Name: Adipociti di topo differenziati in coltura primaria: un modello di insulino-resistenza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Scopri come isolare e differenziare adipociti primari di topo per studiare la resistenza all'insulina. Questo protocollo utilizza il western blot per analizzare la fosforilazione delle proteine del segnale insulinico.

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Ringraziamo Daniel Mondragón, Antonio Prado, Fernando López-Barrera, Martín García-Servín, Alejandra Castilla e María Antonieta Carbajo per la loro assistenza tecnica, e Jessica Gonzalez Norris per aver curato criticamente il manoscritto. Questo protocollo è stato sostenuto dal Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACYT), Fondo Sectorial de Investigación para la Educación Grant 284771 (to Y.M.).

Tutti gli esperimenti sui roditori sono stati approvati dal Comitato di Bioetica dell'Istituto di Neurobiologia dell'UNAM, numero di protocollo 075.
1. Isolamento delle cellule precursori degli adipociti di topo
<ol><li>Eutanasia di topi maschi C57BL/6 di 8-10 settimane (ad esempio, per inalazione di CO2 e successiva lussazione cervicale) (quattro animali per isolamento). Disinfettare i topi strofinando con etanolo al 70% e ottenere il tessuto adiposo subito dopo il sacrificio. NOTA: Dopo l'eutanasia dei roditori, isolare immediatamente il tessuto adiposo ed eseguire tutti i passaggi all'interno di una cappa a flusso laminare sterile. I topi sono tenuti sotto cicli luce/buio di 12 ore con libero accesso al cibo e all'acqua.</li>
	<li>Sezionare il tessuto adiposo sottocutaneo inguinale da ciascun topo. Rimuovere solo il tessuto adiposo, evitando la rimozione di muscoli, pelle o qualsiasi altro tessuto, e raccoglierlo in un tubo conico da 50 ml contenente 15 ml di soluzione di collagenasi di tipo 1 (1,5 mg / ml) su ghiaccio. Sciogliere la collagenasi di tipo 1 nella Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco ad alto glucosio-1% di albumina bovina (BSA) e filtrare attraverso filtri a siringa da 0,2 μm.</li>
	<li>Tagliare il tessuto adiposo in piccoli pezzi con forbici chirurgiche sterili e digerire i campioni mediante incubazione con soluzione di collagenasi di tipo 1 a 37 °C in uno shaker orbitale (150 rpm) per 30 minuti (posizionare il tubo contenente grasso e collagenasi in posizione orizzontale per una maggiore superficie di agitazione). Controllare la digestione ogni 10 minuti per assicurarsi che funzioni (la degradazione dei tessuti è visibile) e per prevenire la sovradigestione (vedere Figura supplementare S1).</li>
	<li>Filtrare utilizzando una siringa a rete da 200 μm (precedentemente autoclavata) per eliminare il tessuto non digerito con collagenasi. Passare il filtro sul bordo del tubo per drenare il maggior numero possibile di celle nella soluzione. Aggiungere 15 mL di DMEM-1% BSA freddo per interrompere la digestione e centrifugare a 400 × g per 10 minuti a 4 °C.</li>
	<li>Aspirare lo strato superiore contenente adipociti maturi e la maggior parte dello strato liquido; Evitare di toccare o disturbare il pellet. Aggiungere 20 ml di siero bovino fetale (FBS) tamponato con fosfato freddo (PBS)-2% e risospendere il pellet. Centrifugare a 400 × g per 5 minuti a 4 °C.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante, aspirando prima lo strato superiore per eliminare i rimanenti adipociti e grasso. Risospendere il pellet in 1 ml di tampone lisante di cloruro di ammonio potassio (ACK) (per lisare i globuli rossi) e incubare su ghiaccio per 5 minuti. Aggiungere 10 mL di PBS-2% FBS, miscelare e centrifugare a 400 × g per 5 minuti a 4 °C.</li>
	<li>Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 200 μL di soluzione anti-Fc (CD16/CD32 purificato anti-topo di ratto diluito in PBS-2% FBS [1:150]) per ridurre il legame mediato dal recettore Fc da parte degli anticorpi di interesse. Incubare su ghiaccio per 5 min. Trasferire la sospensione della cella in un tubo da 5 mL che si inserisce nelle rack prerefrigerate di un separatore magnetico e centrifugare a 400 × g per 5 minuti a 4 °C.</li>
	<li>Eliminare il surnatante, aggiungere 200 μL della miscela di CD31(PECAM-1) anticorpo monoclonale (390)-biotina (1:100) e CD45 monoclonale anticorpo (30-F11)-biotina (1:100), mescolare bene e incubare su ghiaccio per 15 minuti (preparare diluizioni anticorpali in soluzione anti-Fc; vedere Tabella 1). Aggiungere 400 μL di PBS-2% FBS e centrifugare a 400 × g per 5 minuti a 4 °C. NOTA: CD31 e CD45 sono marcatori rispettivamente delle cellule endoteliali e delle cellule ematopoietiche.</li>
	<li>Aspirare il surnatante e incubare in 100 μL di microsfere anti-biotina (1:5) per 15 minuti su ghiaccio (preparare diluizioni anticorpali in soluzione anti-Fc, vedere Tabella 1). Aggiungere 400 μL di PBS-2% FBS e centrifugare a 400 × g per 5 minuti a 4 °C.</li>
