un becher da 500 millilitri in un bagno di ghiaccio e riempirlo con una soluzione acquosa di alcol polivinilico pre-raffreddata. Per preparare l'emulsione, decantare immediatamente la soluzione acquosa di gelatina nella soluzione DCM di PLGA ed emulsionare utilizzando il dispositivo ad ultrasuoni.Quindi regolare la potenza ultrasonica a 400 watt e il tempo di elaborazione totale a 90 secondi e modificare costantemente la posizione della sonda manualmente. Stabilizzare l'emulsione risultante per l'aspirazione della siringa e la generazione di goccioline in circa 20 minuti. Dopo il trattamento ad ultrasuoni, caricare rapidamente l'emulsione preparata nella siringa da cinque millilitri nella piattaforma microfluidica e introdurre l'emulsione di olio d'acqua instabile nel dispositivo microfluidico come fase discontinua.Contemporaneamente, utilizzare la soluzione acquosa di alcol polivinilico come fase continua. Dopo aver iniettato le porzioni appropriate dell'emulsione nel dispositivo microfluidico, raccogliere la microsfera contenente l'emulsione sul fondo del becher di raccolta e posizionare il campione a quattro gradi Celsius durante la notte per un'ulteriore stabilizzazione. Normalizzare le microsfere immagazzinate a temperatura ambiente ed eliminare il DCM residuo agitando con una bacchetta di vetro per un'ora a 60 RPM.Quindi, decantare accuratamente la fase di raccolta in un becher da 500 millilitri e lavare via l'alcol polivinilico residuo dalla superficie delle microsfere porose con acqua deionizzata tre volte. Sciogliere la gelatina avvolta nella spina dorsale del PLGA posizionando le microsfere PLGA nel bagnomaria a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi rimuovere la gelatina residua risciacquando due volte le microsfere risultanti con l'acqua deionizzata e pre-raffreddare per la liofilizzazione a meno 80 gradi Celsius per 24 ore.Le microsfere porose altamente aperte basate su PLGA mostravano dimensioni da 350 a 500 micrometri con un poro di dimensioni arbitrarie da 10 a 100 micrometri e finestre interconnesse, che potrebbero facilitare un'elevata efficienza nel trasporto di rifiuti metabolici di ossigeno. Le cellule staminali mesenchimali del midollo osseo coltivate all'interno delle microsfere porose altamente aperte a base di PLGA hanno aderito agli scaffold in un giorno, rappresentando ampie capacità di adesione e migrazione delle cellule. La colorazione con ioduro di calcio-AM e propidio ha mostrato che le cellule sono vive e distribuite uniformemente.È essenziale impostare la potenza ultrasonica e la posizione della sonda. La produzione riproducibile di microsfere porose altamente aperte basate su PLGA aprirà la strada alla costruzione di grafici pronti all'uso per indurre la rigenerazione o lo screening dei farmaci.

fabricating-highly-open-porous-microspheres-hopms-via-microfluidic

Research

Ricerca

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingegneria

Dispositivi microfluidici può essere utilizzato per visualizzare complessi processi naturali in tempo reale e alle scale fisico appropriato. Abbiamo sviluppato un semplice dispositivo a microfluidi che simula le caratteristiche principali di mezzi porosi naturali per studiare la crescita e il trasporto di batteri nel sottosuolo.

Finestra su un micromondo: Sistemi Microfluidic semplice per studiare il trasporto microbica in mezzi porosi

Combinando goccia generazione monodisperse con ordinamento inerziale di cellule e particelle, si descrive un metodo per incapsulare un numero desiderato di celle o particelle in una singola goccia a tassi kHz. Abbiamo dimostrato efficienze due volte superiori a quelli di incapsulamento non ordinate per raccogliere le gocce singola e doppia-particelle.

High Throughput singola cellula e cellula Multiple-Micro-incapsulamento

Due fluidi adiacenti che passano attraverso un canale microfluidico scanalato possono essere diretti a formare una torcia attorno a un nucleo di prepolimeri; determinando così sia la forma che la sezione trasversale. La polimerizzazione fotoiniziata, come la chimica dei clic tiolo, è adatta per solidificare rapidamente il fluido del nucleo in una microfibra con dimensioni e forma predeterminate.

