Name: Isolamento e analisi di vescicole extracellulari tracciabili e funzionalizzate dal plasma e dai tessuti solidi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Scopri un protocollo per isolare vescicole extracellulari da sangue e tessuti solidi con alta resa e bassa contaminazione. Questo metodo consente l'analisi degli antigeni di superficie e del contenuto proteico per studi fisiologici e patologici.

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (32000974, 81870796, 82170988 e 81930025) e della China Postdoctoral Science Foundation (2019M663986 e BX20190380). Siamo grati per l'assistenza del National Experimental Teaching Demonstration Center for Basic Medicine (AMFU).

Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida del comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della quarta università medica militare e le linee guida ARRIVE. Per il presente studio, sono stati utilizzati topi C57Bl / 6 di 8 settimane (nessuna preferenza per femmine o maschi). Le fasi coinvolte nell'isolamento delle EV plasmatiche e tissutali sono illustrate nella Figura 1. Il plasma è preso come rappresentante per descrivere la procedura di isolamento EV dai fluidi corporei. L'osso mascellare viene preso come rappresentante per spiegare la procedura di isolamento EV dai tessuti solidi.
1. Preparazione dei campioni di plasma e osso mascellare
<ol><li>Preparare i campioni di plasma seguendo i passaggi seguenti.<ol><li>Determinare il peso corporeo del mouse utilizzando una bilancia da laboratorio standard.</li>
		<li>Aggiungere 20 μL, 2 mg/ml di eparina in una provetta da centrifuga da 1,5 mL e utilizzare il dispositivo miscelatore (vedere Tabella dei materiali) per lasciare che l'eparina si attacchi alla parete del tubo. NOTA: I tubi anticoagulanti possono anche essere utilizzati direttamente per raccogliere il sangue.</li>
		<li>Anestetizzare il topo mediante iniezione intraperitoneale di 50 mg/kg di pentobarbital sodico (vedere Tabella dei materiali). Afferrare il collo del mouse con il pollice e l'indice, quindi fissare la coda e la zampa posteriore sinistra con il mignolo e iniettare il pentobarbital sodico con una siringa per iniezione da 1 mL dopo aver esposto la pancia.</li>
		<li>Confermare che il topo sia correttamente anestetizzato in base all'assenza di riflesso corneale e reazione degli arti quando il poggiapiedi viene pizzicato.</li>
		<li>Rasare i capelli sul viso e le ciglia degli occhi con le forbici curve.</li>
		<li>Afferrare la pelle del collo del topo e premere la pelle intorno agli occhi verso la parte posteriore del collo in modo che il bulbo oculare sporga. Utilizzare una pinzetta oftalmica per bloccare rapidamente il bulbo oculare e raccogliere il deflusso di sangue con le provette da centrifuga da 1,5 ml preparate al punto 1.1.2. Sacrifica il topo dislocando la vertebra cervicale. ATTENZIONE: Fai attenzione ai peli e alle ciglia perché potrebbero causare emolisi.</li>
		<li>Capovolgere delicatamente il tubo più volte per prevenire la coagulazione del sangue. ATTENZIONE: Capovolgere il tubo il prima possibile.</li>
		<li>Centrifugare il campione di sangue per 15 minuti a 1.200 x g a 4 °C.</li>
		<li>Trasferire con cautela il surnatante in provette da centrifuga nuove e pulite da 1,5 ml e utilizzare immediatamente il campione di plasma o conservarlo a 4 °C per alcune ore.</li>
		<li>Diluire il surnatante con un volume uguale di 1x soluzione salina tamponata fosfato (PBS) e mescolare bene. NOTA: il protocollo fornito sopra per raccogliere il plasma è fatale. Il sangue può anche essere raccolto attraverso la puntura della vena succlavia11 senza sacrificare il topo.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparare i campioni di osso mascellare seguendo i passaggi seguenti.<ol><li>Isolare l'osso mascellare con pinzette oftalmiche e forbici e lavarli con PBS per eliminare i tessuti molli con una pinzetta.</li>