	<li>Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 350 μL di PBS-2% FBS. Rimuovere gli aggregati cellulari o le particelle di grandi dimensioni dalle sospensioni a cella singola con un filtro di preseparazione (70 μm). Innanzitutto, attivare il filtro con 100 μL di PBS-2% FBS, passare la sospensione cellulare attraverso il filtro (raccogliere in un tubo pulito) e infine lavare il filtro con 100 μL di PBS-2% FBS.</li>
	<li>Eseguire la separazione magnetica delle celle utilizzando la strategia di separazione negativa con un separatore di celle magnetico.<ol><li>Posizionare il campione nella posizione A del refrigeratore (assicurarsi che il rack sia preraffreddato) e due tubi vuoti in posizione B e C per recuperare rispettivamente le celle non marcate ed etichettate.</li>
		<li>Caricare il tampone di lavaggio e il buffer di funzionamento nelle bottiglie corrispondenti prima di accendere l'apparecchiatura. Programmare l'apparecchiatura per eseguire la separazione magnetica delle celle con il protocollo DEPLEME . NOTA: Questo protocollo è per l'esaurimento in modalità standard per la rimozione di cellule con espressione dell'antigene normale (in questo caso, cellule etichettate con anti-CD31 e anti-CD45), se il recupero è la massima priorità.</li>
		<li>Nella sezione di separazione, selezionare il numero di campioni da separare e selezionare il protocollo DEPLEME. Premere Esegui e avviare la separazione. Al termine del programma, recuperare le cellule non marcate e centrifugare a 400 × g per 5 minuti a 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 500 μL di terreno di coltura (Tabella 1).</li>
	<li>Seminare gli APC in un pozzetto di una piastra a 12 pozzetti precedentemente rivestita con una matrice di membrana basale al 2,5% (si ottengono circa 50.000-75.000 cellule). Aggiungere 400 μL di matrice a membrana basale al 2,5% per coprire l'intera superficie di ciascun pozzetto. Immediatamente dopo aver rimosso la soluzione in eccesso e aver lasciato solo un piccolo strato, lasciare asciugare la piastra (senza coperchio) all'interno della cappa a flusso laminare per almeno 1 ora. Incubare a 37 °C in atmosfera al 5% di CO2 . Cambiare il mezzo ogni 48 ore fino a quando le celle raggiungono l'80% di confluenza.</li>
	<li>All'80% di confluenza, rimuovere completamente il mezzo e lavare con 350 μL di PBS-2% FBS. Raccogliere le cellule con 350 μL di tripsina-EDTA allo 0,05% per 2 minuti a 37 °C. Aggiungere 2 ml di terreno di coltura e raccogliere le cellule in un nuovo tubo conico da 50 ml, quindi centrifugare a 400 × g per 5 minuti.</li>
	<li>Far passare gli APC su piastre da 12 pozzetti (10.000-20.000 celle per pozzetto) precedentemente rivestite con matrice di membrana basale al 2,5%. Incubare a 37 °C con il 5% di CO2. Cambiare il mezzo ogni 48 ore fino a quando le cellule raggiungono l'80% di confluenza. NOTA: gli APC possono essere passati una sola volta. Successivamente, perdono la loro capacità di proliferare e differenziarsi. Vedere il flusso di lavoro per il processo di isolamento degli APC nella figura supplementare S2.</li>
</ol>2. Differenziazione degli adipociti e induzione dell'insulino-resistenza
NOTA: Mantenere le cellule a 37 °C in 5% di CO2 ed eseguire passaggi che comportano il cambiamento del terreno e trattamenti con TNF-α e insulina all'interno di una cappa sterile.
<ol><li>All'80% di confluenza, inizia il processo di differenziazione; aspirare qualsiasi mezzo di crescita e sostituirlo con 500 μL di terreno di differenziazione (Tabella 1) contenente 3,3 nM di proteina morfogenetica ossea (BMP4) in ciascun pozzetto.</li>
	<li>Dopo 48 ore, sostituire il mezzo con il mezzo di differenziazione (500 μL per pozzetto) e il cocktail di differenziazione (Tabella 1).</li>
	<li>Rimuovere il terreno 72 ore dopo e aggiungere 100 nM di insulina in 500 μL di terreno di differenziazione fresco. NOTA: Le cellule iniziano a mostrare un aspetto rotondo con piccole goccioline lipidiche all'interno.</li>
	<li>Aspirare qualsiasi mezzo di differenziazione e sostituirlo con 500 μL di semplice mezzo 2% FBS (Tabella 1) 48 ore dopo. Indurre insulino-resistenza con 4 ng/ml di TNF-α. Includere pozzetti di controllo senza trattamento con TNF-α.</li>
	<li>Dopo 24 ore di incubazione, aggiungere 4 ng/mL di TNF-α in semplice medio-0% FBS (Tabella 1). Mantenere i pozzetti di controllo senza trattamento con TNF-α.</li>
	<li>Attivare la via di segnalazione dell'insulina 24 ore dopo aggiungendo insulina 100 nM e incubare per 15 minuti a 37 °C in un'atmosfera di CO2 al 5%. Rimuovere il mezzo e lavare con 500 μL di PBS. Includere pozzetti di controllo senza trattamento insulinico.</li>
</ol>3. Valutazione della via di segnalazione dell'insulina mediante western blot