Fabbricazione microfluidica di fibre polimeriche e bioibride con dimensioni e forma predesignate

Vengono presentate le procedure utilizzate per generare perle di polidimetilsilossano microstrutturate con porosità concava. Gli effetti della concentrazione e dell'identità degli elettroliti all'interno della fase acquosa sono particolarmente enfatizzati.

Fabbricazione microbolle di Perline PDMS Concavo-porosità

La generazione di doppie emulsioni microfluidiche coinvolge tipicamente dispositivi con bagnabilità modellata o componenti in vetro fabbricati su misura. Qui descriviamo la fabbricazione e il collaudo di un generatore di doppia emulsione interamente in polidimetilsilossano (PDMS) che non richiede trattamenti superficiali o complicati processi di fabbricazione ed è in grado di produrre doppie emulsioni fino a 14 μm.

Doppia Emulsione Generazione Utilizzando un Polidimetilsilossano (PDMS) coassiale flusso fuoco Dispositivo

È stata sviluppata una strategia di produzione di additivi per il trattamento UV-reticolabili idrogeli. Questa strategia consente il montaggio di strato dopo strato di microfabbricati idrogel strutture così come il montaggio di componenti indipendenti, producendo dispositivi integrati che contengono parti in movimento che sono sensibili ad azionamento magnetico.

Un additivo tecnica di fabbricazione per la Facile e rapida realizzazione di Micromachines base di idrogel con componenti magneticamente reattivi

Questo lavoro fornisce un metodo per la realizzazione di piattaforme microfluidici basati su gocciolina e l'applicazione di microsfere di poliacrilammide per l'amplificazione di PCR di microsfere. Il metodo di microsfere-PCR permette di ottenere single-stranded DNA ampliconi senza separare DNA double-stranded.

Un approccio basato su goccia di microfluidica e microsfere-PCR amplificazione per ampliconi di DNA Single-Stranded

Questo protocollo descrive la fabbricazione di dispositivi microfluidici da MY133-V2000 per eliminare gli artefatti che spesso sorgono a microcanali dovuto gli indici di rifrazione disadattamento tra microchannel strutture e una soluzione acquosa. Questo protocollo utilizza un supporto acrilico per comprimere il dispositivo incapsulato, migliorare l'adesione sia chimicamente e meccanicamente.

Fabbricazione di dispositivi rifrangenti-Indice-abbinati per biomedica microfluidica

I saggi di goccioline acqua-in-olio sono utili per la chimica analitica, l'evoluzione enzimatica e l'analisi di singole cellule, ma in genere richiedono microfluidica per formare le goccioline. Qui, descriviamo l'emulsificazione modellata con particelle, un approccio privo di microfluidi per eseguire saggi di goccioline.

L'emulsione con modellazione di particelle consente saggi di goccioline prive di microfluidi

Il presente protocollo descrive una piattaforma microfluidica per studiare lo sviluppo di biofilm in mezzi porosi quasi-2D combinando l'imaging al microscopio ad alta risoluzione con misurazioni simultanee della differenza di pressione. La piattaforma quantifica l'influenza della dimensione dei pori e delle portate del fluido nei mezzi porosi sul biointasamento.

Una piattaforma microfluidica per studiare il bioclogging in mezzi porosi

Il protocollo descrive la preparazione di microsfere di alginato di sodio reticolate con diversi ioni metallici utilizzando un dispositivo microfluidico per la progettazione di vettori di farmaci. Sono state studiate anche le proprietà antimicrobiche e il lento rilascio di farmaci di queste microsfere.

Preparazione di microsfere di alginato di sodio reticolato con diversi ioni metallici utilizzando la tecnologia microfluidica Electrospray

Impara a fabbricare microsfere porose altamente aperte di PLGA tramite tecnologia microfluidica per ingegneria tissutale e screening farmacologico. Questo metodo migliora il ritenzione cellulare con pori di circa 50 micrometri.

Fabbricazione di microsfere porose altamente aperte (HOPM) tramite tecnologia microfluidica

Esplora altri video