		<li>Mettere l'osso mascellare in provette da centrifuga da 1,5 ml e tagliare l'osso in piccoli pezzi (la dimensione deve essere inferiore a 1 mm di diametro) con le forbici. Aggiungere una certa quantità di Liberase (5 μg/ml, vedere Tabella dei materiali) per coprire il tessuto (di solito 1 mL per campioni ossei di un topo di 8 settimane), quindi incubare per 30 minuti a 37 °C.</li>
		<li>Centrifugare il campione a 800 x g per 10 minuti a 4 °C.</li>
		<li>Trasferire con cautela il surnatante con una pipetta in provette da centrifuga nuove e pulite da 1,5 ml.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Estrazione dei veicoli elettrici
<ol><li>Centrifugare i campioni (preparati nelle fasi 1.1.10 e 1.2.4) per 15 minuti a 2.500 x g (4 °C) per rimuovere i detriti di grandi cellule e le piastrine rimanenti.</li>
	<li>Trasferire con cautela i surnatanti in provette da centrifuga nuove e pulite da 1,5 ml e centrifugare per 30 minuti a 16.800 x g (4 °C). NOTA: La velocità di centrifugazione può essere impostata su oltre 10.000 x g per estrarre EV12. Maggiore è la velocità della centrifuga, maggiore è la quantità di veicoli elettrici che può essere ottenuta. Poiché il limite di velocità della centrifuga che abbiamo utilizzato è 16.800 x g (vedi Tabella dei materiali), abbiamo scelto questa velocità in questo protocollo.</li>
	<li>Scartare il surnatante e risospendere i pellet in ogni tubo con 1 mL di PBS. Centrifugare per 30 minuti a 16.800 x g (4 °C).</li>
	<li>Scartare il surnatante e risospendere i pellet in ogni tubo con 50 μL di PBS. Conservare questi campioni a 4 °C solo per meno di 24 ore, o preferibilmente utilizzare immediatamente per le seguenti analisi (fasi 3-5). ATTENZIONE: Lo stoccaggio a -80 °C è inaccettabile, in quanto ciò ridurrebbe la concentrazione di veicoli elettrici e aumenterà le dimensioni delle particelle dei veicoli elettrici13, influenzando così la seguente analisi dei veicoli elettrici.</li>
</ol>3. Identificazione morfologica dei veicoli elettrici
<ol><li>Eseguire l'analisi NTA.<ol><li>In base alla quantità di EV (approssimativamente giudicata dalle dimensioni dei pellet, le particelle di plasma da 50 μL sono il minimo), trasferire 5-50 μL di risospensione (fase 2.4), diluire in 10 mL di soluzione tampone (PBS filtrato con filtro da 0,22 μm) e mescolare sufficientemente con 1 mL di punte di micro pipettatore. Utilizzare questa sospensione finale per la misurazione delle particelle.</li>
		<li>Utilizzare una siringa sterile da 1 mL per iniettare almeno 5 mL di acqua distillata con una velocità moderata e costante fino a quando il numero di particelle visualizzate sull'interfaccia di rilevamento è inferiore a cinque. NOTA: Dopo aver iniettato 1 mL di acqua distillata attraverso l'intero canale, il numero di particelle viene visualizzato direttamente sull'interfaccia di rilevamento. Se il numero è ancora superiore a cinque, continuare a iniettare 1 mL di acqua distillata fino a quando i criteri non sono soddisfatti.</li>
		<li>Ricostituire 1 μL di soluzione di taratura in 1 mL di acqua distillata per generare una soluzione primaria, quindi prelevare 100 μL della soluzione primaria in 25 mL di acqua distillata per preparare una soluzione madre standard (1:250.000). Conservare questo reagente di lavoro a 4 °C per 1 settimana.</li>
		<li>Calibrare lo strumento NTA con la soluzione madre standard (punto 3.1.3). Iniettare 1-5 mL della soluzione di calibrazione di lavoro con una siringa sterile da 1 mL per lavare il canale della macchina fino a quando il numero di particelle visualizzate sull'interfaccia di rilevamento è compreso tra 50-400 (preferibilmente circa 300). Eseguire il programma di calibrazione.</li>
		<li>Ripetere il punto 3.1.2 per lavare il canale della macchina prima di ogni misurazione del campione.</li>
		<li>Utilizzare una siringa sterile da 1 mL per iniettare almeno 2 mL di soluzione tampone per lavare il canale della macchina a velocità costante fino a quando il numero di particelle visualizzate sull'interfaccia di rilevamento è inferiore a 10.</li>
