Name: Sintesi di nanogel responsivi agli stimoli mediante reticolazione acquosa in un solo passaggio e co-nanopolimerizzazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Scopri la sintesi di nanogel caricati con proteine in un solo passaggio mediante reticolazione e co-nanopolimerizzazione in condizioni acquose blande. Questo metodo preserva l'integrità del carico biologico per applicazioni di drug delivery.

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1. Sintesi di reticolante reattivo alla redox
<ol><li>Aggiungere il cloridrato di 2-amminoetilmetacrilato (44,79 mg, 0,270 mmol) e 0,063 mL di trietilammina a 3 mL di diclorometano anidro e lasciare miscelare per 20 minuti sotto un gas inerte N2 in un pallone a fondo tondo da 25 mL.</li>
	<li>Sciogliere 4,7,10,13,16,19,22,25,32,35,38,41,44,47,50,53-Hexadecaoxa-28,29-ditiahexapentacontanedioic acid di-N-succinimidyl estere (100 mg, 0,045 mmol) in 1 mL di diclorometano anidro e aggiungere al pallone.</li>
	<li>Aggiungere 4 ml di diclorometano anidro al pallone. Avvolgere il pallone di reazione in un foglio di alluminio e lasciare agitare sotto N2 a temperatura ambiente.</li>
	<li>Confermare la formazione del prodotto mediante cromatografia su strato sottile. Garantire i riferimenti corretti per il materiale di partenza confermando la formazione del prodotto con questo metodo.<ol><li>La cromatografia su strato sottile è un metodo basato sull'affinità utilizzato per separare i composti desiderati dalla miscela di reazione. In questo caso, utilizzare la piastra di silice altamente polare e adsorbente come fase stazionaria. Posizionare il campione di materiale di partenza e il campione della miscela di reazione su un'estremità della piastra di silice e posizionarli verticalmente in un becher di vetro chiuso con l'eluente (fase mobile: 5% metanolo: diclorometano).</li>
		<li>Per azione capillare, la fase mobile si sposta verso l'alto sulla piastra di silice e i composti del campione migrano a distanze variabili a seconda delle loro affinità per le fasi stazionarie e mobili. Quando il fronte del solvente ha attraversato i 3/4 della piastra, rimuovere la lastra e asciugarla. I composti separati appaiono come macchie sulla piastra. Quantificare il fattore di ritenzione (Rf) del composto desiderato come la distanza percorsa dal composto/la distanza percorsa dal solvente. Qui, Rf del prodotto era 0,35. La luce UV o la colorazione possono essere utilizzate per visualizzare le macchie (permanganato di potassio).</li>
	</ol></li>
	<li>Concentrare la miscela nel vuoto e purificare mediante cromatografia su colonna flash (miscela isocratica di metanolo al 5%: diclorometano)36. Introdurre la miscela di reazione sulla parte superiore di una colonna di vetro riempita di silice (fase stazionaria) e quindi eluire con il sistema solvente (fase mobile)36. Raccogliere tutte le frazioni e analizzare utilizzando TLC per distinguere le frazioni del prodotto utilizzando il valore Rf precedentemente determinato.</li>
	<li>Concentrare le frazioni purificate facendo evaporare il solvente utilizzando un evaporatore rotante (temperatura: 40 °C), impostare la pressione del vuoto sulla pressione atmosferica per rimuovere prima il diclorometano a bassa ebollizione. Quando il livello del solvente smette di diminuire, impostare la pressione del vuoto a 337 mbar per rimuovere il metanolo e ottenere un olio giallo pallido, che sarà quindi sottoposto a un'ulteriore caratterizzazione per confermare la formazione del prodotto37.</li>
	<li>Condurre analisi a infrarossi in trasformata di Fourier (FT-IR)38, 1H NMR (in dimetilsolfossido deuterato (DMSO-d 6))39, 13C NMR39 e analisi del tempo di volo/ionizzazione laser assistita da matrice (MALDI-ToF)40 per confermare la formazione del prodotto prima di eseguire i passaggi successivi.<ol><li>Per l'analisi FT-IR, caricare 1 mg di olio sullo strumento per ottenere gli spettri.</li>