<ol><li>Estrazione e quantificazione delle proteine<ol><li>Lavare ogni pozzetto di cellule con 500 μL di PBS e tenerlo in ghiaccio per lisare le cellule in 50 μL di tampone RIPA (Tabella 1) contenente cocktail di inibitori della proteasi all'1% aggiunti appena prima dell'isolamento del campione. Raschiare l'intera superficie del pozzetto con una punta e trasferire il lisato in una provetta da microcentrifuga da 0,6 mL (tenere in ghiaccio).</li>
		<li>Incubare per 1 ora a 4 °C in uno shaker rotante, mescolare a vortice e centrifugare a 8.000 × g per 15 minuti a 4 °C e recuperare il surnatante (mantenere in ghiaccio).</li>
		<li>Determinare la concentrazione proteica utilizzando il saggio di Bradford (non diluire il campione per quantificare).</li>
		<li>Prelevare il volume necessario corrispondente a 40-60 μg e denaturare con 6x tampone Laemmli (Tabella 1) incubando a 97 °C per 15 minuti agitando a 550 giri/min. Congelare fino all'uso.</li>
	</ol></li>
	<li>Elettroforesi su gel di poliacrilammide SDS<ol><li>Eseguire l'elettroforesi su gel di poliacrilammide SDS (SDS-PAGE) con un gel di poliacrilammide al 7,5% di spessore 1,5 mm. Inserire il gel nel serbatoio e riempire con tampone corrente (Tabella 1).</li>
		<li>Aggiungere 3 μL di proteine standard prestained al primo pozzetto del gel e caricare ogni campione nei pozzetti successivi.</li>
		<li>Eseguire il gel a 80 V per circa 15 minuti per assicurarsi che il campione entri nella matrice del gel concentratore di poliacrilammide. Successivamente, aumentare la tensione a 90 V per 2,5 ore o fino a quando il marcatore di peso molecolare da 37 kDa può essere visto sul bordo inferiore del gel.</li>
		<li>Trasferire le proteine dal gel a una membrana di nitrocellulosa in una camera semi-asciutta per 35 minuti a 25 V. In precedenza, immergere il gel, la membrana e i filtri nel tampone di trasferimento (Tabella 1) per alcuni minuti.</li>
	</ol></li>
	<li>Macchia occidentale<ol><li>Dopo il trasferimento, lavare la membrana con soluzione salina tamponata Tris (TBS) contenente 0,1% Tween 20 (TBS-T 0,1%) (Tabella 1) per 3 minuti agitando a 30 giri / min.</li>
		<li>Bloccare la membrana con soluzione bloccante (Tabella 1) a 4 °C per 1 ora in rotazione costante.</li>
		<li>Tagliare la membrana in tre parti secondo il marcatore di peso molecolare per incubare durante la notte con diversi anticorpi primari (diluiti in soluzione bloccante) a 4 °C in rotazione costante: anticorpo Phospho-IRS1 (Tyr608) (1:1.000), banda prevista a 180 kDa; Recettore della fosfo-insulina β anticorpo (Tyr1150/1151) (1:1.000), banda prevista a 95 kDa; Anticorpo Phospho-Akt (Ser473) (1:1.000), banda prevista a 60 kDa.</li>
		<li>Lavare le membrane 5 volte per 5 minuti ciascuna con TBS-T 0,1%.</li>
		<li>Incubare le membrane con il corrispondente anticorpo secondario accoppiato alla perossidasi (diluito in soluzione bloccante) per 2 ore a temperatura ambiente in rotazione costante: perossidasi affiniPure donkey anti-rabbit IgG (H+L) (1:5.000).</li>
		<li>Lavare le membrane 5 volte per 5 minuti ciascuna con TBS-T 0,1%.</li>
		<li>Rilevare le proteine utilizzando il sistema di rilevamento a chemiluminescenza. Preparare il substrato secondo le istruzioni del produttore.</li>
		<li>Posizionare la macchia in un sacchetto di plastica e aggiungere 200 μL di substrato chemiluminescente per coprire completamente la membrana. Drenare il substrato in eccesso e rimuovere eventuali bolle d'aria.</li>
		<li>Esporre ogni macchia per 30-60 s in un sistema di imaging ad alte prestazioni compatibile con la chemiluminescenza.</li>
		<li>Spogliare le membrane (passaggi 10-13 della sezione western blot) per rompere le interazioni anticorpo-antigene e quindi consentire alle membrane nitrocellulosa di essere nuovamente cancellate. Recuperare le membrane e lavare 3 volte per 5 minuti ciascuna con TBS-T 1% a 50 giri/min.</li>
		<li>Incubare per 7 minuti con 10 ml di 0,2 M NaOH a 50 giri/min.</li>
		<li>Lavare 3 volte per 5 minuti ciascuno con acqua di rubinetto a 50 giri / min.</li>
		<li>Lavare per 10 minuti con TBS-T 1% a 50 giri/min.</li>
		<li>Ripetere i passaggi 2-9 della sezione western blot per incubare la membrana con tubulina anti-beta (55 kDa) come controllo di carico utilizzando la diluizione 1:1.000.</li>
		<li>Eseguire l'analisi densitometrica25 per ogni proteina utilizzando il software ImageJ (https://imagej.nih.gov/).</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Questo articolo fornisce un metodo per studiare la resistenza all'insulina che utilizza adipociti primari in coltura trattata con TNF-α. Questo modello ha il vantaggio che gli adipociti primari possono essere coltivati in condizioni definite per lunghi periodi di tempo con uno stretto controllo dei fattori ambientali cellulari26. La durata del test è di 15-20 giorni, anche se possono verificarsi variazioni nella percentuale di adipociti differenziati tra gli esperimenti. Gli adipociti primari hann...