		<li>Iniettare 1 mL del campione EV preparato al punto 3.1.1 con una velocità moderata e costante (la velocità consigliata è 0,5-1 mL/s). NOTA: la concentrazione ottimale di particelle fa sì che il numero di particelle visualizzate sull'interfaccia di rilevamento sia compreso tra 50 e 400, preferibilmente intorno a 300. Se il numero di particelle è troppo elevato, ripetere il punto 3.1.2 per lavare immediatamente il canale della macchina per evitare la ritenzione di particelle sulla parete del canale e regolare la concentrazione del campione EV con il punto 3.1.1, quindi ripetere dal punto 3.1.5.</li>
		<li>Condurre l'analisi delle particelle e generare i rapporti di analisi secondo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali).</li>
		<li>Se il campione è prezioso, pompare il campione EV con la siringa da 1 mL e raccoglierli in provette da centrifuga da 1,5 ml. Ripetere il passaggio 2.2 per estrarre i veicoli elettrici.</li>
		<li>Dopo aver rilevato tutti i campioni, iniettare almeno 2 mL di soluzione tampone nel canale della macchina e quindi iniettare almeno 5 mL di acqua distillata fino a quando il numero di particelle visualizzate sull'interfaccia di rilevamento è inferiore a cinque.</li>
		<li>Utilizzare una siringa sterile da 5 mL per iniettare almeno 10 mL di aria a velocità costante (la velocità consigliata è 1 mL/s) per rimuovere l'acqua nel canale.</li>
	</ol></li>
	<li>Eseguire l'analisi TEM. NOTA: eseguire i seguenti passaggi con nuove sospensioni EV. La griglia del microscopio elettronico rivestita di carbonio formvar ha due lati, con il lato di lavoro luminoso nelle griglie centrali. Il volume minimo di plasma per estrarre gli EV per la procedura riportata di seguito è di 50 μL.<ol><li>Mescolare il campione EV (fase 2.4) con un volume uguale di paraformaldeide (PFA) al 4%. Depositare 4 μL di EV su una griglia e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Mettere quattro gocce di PBS (una goccia equivale a 50 μL) su un foglio di pellicola di polietilene (vedi Tabella dei materiali). Trasferire le griglie con pinzette microscopiche pulite e lavare il lato di lavoro della griglia in PBS da una goccia all'altra.</li>
		<li>Utilizzare carta da filtro per rimuovere PBS aggiuntivo rimasto nelle griglie.</li>
		<li>Incubare il lato di lavoro della griglia in acido fosfotungstico all'1% (vedi Tabella dei materiali) per 2 minuti, quindi ripetere il punto 3.2.2. ATTENZIONE: Poiché l'acido fosfotungstico è velenoso, questa procedura deve essere utilizzata nella cappa aspirante e l'acido fosfotungstico ridondante deve essere specificamente riciclato piuttosto che scartato direttamente.</li>
		<li>Mettere le griglie a faccia in su in un piatto da 10 cm coperto con carta da filtro. Le griglie possono essere conservate presso RT per diversi anni.</li>
		<li>Osservare le griglie al microscopio elettronico seguendo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali). NOTA: Per garantire il rispetto delle singole particelle, è necessario regolare la concentrazione dei veicoli elettrici e la sospensione deve essere libera senza evidenti torbidità. Prima di cadere, il campione dovrebbe essere ben miscelato. Le analisi rappresentative di TEM e NTA sono mostrate nella Figura 2.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Analisi dell'origine dei veicoli elettrici
NOTA: L'identificazione dell'origine cellulare delle EV richiede l'applicazione di anticorpi per i tipici marcatori della membrana cellulare. Il volume plasmatico minimo per estrarre le EV per la procedura riportata di seguito è di 300 μL. Sulla base delle strutture lipidiche a doppio strato delle EV, è possibile utilizzare il colorante di membrana per contrassegnarle. Per i campioni di plasma sanguigno, CD18 per i linfociti14 viene scelto per la rappresentazione. Per i campioni ossei mascellari, viene selezionato come esempio il recettore associato agli osteoclasti (OSCAR) per gli osteoclasti15 . Prima della FC, assicurarsi che il citometro a flusso sia adattato alla misurazione degli EV16, poiché il limite inferiore delle dimensioni è ampiamente diverso tra citometri a flusso distinti.