		<li>Per le analisi NMR, sciogliere nuovamente 10 mg di prodotto in 0,75 mL del relativo solvente NMR, trasferire in una provetta NMR e sigillare ermeticamente per evitare perdite. Caricare il campione sullo strumento NMR, dopodiché si ottengono gli spettri39.</li>
		<li>Per l'analisi con spettrometria di massa, sigillare 1 mg di prodotto in un flaconcino, sciogliere in DMSO e caricare sullo strumento. NOTA: L'analisi all'infrarosso fornisce informazioni riguardanti i gruppi funzionali chiave nel prodotto desiderato, vale a dire gli allungamenti carbonilici (C=O) identificati dal picco acuto a 1650 cm-1 indica la formazione del legame ammidico, evidenziando così la formazione del prodotto. L'NMR 1H e il 13C forniscono informazioni sugli ambienti chimici e quindi possono essere utilizzati per determinare la composizione chimica del prodotto desiderato attraverso l'identificazione degli ambienti chimici presenti nel composto. Infine, l'uso della spettrometria di massa può verificare l'esatta massa del prodotto desiderato.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Test di scissione del reticolante disolfuro con glutatione
<ol><li>Incubare il reticolante disolfuro (ad una concentrazione finale di 4,55 mg/mL) con l'agente riducente glutatione (finale [GSH]: 10 mM), ad un volume finale di 1 mL, per 24 ore in un flaconcino di vetro da 1,5 mL.</li>
	<li>Per confermare la scissione del linker del disolfuro, inviare la fiala per l'analisi MALDI-ToF 26,40.</li>
</ol>3. Sintesi di nanogel reattivi alla redox
<ol><li>Assicurarsi che tutta la vetreria da utilizzare per la reazione sia priva di polvere lavandola con acqua deionizzata filtrata (0,20 μm) e successivamente asciugando la vetreria con aria compressa accessibile tramite l'utenza dell'aria compressa sul lato della cappa. Collegare un ugello sicuro all'uscita dell'aria compressa per facilitarne l'accessibilità. Tenere saldamente il flaconcino e posizionare l'ugello al suo interno. Attivare l'aria compressa, rilasciando un flusso controllato nella fiala. Osservare il processo per garantire un'asciugatura efficace, controllando la presenza di eventuali contaminanti o umidità residui.</li>
	<li>Preparare un flaconcino di vetro da 10 ml riempiendolo con acqua deionizzata e sigillare il pallone con un setto di gomma. Deossigenare l'acqua facendo gorgogliare N2 attraverso di essa per almeno 30 minuti prima di iniziare la reazione. Per fare ciò, riempi un palloncino con gas N2 e attacca un ago al palloncino; posizionarlo sul setto e utilizzare l'ago per perforare il setto di gomma e consentire il flusso di N2 . Collegare un ago di uscita al pallone per garantire un flusso costante di N2.</li>
	<li>Sciogliere l'albumina sierica bovina (BSA; 2 mg, 30 nmol) o la BSA marcata con Cy7 (2 mg, 30 nmol) in 1 mL di acqua deionizzata deossigenata e aggiungere a un'altra fiala di vetro pulita da 10 mL.</li>
	<li>Aggiungere la soluzione di [2-(acriloilossi)etil]trimetilammonio cloruro (AETC) (12,00 mg/10,86 μL, 0,060 mmol) al pallone e sigillarlo con un altro setto di gomma. Assicurarsi che la miscela di reazione sia mantenuta sotto un flusso costante di gas N2 e mescolare per 30 minuti.</li>
	<li>Sciogliere l'acrilammide (9,21 mg, 0,13 mmol) in 1 mL di acqua deossigenata deionizzata e aggiungere alla miscela nel flaconcino.</li>
	<li>Sciogliere il reticolante disolfuro (4,44 mg, 0,004 mmol) in 1 mL di acqua deionizzata e aggiungere alla miscela nel flaconcino. Sciacquare la miscela con gas N2 per 20 min.</li>
	<li>Sciogliere il sodio dodecil solfato (2 mg, 0,007 mmol) in 1 mL di acqua deossigenata deionizzata e aggiungere alla miscela tramite una siringa lavata con gas N2 e mescolare la miscela per 30 minuti. NOTA: Lavando la siringa con N2 riduciamo al minimo l'esposizione della miscela di reazione all'ossigeno nell'atmosfera che può inibire la reazione di polimerizzazione dei radicali.</li>