L'insulina è un ormone anabolizzante prodotto dalle cellule β delle isole pancreatiche e il regolatore chiave del metabolismo del glucosio e dei lipidi. Tra le sue numerose funzioni, l'insulina regola l'assorbimento del glucosio, la sintesi del glicogeno, la gluconeogenesi, la sintesi proteica, la lipogenesi e la lipolisi1. Il segnale molecolare iniziale dopo l'interazione dell'insulina con il suo recettore (IR) è l'attivazione dell'attività intrinseca della proteina chinasi tirosina di IR2, con conseguente autofosforilazione3 e successiva attivazione di una famiglia di proteine note come substrati del recettore dell'insulina (IRS), che si lega alle proteine adattatrici portando all'attivazione di una cascata di protein chinasi4 . L'insulina attiva due principali vie di segnalazione: fosfatidilinositolo 3-chinasi (PI3K)-proteina chinasi B (AKT) e Ras-mitogen-activated protein chinasi (MAPK). Il primo costituisce un importante punto di diramazione o nodo 4,5 per l'attivazione di numerosi effettori a valle coinvolti in diverse funzioni fisiologiche, tra cui la regolazione dell'omeostasi del combustibile, mentre il secondo regola la crescita e la differenziazione cellulare 4,6. Le azioni dell'insulina dipendono in ultima analisi dal tipo di cellula e dal contesto fisiologico7.
Uno dei principali tessuti metabolici insulino-sensibili è il tessuto adiposo. Il tessuto adiposo bianco è il tipo di grasso più abbondante nell'uomo e nei roditori, distribuito all'interno del grasso sottocutaneo (tra la pelle e i muscoli) e del grasso viscerale (intorno agli organi nella cavità addominale). Dato il loro grande volume, gli adipociti o le cellule adipose sono il tipo di cellula più abbondante nel tessuto adiposo. Queste cellule adipose possono essere marroni / beige (termogeniche), rosa (nella ghiandola mammaria) e bianco 8,9. Gli adipociti bianchi mantengono le principali riserve energetiche nel corpo sotto forma di trigliceridi, un processo insulino-dipendente. L'insulina favorisce il trasporto del glucosio e la lipogenesi, mentre inibisce la lipolisi o la degradazione dei lipidi 7,10. Facilita anche la differenziazione dei preadipociti in adipociti - le cellule mature che immagazzinano il grasso11.
La resistenza all'insulina si verifica quando un livello normale di insulina produce una risposta biologica attenuata, con conseguente iperinsulinemia compensatoria12. La resistenza all'insulina è una condizione associata a sovrappeso e obesità5, che quando combinata porta al diabete di tipo 2 (T2D) e ad altre malattie metaboliche13. L'iperinsulinemia compensa la resistenza all'insulina nei tessuti periferici per mantenere normali livelli di glucosio nel sangue14. Tuttavia, l'eventuale perdita o esaurimento delle cellule β, insieme all'esacerbata resistenza all'insulina, porta a livelli elevati di glucosio nel sangue coerenti con T2D5. Pertanto, l'insulino-resistenza e l'iperinsulinemia possono contribuire allo sviluppo di malattie metaboliche derivate dall'obesità15. Inoltre, l'obesità può causare infiammazione locale cronica di basso grado promuovendo la resistenza all'insulina nel tessuto adiposo15,16,17. Inoltre, le alterazioni derivate dall'obesità nel tessuto adiposo, come la fibrosi, l'infiammazione e la riduzione dell'angiogenesi e dell'adipogenesi, portano a livelli sierici di adiponectina più bassi (un sensibilizzante dell'insulina) e ad un aumento della secrezione di fattori come l'inibitore dell'attivatore del plasminogeno 1 (PAI-1), acidi grassi liberi ed esosomi nel flusso sanguigno, esacerbando la resistenza all'insulina17.
Molti aspetti alla base della resistenza all'insulina rimangono sconosciuti. Sono stati sviluppati modelli in vitro e in vivo per studiare i meccanismi che mediano la resistenza all'insulina nei principali tessuti bersaglio, incluso il tessuto adiposo. Il vantaggio dei modelli in vitro è che i ricercatori hanno un maggiore controllo delle condizioni ambientali e possono valutare la resistenza all'insulina in specifici tipi di cellule. In particolare, le cellule precursori degli adipociti (APC) hanno il fenotipo individuale del tessuto donatore, che potrebbe riflettere meglio la fisiologia rispetto alle linee cellulari adipocitarie. Uno dei principali fattori che inducono insulino-resistenza in vitro è il fattore di necrosi tumorale α (TNF-α). Il TNF-α è una citochina proinfiammatoria secreta dagli adipociti e dai macrofagi nel tessuto adiposo18. Mentre è necessario per il corretto rimodellamento ed espansione del tessuto adiposo19, l'esposizione a lungo termine al TNF-α induce insulino-resistenza nel tessuto adiposo in vivo e negli adipociti in vitro20. Il trattamento cronico con TNF-α di diversi tipi cellulari porta ad un aumento della fosforilazione della serina sia di IR che di IRS-1, promuovendo così una diminuzione della fosforilazione della tirosina21. L'aumento della fosforilazione di IRS-1 sui residui di serina inibisce l'attività della tirosin-chinasi IR e può essere uno dei meccanismi chiave attraverso i quali il trattamento cronico con TNF-α altera l'azione dell'insulina22,23. Il TNF-α attiva vie che coinvolgono l'inibitore della serina/treonina chinasi del fattore nucleare ĸB chinasi β (IKKβ) e della chinasi terminale c-Jun N (JNK)24. JNK induce un complesso programma trascrizionale proinfiammatorio ma fosforila direttamente IRS-16.
Comprendere la patogenesi dell'insulino-resistenza è diventato sempre più importante per guidare lo sviluppo di future terapie contro il T2D. Le APC hanno dimostrato di essere un modello eccellente per lo studio della biologia delle cellule adipose, compresa la sensibilità e la resistenza all'insulina, e per identificare le proprietà intrinseche degli adipociti indipendenti dall'ambiente sistemico. Le APC possono essere facilmente ottenute da diversi depositi adiposi e, nelle condizioni appropriate, differenziate in adipociti maturi. Con questo metodo, gli effetti diretti sulla resistenza/sensibilità all'insulina possono essere valutati negli adipociti.