<ol><li>Risospendere i campioni (fase 2.4) con 500 μL di PBS e trasferire 50 μL in una nuova e pulita provetta da centrifuga da 1,5 mL come controllo in bianco (tubo A) e altri 50 μL in una nuova e pulita provetta da centrifuga da 1,5 mL come semplice provetta di colorazione per FITC (tubo B). Aggiungere 0,5 μL di colorante di membrana al tubo primario per la colorazione della membrana. Incubare per 5 minuti a RT.</li>
	<li>Centrifugare il tubo primario per 30 minuti a 16.800 x g (4 °C). Scartare il surnatante e risospendere i pellet con 200 μL di PBS.</li>
	<li>Dividere ogni campione da 50 μL in quattro provette da centrifuga da 1,5 mL per semplici tubi di colorazione per PE (tubo C), colorazione con marcatori superficiali (tubo D) e controlli secondari solo anticorpali (tubo E).</li>
	<li>Aggiungere separatamente l'anticorpo primario di OSCAR nei campioni di EV ossea e l'anticorpo CD18 nei campioni di EV plasmatica (vedere Tabella dei materiali) al tubo B (fase 4.1) e al tubo D (punto 4.3) separatamente (diluito a 1:100). Incubare per 1 h a 4 °C.</li>
	<li>Centrifugare le provette per 30 minuti a 16.800 x g (4 °C). Scartare il surnatante, risospendere i pellet con 500 μL di PBS, quindi centrifugare nuovamente per 30 minuti a 16.800 x g (4 °C) per rimuovere gli anticorpi primari extra.</li>
	<li>Scartare il surnatante e risospendere i pellet con 50 μL di PBS, seguiti dall'aggiunta di anticorpi secondari coniugati con FITC (vedi Tabella dei materiali), rispettivamente (diluiti a 1:200) (tubo E). Aggiungere gli stessi anticorpi secondari al tubo B (punto 4.1) e al tubo D (punto 4.3). Incubare tutti i tubi per 1 ora, a 4 °C al buio. NOTA: Gli anticorpi di etichettatura coniugati a fluorescenza diretta possono anche essere utilizzati per elaborare la rilevazione FC con controlli isotipi appropriati.</li>
	<li>Diluire una goccia di sospensione di perline di dimensioni 0,2, 0,5 e 1 μm (vedere la tabella dei materiali) rispettivamente in 1 mL di PBS ed eseguire prima ciascuna perlina di dimensioni per assicurarsi del gate scelto per i veicoli elettrici. Impostare la soglia del citometro a flusso per cercare le perle e la popolazione EV utilizzando un appropriato forward scatter (FSC) e side scatter (SSC).<ol><li>Impostare la condizione terminale come calcolo di 100.000 particelle colorate con membrana. Analizzare il campione tramite un citometro a flusso secondo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali). I risultati rappresentativi sono mostrati nella Figura 3. NOTA: le apparecchiature NTA con canali di fluorescenza possono essere utilizzate anche per l'analisi dell'origine e la preparazione del campione è la stessa di FC.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Analisi del contenuto proteico delle EV
NOTA: L'analisi del contenuto proteico all'interno delle EV viene eseguita tramite western blot. Ad esempio, le EV plasmatiche e ossee sono state selezionate per analizzare la 6-fosfogluconato deidrogenasi (PGD) e la piruvato chinasi M2 (PKM2) per lo stato metabolico. Golgin84 (l'organello del Golgi) è stato usato come controllo negativo e Flotillin (proteina di membrana), Caveolina (proteina integrale delle caveole) e β-actina (il citoscheletro)17 sono stati usati come controllo positivo nelle EV rispetto ai campioni cellulari. Mitofilin e α-Actinin-4 sono stati scelti come marcatori EV di grandi dimensioni, mentre CD9 e CD81 sono stati scelti come marcatori EV piccoli per dimostrare le sottopopolazioni EV18. Apoa1 è stato selezionato come marcatore di lipoparticle plasmatico19. Per i rispettivi dettagli sul reagente, vedere la Tabella dei materiali.
