Colorazione tridimensionale a rene intero con CUBIC
18 luglio 2022
Il presente protocollo descrive un metodo di pulizia dei tessuti e una colorazione immunofluorescente a montaggio intero per l'imaging renale tridimensionale (3D). Questa tecnica può offrire prospettive macroscopiche nella patologia renale, portando a nuove scoperte biologiche.
Questo protocollo consente una visualizzazione di strutture tridimensionali in rene pieno, che può portare a scoperte innovative nella ricerca renale fornendo una prospettiva macroscopica. La colorazione dell'intero organo è difficile a causa della difficoltà nella penetrazione degli anticorpi. Questo protocollo ha dimostrato l'alta qualità, colorazione a montaggio intero dei reni da parte degli anticorpi.
Per iniziare, eseguire la fissazione per immersione immediatamente dopo la fissazione della perfusione e il prelievo del rene, immergendo il rene in paraformaldeide al 4% a quattro gradi Celsius per 16 ore. Dare tre lavaggi usando PBS per due ore ciascuno. Eseguire il processo di decolorazione e delipidazione immergendo il rene fisso in sette millimetri di 50%CUBIC-L in un tubo a fondo tondo da 14 millilitri, con agitazione delicata a temperatura ambiente.
Dopo sei ore, immergere il rene in sette millilitri di CUBIC-L in un tubo a fondo rotondo da 14 millimetri, con un leggero scuotimento a 37 gradi Celsius per cinque giorni. Aggiornare CUBIC-L ogni giorno. Una volta completata la decolorazione e la delipidazione, utilizzare un cucchiaio dosatore per la manipolazione del campione e lavare il rene tre volte con PBS a temperatura ambiente per due ore.
Colorare il rene delipidizzato in anticorpi primari diluiti in soluzione tampone colorante, con leggero scuotimento in uno shaker incubatore a 37 gradi Celsius per sette giorni. Quindi, lavare il rene con 0,5% Triton X-100 in PBS, noto anche come PBST, a temperatura ambiente per un giorno. Per la colorazione degli anticorpi secondari, trattare il rene con anticorpi secondari nel tampone di colorazione, al buio, con un leggero scuotimento a 37 gradi Celsius per sette giorni.
Fissare la colorazione con un lavaggio PBST a temperatura ambiente per un giorno. Dopo la fissazione, immergere il rene in formaldeide all'1% in PB per tre ore e lavarlo con PBS a temperatura ambiente per sei ore. Eseguire la corrispondenza dell'indice di rifrazione immergendo il rene in sette millilitri di 50% CUBIC-R+in un tubo a fondo tondo da 14 millilitri agitando per un giorno, seguito da un trattamento con sette millilitri di CUBIC-R+ agitando a temperatura ambiente per due giorni.
Con l'aiuto del metodo di colorazione immunitaria, i nervi simpatici e le arterie in un rene intero sono stati visualizzati nell'imaging renale 3D. Inoltre, i nervi simpatici renali anormali sono stati visualizzati dopo danno da ischemia-riperfusione. Questo protocollo ha anche facilitato la visualizzazione dei nervi simpatici in tutta la milza.
Il processo di quantificazione dei dati per la colorazione immunofluorescente tridimensionale è visualizzato qui. Inoltre, i dotti di raccolta, il segmento S1 dei tubuli prossimali e i glomeruli sono stati visualizzati con successo in un intero rene. La glomerulomegalia soppressa, derivante dalla somministrazione di farmaci nelle prime fasi della malattia renale diabetica, è stata visualizzata anche nell'imaging 3D.
Questo protocollo può etichettare la molecola specifica all'interno di un intero rene. Pertanto, i ricercatori possono analizzare l'alterazione della struttura nel sistema vascolare o trovare eventi rari nei tessuti renali.
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Panoramica
Questo protocollo consente la visualizzazione di strutture tridimensionali in un rene intero, fornendo una prospettiva macroscopica che può portare a scoperte innovative nella ricerca renale. Il metodo comprende la chiarificazione del tessuto e la colorazione immunofluorescente in toto per migliorare la qualità dell'immagine.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia
- Patologia
Sfondo
- La colorazione di organi in montaggio intero è difficoltosa a causa delle difficoltà di penetrazione degli anticorpi.
- Una colorazione di alta qualità è fondamentale per un'accurata acquisizione tridimensionale di immagini.
- Questo protocollo affronta i problemi comuni nell'immagine del rene.
- Prospettive macroscopiche possono portare a nuove intuizioni biologiche.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per l'immagine 3D del rene.
- Migliorare la visualizzazione delle strutture renali.