<table><tbody><tr><td><forte>1. Isolamento delle cellule precursori degli adipociti di topo</tampone di lisi ACK forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>LONZA</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>Microsfere anti-biotina&nbsp;</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31</td><td>eBioscience</td><td>13-0311-85</td><td></td></tr><tr><td>Separatore AutoMACS Pro</td><td>Miltenyi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrice della membrana basale (matrigel)</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td>Fattore di crescita</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Equitech-Bio, Inc.</td><td>BAC63-1000</td><td></td></tr><tr><td>CD45 Anticorpo monoclonale (30-F11) - Biotina</td><td>eBioscience</td><td>13-0451-85</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi, Tipo 1</td><td>Worthington Biochem</td><td>LS004197</td><td></td></tr><tr><td>Desametasone</td><td>Sigma</td><td>D1756</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>12800017</td><td></td></tr><tr><td>DMEM a basso contenuto di glucosio</td><td>GIBCO</td><td>31600-034</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>315-09</td><td>Fattore</td></tr><tr><td>di crescita FBS</td><td>GIBCO</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>ITS mix</td><td>Sigma</td><td>I3146</td><td></td></tr><tr><td>Acido L-ascorbico 2-fosfato</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td>Millipore</td><td>ESG1107</td><td>Fattore di crescita</td></tr><tr><td>Acido linoleico-albumina</td><td>Sigma</td><td>L9530</td><td></td></tr><tr><td>MCDB 201 medio</td><td>Sigma</td><td>M6770</td><td></td></tr><tr><td>Normocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-nr-2</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-BB&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>315-18</td><td>Fattore di crescita</td></tr><tr><td>Penicilina-Streptomicina</td><td>BioWest</td><td>L0022-100</td><td></td></tr><tr><td>Filtri di pre-separazione (70 &micro; m)</td><td>Miltenyi</td><td>130-095-823</td><td></td></tr><tr><td>Ratto purificato anti-topo CD16 / CD32&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>2. Differenziazione degli adipociti e induzione dell'insulino-resistenza</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutil-1-metilxantina [IBMX]</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td>Cocktail di differenziazione</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R& D Systems</td><td>5020-BP-010</td><td>Cocktail di differenziazione</td></tr><tr><td>Desametasone</td><td>Sigma</td><td>D1756</td><td>Cocktail di differenziazione</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>Rosiglitazone</td><td>Cayman</td><td>71742</td><td>Cocktail di differenziazione</td></tr><tr><td>TNF&alpha;</td><td>R& D Systems</td><td>210-TA-005&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td><forte>3. Valutazione della via di segnalazione dell'insulina mediante western blot</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-beta tubulina anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab6046</td><td></td></tr><tr><td>Blu di bromofenolo</td><td>BioRad</td><td>161-0404</td><td>Tampone Laemmli</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td>Tampone RIPA</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td>Tampone RIPA</td></tr><tr><td>Sistema</td> <td>FluorChem EProteinSimple</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G6279</td><td>Tampone Laemmli</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G7126</td><td>Tampone di corsa e trasferimento</td></tr><tr><td>Igepal</td><td>Sigma</td><td>I3021</td><td>Tampone RIPA</td></tr><tr><td>2- mercaptoetanolo</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td>Tampone Laemmli</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>JT Baker</td><td>907007</td><td>Tampone</td></tr> <tr><td>di trasferimentoNaCl</td><td>JT Baker</td><td>3624-05</td><td>TBS-T</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Sigma</td><td>77F-0379</td><td>tampone RIPA</td></tr><tr><td>NaOH&nbsp;</td><td>JT Baker</td><td>3722-19</td><td></td></tr><tr><td>Na4P2O7</td><td>Sigma</td><td>114F-0762</td><td>Tampone RIPA</td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Sigma</td><td>S6508</td><td>Tampone RIPA</td></tr><tr><td>Membrana in nitrocellulosa&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1620112</td><td></td></tr><tr><td>Latte in polvere scremato</td><td>BioRad</td><td>1706404</td><td>Soluzione bloccante</td></tr><tr><td>Proteine prestate standard&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1610395</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi</td><td>Sigma</td><td>P8340-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Perossidasi AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-035-132</td><td></td></tr><tr><td>Recettore della fosfo-insulina &; &nbsp;</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>3024</td><td></td></tr><tr><td>Fosfo-Akt (Ser473) Anticorpo</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>9271</td><td></td></tr><tr><td>Fosfo-IRS1 (Tyr608) anticorpo</td><td>Millipore</td><td>9432</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>JT Baker</td><td>407205</td><td>tampone RIPA</td></tr><tr><td>SDS</td><td>BioRad</td><td>1610302</td><td>Tampone per il funzionamento e il laemmli</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico PLUS Substrato chemiluminescente</td><td>Thermo Scientific</td><td>34577</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Promega</td><td>H5135</td><td>Tampone per il funzionamento, il trasferimento e il laemmli</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>JT Baker</td><td>4103-02</td><td>Tampone RIPA - TBS</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td>TBS-T</td></tr></tbody></table>