<ol><li>Risospendere i pellet (fase 2.4) in 50 μL di tampone di lisi RIPA e incubare per 30 minuti su ghiaccio.</li>
	<li>Quantificare le concentrazioni proteiche di tutti i campioni nella micropiastra a 96 pozzetti mediante il saggio della proteina BCA seguendo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali).<ol><li>Diluire i 2 mg/ml di albumina sierica bovina (BSA) con lo 0,9% di soluzione salina normale (NS) (contenente 0,9% (p/v) di cloruro di sodio) in 0,5 mg/ml. Aggiungere 0,5 mg/ml di BSA e 0,9% di NS in tre pozzetti duplicati con determinati volumi, come mostrato nella Tabella 1.</li>
		<li>Eliminare 2 μL dei campioni (fase 5.1) e aggiungere 18 μL di NS in tre pozzetti duplicati separatamente.</li>
		<li>Preparare una soluzione di lavoro mescolando il reagente BCA A con il reagente B (50:1 Reagente A:B). Aggiungere 200 μL della soluzione di lavoro a ciascun pozzetto e agitare delicatamente per 30 s.</li>
		<li>Incubare la micropiastra a 96 pozzetti per 20-25 minuti a 37 °C.</li>
		<li>Misurare l'OD a 596 nm con lo spettrofotometro (vedere Tabella dei materiali).</li>
		<li>Esportare i dati.</li>
		<li>Disegna una curva standard e calcola la concentrazione proteica dei campioni.</li>
	</ol></li>
	<li>In base ai risultati, diluire i campioni a 1 μg/μL con lo 0,9% di NS e 5x SDS-PAGE buffer di caricamento (250 mM Tris· HCl, pH 6,8, 10% SDS, 30% (v/v) glicerolo, 10 mM DTT, 0,05% (p/v) blu di bromofenolo, vedi tabella dei materiali). Sigillare ermeticamente i tubi con la pellicola e riscaldare per 5 minuti a 100 °C.</li>
	<li>Caricare i campioni e la scala proteica in una concentrazione gradiente del 4%-20% Hepes-Tris gel (vedere Tabella dei materiali). NOTA: Scegliere la percentuale di gel in base al peso molecolare delle proteine di interesse.</li>
	<li>Eseguire il gel nel tampone corrente a 80 V fino a quando le proteine formano una linea, quindi passare a 120 V per 1 ora fino a quando il colorante di carico è sul fondo del gel. NOTA: Il tempo di funzionamento può variare a seconda dell'apparecchiatura utilizzata o del tipo e della concentrazione del gel.</li>
	<li>Trasferire il gel sulla membrana del fluoruro di polivinilidene (PVDF) (vedi Tabella dei materiali), pre-incubato in alcool metilico per 20 s. Utilizzare un sistema di trasferimento a umido per trasferire per 1 ora a 200 mA. ATTENZIONE: Assicurarsi che non vi sia alcuna bolla all'interno del sistema di trasferimento e mantenere umida la membrana PVDF. NOTA: Il tempo di trasferimento può variare in base al peso molecolare della proteina bersaglio; 1 KD di solito richiede 1 min.</li>
	<li>Preparare un tampone bloccante BSA al 5% aggiungendo 2,5 g di BSA (vedere la tabella dei materiali) in 50 mL di interpolazione salina tamponata Tris (TBST) (2 mL di Tween aggiunto in 2 L di soluzione PBS) in una provetta da centrifuga da 50 ml. Agitare fino a quando la polvere è sciolta. Bloccare le membrane in questo tampone per 2 ore a RT con agitazione.</li>
	<li>Incubare le membrane con anticorpi primari specifici diluiti con TBST in concentrazione adeguata (Mitofilin, 1:1000; α-Actinin-4, 1:1000; CD9, 1:1000; CD81, 1:1000; Apoa1, 1:1000; Golgin84, 1:1000; Flottiglia-1, 1:1000; Caveolina-1, 1:1000; PGD, 1:1000; PKM2, 1:1000; β-actina, 1:3000) durante la notte a 4 °C.</li>
	<li>Lavare le membrane nel tampone di lavaggio (2 mL di Tween aggiunti in 2 L di soluzione PBS) quattro volte (15 minuti ogni volta) e incubare le membrane con gli anticorpi secondari adatti a 1:4000 per 1 h a RT con agitazione.</li>
	<li>Lavare le membrane nel tampone di lavaggio quattro volte (15 minuti ogni volta) e visualizzare le membrane utilizzando il kit di chemiluminescenza e un sistema di imaging in gel (vedere la tabella dei materiali).</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Quando si studiano le caratteristiche, il destino e la funzione dei veicoli elettrici, è fondamentale isolare i veicoli elettrici con alta resa e bassa contaminazione. Esistono vari metodi per estrarre EV, come la centrifugazione a gradiente di densità (DGC), la cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) e i saggi di immunocattura 4,20. Qui è stato utilizzato uno dei metodi più comunemente usati, la centrifugazione differenziale; i vantaggi di questo sono che...