- Facilitare scoperte innovative nella patologia renale.
Metodi Utilizzati
- Fissazione in immersione in paraformaldeide al 4% a 4°C per 16 ore.
- Lavaggio con PBS per due ore ciascuno, per un totale di tre volte.
- Decolorazione e delipidazione utilizzando CUBIC-L al 50%.
- Agitazione delicata a temperatura ambiente durante il processo di delipidazione.
Risultati principali
- Dimostrata colorazione di alta qualità in preparato intero dei reni.
- Migliorata la penetrazione degli anticorpi.
- Fornita una chiara visualizzazione tridimensionale delle strutture renali.
- Consentite prospettive macroscopiche per una migliore comprensione della patologia renale.
Conclusioni
- Il protocollo migliora con successo le tecniche di imaging renale.
- Apre nuove strade per scoperte nella ricerca renale.
- Studi futuri potranno basarsi su questo metodo per ulteriori approfondimenti.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Direttiva
La colorazione tridimensionale dell'intero rene con CUBIC consente una visualizzazione completa delle microstrutture renali, superando i limiti della patologia convenzionale. Questa capacità supporta la mappatura ad alta risoluzione di vasi sanguigni, tubuli, glomeruli e nervi simpatici, fornendo informazioni fondamentali per la scoperta precoce e la riduzione del rischio meccanicistico nella ricerca sulle malattie renali. Il metodo aumenta la sicurezza predittiva in punti critici di svolta nell'avanzamento del portafoglio preclinico.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo di Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi dell'architettura renale e delle reti cellulari a risoluzione singola cellulare.
- Supporta la riduzione del rischio biologico visualizzando le alterazioni strutturali dopo un danno o un intervento.
- Facilita la validazione funzionale degli obiettivi attraverso la mappatura completa dei nervi simpatici e dei glomeruli.
- Migliora la fiducia predittiva nella selezione degli obiettivi per le malattie renali.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara sistemi biologici 3D validati per flussi di lavoro successivi di imaging e quantificazione.
- Standardizza la colorazione di organi interi per ottenere risultati riproducibili e quantitativi tra diversi studi.
- Consente un imaging scalabile di eventi rari e cambiamenti strutturali nel tessuto renale.
- Permette una valutazione affidabile degli effetti dei composti sulla microanatomia renale.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea gli output di imaging 3D a biomarcatori rilevanti per la malattia, come la glomerulomegalia.
- Garantisce continuità dalla scoperta alla validazione preclinica, visualizzando gli effetti delle interventi.
- Permette decisioni di avanzamento corrette per il rischio, basate su un'analisi tissutale completa.
- Fornisce una riduzione del rischio predittiva per i programmi di ricerca renale traslazionale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo di colorazione 3D su rene intero si inserisce nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, sostenendo la verifica delle ipotesi, la validazione degli obiettivi e l'allineamento dei biomarcatori traslazionali nella ricerca renale.
- Biologia della scoperta: Facilita la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante la mappatura delle strutture renali e delle risposte alle lesioni.
- Screening: Fornisce output di imaging 3D pronti per il saggio e riproducibili, per il confronto quantitativo delle condizioni sperimentali.
- Analisi: Permette la misurazione e la quantificazione dei cambiamenti strutturali, supportando analisi statistiche solide.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati dell'imaging a modelli di malattia e all'identificazione precoce di biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per l'imaging dell'organo intero in studi renali e di tessuti correlati.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione dei bersagli renali.
- Valore operativo: Fornisce flussi di lavoro di imaging 3D standardizzati, scalabili e riproducibili.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione (go/no-go) e l'efficienza del capitale consentendo un'analisi tissutale completa.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e la progressione dei programmi per le malattie renali con adeguamento del rischio.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede competenze nella chiarificazione dei tessuti, nell'immunomarcatura e nell'analisi dell'immagine 3D.
- Necessita dell'accesso a strumentazione avanzata per l'acquisizione di immagini e a strumenti computazionali per l'analisi.
- Richiede una standardizzazione tra team diversi per garantire riproducibilità e confrontabilità dei dati.
- Potrebbe richiedere adattamenti per diversi sistemi organici o pannelli di anticorpi.
- La penetrazione degli anticorpi e la durata della marcatura rappresentano limitazioni pratiche per l'imaging di organi interi.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:37
Kidney Fixation, Decolorization, and De-Lipidation
1:45
Whole-Mount Immunofluorescent Staining and Refractive Index (RI) Matching
3:03
Results: Whole-Mount Immunofluorescent Staining for Three-Dimensional (3D) Kidney Imaging
4:00
Conclusion