adipociti di topo differenziati in coltura primaria: un modello di insulino-resistenza

Differentiated Mouse Adipocytes in Primary Culture: A Model of Insulin Resistance

La resistenza all'insulina è un effetto ridotto dell'insulina sulle sue cellule bersaglio, di solito derivato dalla diminuzione della segnalazione del recettore dell'insulina. La resistenza all'insulina contribuisce allo sviluppo del diabete di tipo 2 (T2D) e di altre malattie derivate dall'obesità ad alta prevalenza in tutto il mondo. Pertanto, comprendere i meccanismi alla base della resistenza all'insulina è di grande rilevanza. Diversi modelli sono stati utilizzati per studiare la resistenza all'insulina sia in vivo che in vitro; Gli adipociti primari rappresentano un'opzione interessante per studiare i meccanismi di insulino-resistenza e identificare le molecole che contrastano questa condizione e i bersagli molecolari dei farmaci insulino-sensibilizzanti. Qui, abbiamo stabilito un modello di insulino-resistenza utilizzando adipociti primari in coltura trattata con fattore di necrosi tumorale α (TNF-α).
Le cellule precursori degli adipociti (APC), isolate dal tessuto adiposo sottocutaneo sottocutaneo di topo digerito con collagenasi mediante tecnologia di separazione cellulare magnetica, sono differenziate in adipociti primari. La resistenza all'insulina viene quindi indotta dal trattamento con TNF-α, una citochina proinfiammatoria che riduce la fosforilazione/attivazione della tirosina dei membri della cascata di segnalazione dell'insulina. La diminuzione della fosforilazione del recettore dell'insulina (IR), del substrato del recettore dell'insulina (IRS-1) e della proteina chinasi B (AKT) è quantificata dal western blot. Questo metodo fornisce un ottimo strumento per studiare i meccanismi che mediano l'insulino-resistenza nel tessuto adiposo.

Negli ultimi anni, l'aumento della prevalenza di obesità e T2D ha stimolato un'intensa ricerca dei meccanismi che mediano l'insulino-resistenza nel tessuto adiposo. Con il protocollo qui descritto, le APC possono essere differenziate in adipociti maturi per valutare la resistenza e la sensibilità all'insulina. Una volta che le APC raggiungono la confluenza, ci vogliono 10 giorni per completare la loro differenziazione in adipociti maturi e la loro induzione di insulino-resistenza mediata da TNF-α (Fi...

Questo protocollo descrive l'isolamento dei preadipociti di topo dal grasso sottocutaneo, la loro differenziazione in adipociti maturi e l'induzione della resistenza all'insulina. L'azione dell'insulina viene valutata mediante fosforilazione/attivazione dei membri della via di segnalazione dell'insulina attraverso il western blot. Questo metodo consente la determinazione diretta della resistenza/sensibilità all'insulina negli adipociti primari.

Adipociti di topo differenziati in coltura primaria: un modello di insulino-resistenza

Insulin resistance is a reduced effect of insulin on its target cells, usually derived from decreased insulin receptor signaling. Insulin resistance ...