	<li>Aggiungere N,N,N',N'-tetrametiletilendiammina (1,5 μL, 0,010 mmol) e lasciare deossigenare la miscela di reazione per 3 minuti sotto N2 gas.</li>
	<li>Sciogliere il persolfato di ammonio (1 mg, 0,004 mmol) in 1 mL di acqua deionizzata deossigenata e aggiungerlo alla miscela di reazione. Assicurarsi che il gas N2 gorgogli attraverso la miscela di reazione per 10 minuti. NOTA: Se la fase di aggiunta di N2 viene omessa, è probabile che si formino particelle bianche nel pallone di reazione. Si tratta di particelle e/o aggregati di dimensioni maggiori e possono confondere qualsiasi ulteriore caratterizzazione.</li>
	<li>Sigillare il matraccio in atmosfera N2 e lasciare agitare per 3 ore e 30 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Per terminare la reazione, rimuovere il sigillo dal pallone e lasciare mescolare la miscela di reazione per almeno 10 minuti. Ciò esporrebbe la miscela di reazione ai livelli atmosferici di gas O2 , che quindi estinguerebbe eventuali radicali rimanenti nella miscela di reazione. La reazione termina quando la miscela assume un aspetto opalescente blu chiaro.</li>
	<li>Per purificare i nanogel, aggiungere la miscela di reazione a un'unità di filtro centrifugo da 15 mL (100 kDa MWCO) e aggiungere acqua deionizzata per riempire l'unità centrifuga. Centrifugare la miscela di reazione a 1000 x g per 10 min. In questo modo si rimuovono tutte le sostanze chimiche non reagite (o il carico utile non incapsulato) che sono inferiori a 100 kDa e si concentra il campione di nanogel.</li>
	<li>Una volta che il livello dell'acqua nell'unità centrifuga diminuisce, aggiungere 2 ml di acqua deionizzata per diluire il campione di nanogel e centrifugare per concentrare il prodotto. Ripeti questo passaggio 3 volte.</li>
	<li>Conservare il campione a 2-8 °C per evitare la degradazione della proteina incapsulata.</li>
	<li>Condurre l'analisi FT-IR e 1H NMR (in dimetilsolfossido deuterato (DMSO-d 6)) per confermare la polimerizzazione39,41. Per preparare il campione, liofilizzare 1 mL della soluzione di nanogel in un flaconcino da 1,5 mL. Il processo di liofilizzazione prevede il congelamento del campione e l'applicazione di un vuoto per rimuovere il solvente congelato attraverso la sublimazione, lasciando un residuo in polvere. Dopo la liofilizzazione, sciogliere nuovamente il campione nel relativo solvente NMR, trasferirlo in una provetta NMR e chiuderla ermeticamente. Caricare il campione sulla macchina NMR, come descritto in precedenza39. Per l'analisi FT-IR, è necessario caricare 1 mg di polvere secca sullo strumento per ottenere gli spettri.</li>
</ol>4. Caratterizzazione morfologica dei nanogel
<ol><li>Diffusione dinamica della luce (DLS) NOTA: Il diametro idrodinamico (nm), l'indice di polidispersione (PI) e il potenziale zeta sono stati misurati a 25 °C, lunghezza d'onda laser di 632,8 nm e rivelatore di segnale a 173° utilizzando una macchina DLS. Ogni corsa ha misurato 25 cicli di scansione secondaria.<ol><li>Misura della dimensione idrodinamica (nm)<ol><li>Preparare una cuvetta o una cella capillare ripiegata usa e getta pulendola con acqua deionizzata filtrata. Soffiare aria compressa nella cuvetta (adatta sia per le misurazioni del potenziale DLS che zeta) per assicurarsi che sia priva di particelle di polvere di grandi dimensioni.</li>
			<li>Riempire la cuvetta con almeno 50-100 μL del campione e diluire in 750-1000 μL di acqua deionizzata filtrata. Durante l'utilizzo di una cuvetta con potenziale zeta, assicurarsi che la cuvetta sia stata riempita con il campione senza formazione di bolle, che possono disturbare le misurazioni.</li>