Le vescicole extracellulari (EV) sono state proposte per definire strutture extracellulari a doppio strato lipidico rilasciate dalle cellule1, che svolgono ruoli importanti in vari eventi fisiologici e patologici2. Le EV rilasciate da cellule sane possono essere ampiamente suddivise in due categorie principali, vale a dire esosomi (o piccole EV) formati attraverso una via di traffico endocitico intracellulare3 e microvescicole (o grandi EV) sviluppate dal germogliamento verso l'esterno della membrana plasmatica della cellula4. Mentre molti studi si concentrano sulla funzione delle EV raccolte da cellule in coltura in vitro5, le EV derivate dalla circolazione o dai tessuti sono più complesse ed eterogenee, che hanno il vantaggio di riflettere il vero stato dell'organismo in vivo6. Inoltre, quasi tutti i tipi di tessuti possono produrre EV in vivo , e questi EV possono agire come messaggeri all'interno del tessuto o essere trasferiti da vari fluidi corporei, in particolare il sangue periferico, per facilitare la comunicazione sistemica7. Anche i veicoli elettrici nella circolazione e nei tessuti sono bersagli per la diagnosi e il trattamento delle malattie8.
Mentre gli esosomi sono stati intensamente studiati negli ultimi anni, le microvescicole hanno anche importanti funzioni biologiche, che possono essere facilmente estratte senza ultracentrifugazione, promuovendo così la ricerca di base e clinica9. In particolare, un problema critico per quanto riguarda le EV isolate dalla circolazione e dai tessuti è che derivano da diversi tipi di cellule10. Poiché le microvescicole sono eliminate dalla membrana plasmatica e caratterizzate da un'abbondanza di molecole della superficie cellulare9, è possibile utilizzare marcatori della membrana cellulare madre per identificare l'origine cellulare di questi EV. In particolare, la tecnica di citometria a flusso (FC) può essere applicata per rilevare marcatori di membrana. Inoltre, i ricercatori possono isolare i veicoli elettrici e fare ulteriori analisi basate sui carichi funzionali.
Il presente protocollo fornisce una procedura completa per l'estrazione e la caratterizzazione delle EV da campioni in vivo. Gli EV sono isolati tramite centrifugazione differenziale e la caratterizzazione dei veicoli elettrici include l'identificazione morfologica tramite analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) e microscopia elettronica a trasmissione (TEM), analisi dell'origine tramite FC e analisi del carico proteico tramite western blot. Il plasma sanguigno e l'osso mascellare dei topi sono usati come rappresentanti. I ricercatori possono fare riferimento a questo protocollo per i veicoli elettrici da altre fonti e apportare le modifiche corrispondenti.

<table><tbody><tr><td>4% paraformaldeide&nbsp;</td><td>Biosharp</td><td>143174</td><td>Microscopio elettronico a trasmissione</td></tr><tr><td>Alexa fluor 488 anticorpo secondario anti-capra</td><td>Yeason</td><td>34306ES60</td><td>Citometria a flusso</td></tr><tr><td>Alexa fluor 488 anticorpo secondario anti-coniglio</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>Citometria a flusso</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD18</td><td>Abcam</td><td>ab131044</td><td>Citometria a flusso</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD81</td><td>Abcam</td><td>ab109201</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>anticorpo anti-CD9</td><td>Huabio</td><td>ET1601-9</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-mitofilina</td><td>Abcam</td><td>ab110329</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>APOA1 Coniglio pAb</td><td>Abclone</td><td>A14211</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Kit per il dosaggio delle proteine BCA</td><td>TIANGEN</td><td>PA115</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>BLUeye Prestained Protein Ladder</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94964-500UL</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>MP Biomedical</td><td>218072801</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Anticorpo Caveolina-1</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-53564</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>CellMask Colorazione arancione della membrana plasmatica</td><td>Invitrogen</td><td>C10045</td><td>Citometria a flusso</td></tr><tr><td>Chemiluminescenza</td><td>Amersham Biosciences</td><td>N/A</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Forbice operativa curva</td><td>Strumento chirurgico JZ Isolamento</td><td>J21040</td><td>EV Bilancia</td></tr><tr><td>elettronica</td><td>Zhi Ke</td><td>Isolamento ZK-DST</td><td>EV</td></tr><tr><td>Spettrofotometro Epoch</td><td>BioTek</td><td>N/A</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Eppendorf Eppendorf Isolamento</td><td>Eppendorf</td><td>3810X</td><td>EV</td></tr><tr><td>Anticorpo Flotillin-1</td><td>PTM