La resistenza all'insulina può essere valutata negli adipociti primari, consentendo lo studio di donatori in diversi contesti fisiopatologici, come magri contro obesi, o cellule provenienti da diversi depositi di grasso. Gli adipociti primari conservano molte delle loro proprietà intrinseche e possono essere coltivati in condizioni definite per un lungo periodo di tempo, con uno stretto controllo dei fattori ambientali cellulari. Per avviare il processo di differenziazione, le cellule devono essere all'80% di confluenza.Se la differenziazione inizia a una confluenza inferiore o superiore, le cellule si differenziano meno o perdono la loro capacità di differenziazione. Dopo aver sacrificato l'animale, disinfettare i topi strofinando con etanolo al 70%. Sezionare il tessuto adiposo sottocutaneo inguinale da ciascun topo e raccoglierlo in un tubo conico da 15 millilitri, contenente 15 millilitri di soluzione di collagenasi di tipo uno su ghiaccio.Tagliare il tessuto adiposo in piccoli pezzi con forbici chirurgiche sterili e digerire i campioni mediante incubazione con soluzione di collagenasi di tipo uno a 37 gradi Celsius in uno shaker orbitale a 150 RPM per 30 minuti. Controlla la digestione ogni 10 minuti per assicurarti che funzioni e per prevenire la digestione eccessiva. Filtrare utilizzando una siringa a maglia da 200 micrometri per eliminare il tessuto non digerito con collagenasi e passare il filtro oltre il bordo del tubo per drenare il maggior numero possibile di cellule nella soluzione.Aggiungere 15 millilitri di DMEM 1% BSA freddo per fermare la digestione e centrifugare a 400 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Aspirare lo strato superiore contenente adipociti maturi e la maggior parte dello strato liquido. Aggiungere 20 millilitri di PBS freddo 2% FBS e risospendere il pellet.Dopo aver centrifugato nuovamente per cinque minuti, rimuovere il surnatante aspirando lo strato superiore per eliminare gli adipociti e il grasso rimanenti. Risospendere il pellet in un millilitro di tampone di lisa ACK. Incubare sul ghiaccio per cinque minuti.Aggiungere 10 millilitri di PBS 2% FBS e mescolare. Dopo aver centrifugato per cinque minuti e aspirato il surnatante, risospendere il pellet in 200 microlitri di soluzione anti-FC. Incubare su ghiaccio per cinque minuti e trasferire la sospensione cellulare su un tubo da cinque millilitri che si inserisce nei rack pre-refrigerati di un separatore di celle magnetico.Dopo aver centrifugato per cinque minuti ed eliminato il surnatante, aggiungere 200 microlitri della miscela di biotina anticorpo monoclonale CD 31 e biotina anticorpo monoclonale CD 45. Mescolare bene e incubare sul ghiaccio per 15 minuti. Quindi aggiungere 400 microlitri di PBS 2% FBS e centrifugare nuovamente a 400 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.Aspirare il surnatante e incubarlo in 100 microlitri di microsfere anti-biotina per 15 minuti su ghiaccio. Aggiungere 400 microlitri di PBS 2% FBS e centrifugare nuovamente a 400 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius, come mostrato in precedenza. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet in 350 microlitri di PBS 2% FBS.Per rimuovere gli aggregati cellulari, o particelle di grandi dimensioni, dalle sospensioni a cella singola con un filtro di pre-separazione a 70 micrometri, attivare il filtro con 100 microlitri di PBS 2% FBS. Passare la sospensione cellulare attraverso il filtro e raccoglierla in un tubo pulito. Quindi lavare il filtro con 100 microlitri di PBS 2% FBS.Per eseguire la separazione magnetica delle celle utilizzando la strategia di separazione negativa, posizionare il campione nella posizione A del rack refrigerato e due tubi vuoti nelle posizioni B e C per recuperare le celle non marcate ed etichettate. Quindi caricare il tampone di lavaggio e il buffer di esecuzione nelle bottiglie corrispondenti. Nella sezione di separazione, selezionare il numero di campioni da separare e selezionare il protocollo di esaurimento.Premere Esegui e avviare la separazione. Alla fine del programma, recuperare le celle non etichettate. Successivamente, rivestire una piastra a 12 pozzetti con matrice di membrana basale aggiungendo 400 microlitri di matrice di membrana seminterrato al 2,5% per coprire l'intera superficie di ciascun pozzetto.Rimuovere la soluzione in eccesso e lasciare asciugare la piastra all'interno della cappa a flusso laminare per almeno un'ora. Dopo aver centrifugato per cinque minuti e scartato il surnatante, risospendere il pellet in 500 microlitri di terreno di coltura. Seminare le cellule precursori degli adipociti, o APC, in un pozzetto della piastra a 12 pozzetti precedentemente rivestita con una matrice di membrana basale del 2,5%.Incubare a 37 gradi Celsius in un'atmosfera di anidride carbonica al 5% e cambiare il mezzo ogni 48 ore fino a quando le celle raggiungono l'80% di confluenza. Dopo aver rimosso completamente il mezzo, lavare le celle con 350 microlitri di PBS 2% FBS. Raccogliere le cellule con 350 microlitri di 0,05% tripsina EDTA per due minuti a 37 gradi Celsius e aggiungere due millilitri di terreno di crescita.Raccogliere le cellule in un nuovo tubo conico da 50 millilitri e centrifugare a 400 G per cinque minuti. Far passare gli APC su piastre a 12 pozzetti, precedentemente rivestiti con una matrice a membrana basale del 2,5%, e incubare a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5%. Cambiare il mezzo ogni 48 ore fino a quando le celle raggiungono l'80% di confluenza.All'80% di confluenza, aspirare qualsiasi mezzo di crescita e sostituirlo con 500 microlitri di mezzo di differenziazione, contenente 3,3 proteine morfogenetiche ossee nanomolari in ciascun pozzetto. Dopo 48 ore, sostituire il mezzo con 500 microlitri per mezzo di differenziazione del pozzetto e il cocktail di differenziazione. Rimuovere il terreno 72 ore dopo e aggiungere 100 nanomolari di insulina in 500 microlitri di terreno di differenziazione fresco.48 ore dopo, indurre insulino-resistenza con quattro nanogrammi per millilitro di fattore di necrosi tumorale alfa, o TNF alfa. Aspirare qualsiasi mezzo di differenziazione e sostituirlo con 500 microlitri di mezzo semplice 2% FBS con TNF alfa. Dopo l'incubazione per 24 ore, aggiungere quattro nanogrammi per millilitro di TNF alfa in un mezzo semplice 0% FBS.Attivare la via di segnalazione dell'insulina 24 ore dopo aggiungendo 100 insulina nanomolare e incubare per 15 minuti a 37 gradi Celsius in un'atmosfera di anidride carbonica al 5%, come mostrato in precedenza. Dopo l'incubazione, rimuovere il mezzo e lavare con 500 microlitri di PBS, includere un pozzo di controllo senza il trattamento insulinico. Estrarre proteine e misurare la fosforilazione dei marcatori di segnalazione dell'insulina mediante Western blot.In questa figura sono mostrate le cellule precursori degli adipociti sottocutanei all'80% prima di indurre la differenziazione nelle piastre di coltura a 12 pozzetti e gli adipociti primari dopo sette giorni dall'induzione della differenziazione. La resistenza all'insulina indotta dal TNF alfa negli adipociti primari sottocutanei è stata dimostrata da una diminuzione della fosforilazione indotta dall'insulina del recettore dell'insulina, del substrato del recettore dell'insulina e della proteina chinasi B o AKT. La membrana è stata sondata con recettore dell'insulina anti-fosforilato, substrato del recettore dell'insulina anti-fosforilato uno, AKT anti-fosforilato e tubulina anti-beta è stata utilizzata come controllo del carico.Il segnale è stato visualizzato con rilevamento a chemiluminescenza. Le macchie rappresentative e la quantificazione di tre esperimenti indipendenti sono mostrate qui. Quando si tenta questa procedura, una cosa che deve essere curata è che l'induzione della resistenza all'insulina con TNF alfa è con 2% FBS per 24 ore e con 0% FBS per le ultime 24 ore.