			<li>Inserire la cuvetta all'interno dello strumento DLS, assicurandosi che sia stata inserita correttamente. A tale scopo, aprire il coperchio del vano campioni dello strumento DLS. Tenere la cuvetta per i bordi superiori per evitare impronte digitali sulle finestre ottiche. Assicurarsi che la cuvetta sia posizionata correttamente nel supporto della cuvetta assicurandosi che sia in piano e allineata con il percorso ottico dello strumento. Chiudere lo scomparto del campione per evitare interferenze con la luce ambientale. NOTA: Il mezzo di diluizione viene filtrato utilizzando un filtro per siringa con pori da 0,45 μm.</li>
			<li>Fare clic per avviare la misurazione della dimensione delle particelle sul relativo software della macchina DLS.</li>
			<li>Selezionare i risultati corrispondenti al campione per ottenere la media z (dimensione media delle particelle), il PI medio, il numero di chilogrammi al secondo (kcps), il potenziale zeta e i relativi grafici. Assicurarsi che la funzione di correlazione presenti una curva sigmoidale uniforme, in quanto ciò suggerisce un campione uniforme.</li>
			<li>Una volta completata l'analisi, rimuovere la cuvetta dal DLS.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Microscopia elettronica a trasmissione (TEM)<ol><li>Preparare i campioni posizionando 10 μL della soluzione di nanoparticelle (0,077 mg/mL) su griglie di rame rivestite di carbonio. Asciugare all'aria a temperatura ambiente per 1 ora.</li>
		<li>Lavare le griglie con acqua deionizzata filtrata e colorare con 5 μL di acetato di uranile filtrato all'1% in acqua per 2 minuti.</li>
		<li>Dopo aver imbevuto l'eccesso di colorante con carta da filtro, asciugare le griglie per una notte a temperatura ambiente. Cattura immagini GST il giorno successivo con un ingrandimento di 45.000x utilizzando una fotocamera a campo chiaro.</li>
		<li>Utilizzare il software fornito per l'elaborazione delle immagini (risoluzione: 2048 x 2048 pixel).</li>
	</ol></li>
</ol>5. Quantificazione della proteina (BSA) incapsulata all'interno dei nanogel utilizzando un saggio di acido micro-bicinchoninico (BCA)
<ol><li>Secondo il protocollo di analisi microBCA (fornito sul sito Web del produttore), generare una curva standard basata su una concentrazione proteica predefinita42.</li>
	<li>Dopo la loro sintesi, purificare i nanogel che incapsulano le proteine utilizzando unità filtranti centrifughe da 15 mL con MWCO da 100 kDa (1000 x g, 10 min) come descritto nei passaggi 3.12-3.14.</li>
	<li>Raccogliere il filtrato e analizzarlo utilizzando il test microBCA (protocollo disponibile sul sito web del produttore). Misurare l'assorbanza a 562 nm utilizzando un lettore di piastre. Poiché questa misurazione è correlata alla concentrazione di proteina non incapsulata, determinare la massa della proteina incapsulata. Per calcolare l'efficienza di incapsulamento (EE) %, utilizzare la seguente equazione: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63981/63981eq01.jpg" style="margin: auto;"></li>
</ol>6. Quantificazione del rilascio proteico da nanogel in presenza di glutatione
<ol><li>Incubare 200 μL di 5 mg/mL di nanogel caricati con Cy7BSA con 200 μL di 10 mM di glutatione (GSH) nelle unità di filtro centrifughe da 0,5 mL (100 kDa MWCO). Porre le unità filtranti a bagnomaria per mantenere la temperatura a 37 °C.</li>
	<li>Centrifugare a 1000 x g per 3 minuti ogni 10 minuti per almeno 1 ora - poi ogni 2-8 ore.</li>
	<li>Raccogliere il filtrato e utilizzarlo per ulteriori analisi. Mantenere il volume del filtrato all'interno delle unità filtranti centrifughe a 500 μL aggiungendo altra acqua deionizzata o PBS.</li>