BIO</td><td>PTM-5369</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Sistema di imaging su gel</td><td>Tanon</td><td>4600</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Golgin84</td><td>Novus</td><td>nbp1-83352</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Griglie - Formvar/Rivestimento in carbonio - Rame 200 mesh</td><td>Polysciences</td><td>24915</td><td>Microscopio elettronico a trasmissione</td></tr><tr><td>Soluzione di eparina</td><td>StemCell&nbsp;</td><td>7980</td><td>Isolamento EV</td></tr><tr><td>Liberase Research Grade</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5401127001</td><td>Isolamento EV</td></tr><tr><td>Pinzetta microscopica</td><td>JZ Strumento chirurgico</td><td>JD1020</td><td>Isolamento EV Citometro</td></tr><tr><td>a flusso NovoCyte</td><td>ACEA</td><td>N/A</td><td>Citometria a flusso</td></tr><tr><td>Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 pozzetti</td><td>Epizyme</td><td>LK206</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>OSCAR( D-19) anticorpo</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-34235</td><td>Citometria a flusso</td></tr><tr><td>PBS (2x)</td><td>ZHHC</td><td>PW013</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Pentobarbital sodico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>57-33-0</td><td>Anestetizzazione</td></tr><tr><td>Perossidasi AffiniCapra Pura Anti-Topo IgG (H+L)</td><td>Jacson</td><td>115-035-003</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Perossidasi AffiniCapra Pura Anti-Coniglio IgG (H+L)</td><td>Jacson</td><td>111-035-003</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Acido fosfotungstico</td><td>RHAWN</td><td>12501-23-4</td><td>Microscopio elettronico a trasmissione</td></tr><tr><td>PKM2 (d78a4) xp rabbit&nbsp; mab&nbsp;</td><td>Cell Signaling</td><td>4053t</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Film di polietilene (PE)</td><td>Xiang yi</td><td>200150055</td><td>Microscopio elettronico a trasmissione</td></tr><tr><td>Membrane di fluoruro di polivinilidene&nbsp;</td><td>Roche</td><td>3010040001</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Inibitori della proteasi</td><td>Roche</td><td>4693132001</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Anticorpo ricombinante anti-PGD</td><td>Abcam</td><td>ab129199</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Tampone di lisi RIPA</td><td>Beyotime</td><td>P0013</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Tampone di caricamento SDS-PAGE (5x)</td><td>Cwbio</td><td>CW0027S</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Perline</td> <td>di dimensioniInvitrogen</td><td>F13839</td><td>Citometria a flusso</td></tr><tr><td>Microcentrifughe da tavolo ad alta velocità Isolamento</td><td>Hitachi</td><td>CT15E</td><td>EV</td></tr><tr><td>Microscopio elettronico a trasmissione</td><td>HITACHI</td><td>H-7650</td><td>Microscopio elettronico a trasmissione</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>MP Biomedicals</td><td>19472</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Vortex Mixer Genie</td><td>Scientific Industries</td><td>SI0425</td><td>Isolamento EV</td></tr><tr><td>ZetaView BASIC NTA - Videomicroscopio per tracciamento di nanoparticelle PMX-120</td><td>Particle Metrix</td><td>N/A</td><td>Analisi per il tracciamento di nanoparticelle</td></tr><tr><td>&alpha;-Actininin-4 Coniglio mAbclone</td><td></td><td>A3379</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>&beta;-actina</td><td>Cwbio</td><td>CW0096M</td><td>Western blot</td></tr></tbody></table>

isolamento e analisi di vescicole extracellulari tracciabili e funzionalizzate dal plasma e dai tessuti solidi

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

Le vescicole extracellulari circolanti e residenti nei tessuti (EV) rappresentano obiettivi promettenti come nuovi biomarcatori teranostici ed emergono come attori importanti nel mantenimento dell'omeostasi dell'organismo e nella progressione di un ampio spettro di malattie. Mentre la ricerca attuale si concentra sulla caratterizzazione degli esosomi endogeni di origine endosomiale, le microvescicole che sbiancano dalla membrana plasmatica hanno guadagnato crescente attenzione nella salute e nella malattia, che sono caratterizzate da un'abbondanza di molecole superficiali che ricapitolano la firma della membrana delle cellule madri. Qui viene presentata una procedura riproducibile basata sulla centrifugazione differenziale per estrarre e caratterizzare le EV dal plasma e dai tessuti solidi, come l'osso. Il protocollo descrive inoltre la successiva profilazione degli antigeni di superficie e dei carichi proteici delle EV, che sono quindi tracciabili per le loro derivazioni e identificati con componenti correlate alla funzione potenziale. Questo metodo sarà utile per l'analisi correlata, funzionale e meccanicistica delle EV in studi biologici, fisiologici e patologici.