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Questo video dimostra la differenziazione delle cellule stromali del midollo osseo (BMSC) in adipociti. Nel processo in due fasi, in presenza di specifici fattori di crescita e ormoni, le BMSC indifferenziate si differenziano prima in preadipociti. La seconda fase, che prevede il trattamento con glucosio e insulina, porta alla formazione di adipociti maturi con più goccioline lipidiche.

Differenziazione in vitro delle cellule stromali del midollo osseo di topo in adipociti

Primarie preadipociti bianchi isolati dal tessuto adiposo bianco nei topi possono essere differenziate in cellule del beige / brite. Presentato qui è un sistema affidabile modello cellulare per studiare la regolazione molecolare della "doratura" di grasso bianco.

Isolamento e la differenziazione di cellule stromali vascolari alle celle Beige / Brite

La coltura aggregata adipocite matura membrana (MAAC) è un nuovo metodo per coltivare adipociti umani maturi. Qui dettagliamo come isolare gli adipociti dall'adiposo umano e come impostare il MAAC.

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Qui viene presentato un protocollo per fornire oligonucleotidi come RNA a piccola interferenza (siRNA), imitazioni di micro-RNA (miR) o anti-micro-RNA (anti-miR) in adipociti maturi per modulare l'espressione di proteine e micro-RNA.

Un modello di coltura cellulare di adipociti per studiare l'impatto della modulazione di proteine e micro-RNA sulla funzione degli adipociti

Questo rapporto descrive un protocollo per l'isolamento simultaneo dei preadipociti primari marroni e bianchi dai topi appena nati. Le cellule isolate possono essere coltivate in coltura e indotte a differenziarsi in adipociti bianchi e marroni completamente maturi. Il metodo consente la caratterizzazione genetica, molecolare e funzionale delle cellule adipose primarie in coltura.

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I preadipociti sono isolati dalla frazione vascolare stromale del tessuto adiposo bruno interscapolare di topi neonati e differenziati in cellule che accumulano goccioline lipidiche, esprimono marcatori molecolari e mostrano la morfologia mitocondriale degli adipociti bruni maturi. Queste cellule vengono ulteriormente analizzate mediante immunofluorescenza e microscopia elettronica a trasmissione.

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Isolamento semi-automatico della frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo bianco murino mediante un dissociatore tissutale

Le dimensioni e la fragilità degli adipociti maturi hanno limitato le tecniche e gli strumenti disponibili per il loro studio e isolamento. Qui viene descritto un protocollo per l'isolamento di adipociti murini maturi, che può essere facilmente adattato a diversi depositi adiposi e diete di topi.

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Cultura primaria e elettroporazione plasmidi dell&#39;Organo murini di Corti.

Ortotopico modelli animali di cancro ovarico meglio replicare la malattia umana e, pertanto, migliorare la nostra comprensione della progressione del cancro e la risposta del tumore alla terapia. Un modello di topo riceve una iniezione intrabursal della luciferasi che esprimono le cellule tumorali ovariche. Il trattamento è somministrato tramite sonda gastrica. La crescita tumorale è controllato...

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