	<li>Misurare la quantità di proteine nei filtrati facendo riferimento a una curva standard per nanogel caricati con Cy7BSA, in cui l'assorbanza della proteina fluorescente è stata misurata utilizzando uno strumento nanodrop a 750 nm. NOTA: Questa curva standard può essere calcolata preparando diluizioni seriali di Cy7BSA nell'intervallo da 0 mg/mL a 2 mg/mL. I valori ottenuti dalla nanogoccia possono essere interpolati rispetto a questa curva di calibrazione per determinare l'efficienza di incapsulamento.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td><forte>Sostanze chimiche</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-( soluzione di cloruro di acriloilossi)etil]trimetilammonio&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>496146</td><td></td></tr><tr><td>2-amminoetilmetacrilato cloridrato&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>516155</td><td></td></tr><tr><td>4,7,10,13,16,19,22,25,32,35,38,41, 44,47,50,53-esadecaoxa-28,29-ditiahexapentacontanedioico acido di-N-succinimidil estere&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>671630</td><td></td></tr><tr><td>Acrilammide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>23701</td><td></td></tr><tr><td>Persolfato di ammonio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>248614</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6917</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina marcata con Cy7</td><td>Nanocs</td><td>BS1-S7-1</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido deuterato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>547239</td><td></td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270997 (anidro) e D65100</td><td></td></tr><tr><td>Glutatione</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-tetrametiletilendiammina&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>411019</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Sodio dodecil solfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>436143</td><td></td></tr><tr><td>Trietilammina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>471283</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di uranile</td><td>agar Scientific.</td><td>AGR1260A</td><td></td></tr><tr><td>Attrezzatura necessaria per la sintesi e la caratterizzazione dei nanogel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unità filtranti centrifughe Amicon Ultra-15 (100kDa MWCO)&nbsp;</td><td>Merck Millipore</td><td>C7715</td><td></td></tr><tr><td>Fotocamera</td><td>Olimpo</td><td>Veleta</td><td></td></tr><tr><td>Griglie in rame rivestite di carbonio</td><td>Agar Scientific&nbsp;</td><td>AGS160</td><td></td></tr><tr><td>Tubi per dialisi (100kDa MWCO)</td><td>Spectrum labs</td><td>11405949</td><td></td></tr> Dynamic <tr><td>Light Scattering&nbsp;</td><td>Malvern</td><td>Zetasizer Nano Ultra</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizzatore</td><td>Labconco</td><td>WZ-03336-01</td><td></td></tr><tr><td>Spettroscopia infrarossa</td><td>Agilent&nbsp;</td><td>Cary 630 FTIR</td><td></td></tr><tr><td>iTEM software</td><td>Olympus&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spettrometria di massa</td><td>Acque</td><td>Micromass MALDI microMX MALDI Q-ToF&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Filtro a membrana MF-MilliporeTM (0,45/0,2&mu; m dimensione dei pori)</td><td>Merck Millipore, Regno Unito</td><td>HAWP04700, GSWP04700&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kit di analisi delle proteine Micro BCA</td><td>ThermoFisher</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di piastre</td><td>Beckman</td><td>Coulter-PARADIGM</td><td></td></tr><tr><td>Dati di risonanza magnetica nucleare di protoni e carbonio-13</td><td>Spettrometro</td><td></td><td>NMR Bruker 400MHz AV-400</td></tr><tr><td>Evaporatore rotante&nbsp;</td><td>Buchi&nbsp;</td><td>R-114 Rotary Vap System</td><td></td></tr><tr><td>Aghi monouso&nbsp;</td><td>Sterican</td><td>4665643</td><td></td></tr><tr><td>Suba-Seal&nbsp; septa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z124575</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia elettronica a trasmissione</td><td>Phillips</td><td>CM 100 TEM&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>spettrofotometro UV-vis</td><td>Nanodrop</td><td>Nanodrop One/One C microvolume&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

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