Secondo il flusso di lavoro sperimentale, le EV possono essere estratte dal sangue periferico e dai tessuti solidi (Figura 1). L'osso mascellare di un topo di 8 settimane è di circa 0,1 ± 0,05 g e circa 300 μL di plasma possono essere raccolti dal topo. Seguendo le fasi del protocollo, è possibile raccogliere rispettivamente 0,3 mg e 3 μg di EV. Come analizzato da TEM e NTA, le caratteristiche morfologiche tipiche delle EV sono vescicole rotonde a membrana a forma di coppa con un diametro co...

Il presente protocollo descrive un metodo per estrarre vescicole extracellulari dal sangue periferico e dai tessuti solidi con successiva profilazione degli antigeni di superficie e dei carichi proteici.

Isolamento e analisi di vescicole extracellulari tracciabili e funzionalizzate dal plasma e dai tessuti solidi

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

Questo protocollo fornisce un modo fattibile per isolare e raccogliere le giuste vescicole extracellulari dalla maggior parte del sangue e dei tessuti solidi, in particolare analizzare la loro fonte e il contenuto proteico, il che aiuta ulteriori esperimenti funzionali. Oltre all'alta resa e alla bassa contaminazione, il principale vantaggio di questo protocollo è l'analisi degli antigeni di superficie e dei carichi proteici delle EV, utile per studi fisiologici e patologici. Facilita la diagnosi di tumori di malattie, come le malattie infiammatorie e l'osteoporosi attraverso la rilevazione di marcatori di superficie delle cellule parentali delle vescicole extracellulari con un citometro a flusso.La quantità di vescicola extracellulare tissutale è fondamentale per i seguenti esperimenti. Assicurati che la concentrazione di vescicole extracellulari non sia elevata. Sii paziente per eseguire la diluizione.Per iniziare, preparare i campioni di osso mascellare isolando l'osso mascellare con pinzette oftalmiche e forbici e lavarli con PBS per eliminare i tessuti molli con una pinzetta. Quindi mettere l'osso mascellare in provette da centrifuga da 1,5 millilitri e tagliare l'osso in piccoli pezzi di un millimetro di diametro con le forbici. Aggiungere una certa quantità di Liberase per coprire il tessuto e incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius.Quindi, centrifugare il campione a 800 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius e trasferire con attenzione il surnatante con una pipetta in una nuova e pulita provette da centrifuga da 1,5 millilitri. Dopo aver centrifugato i campioni di plasma e ossa preparati per 15 minuti a 2.500 G e quattro gradi Celsius per rimuovere i detriti di grandi cellule e le piastrine rimanenti, trasferire con attenzione i surnatanti in provette da centrifuga da 1,5 millilitri nuove e pulite e centrifugare a 16.800 G per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi, scartare il surnatante e risospendere i pellet in ciascun tubo con un millilitro di PBS.Dopo aver centrifugato e scartato il surnatante come dimostrato in precedenza, di nuovo, risospendere i pellet in ogni tubo con 50 microlitri di PBS e conservare questi campioni a quattro gradi Celsius per meno di 24 ore o preferibilmente utilizzarli immediatamente per le analisi. Risospendere i campioni con 500 microlitri di PBS e trasferire 50 microlitri in un nuovo e pulito tubo da centrifuga da 1,5 millilitri come controllo in bianco etichettato come tubo A e altri 50 microlitri in un altro tubo di centrifuga pulito da 1,5 millilitri come semplice tubo di colorazione per FITC, etichettato come tubo B.Aggiungere 0,5 microlitri di colorante di membrana al tubo primario per la colorazione della membrana durante l'incubazione per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo aver centrifugato il tubo primario per 30 minuti a 16.800 G e scartato il surnatante, risospendere il pellet con 200 microlitri di PBS.Dividere ogni campione da 50 microlitri in quattro provette da centrifuga da 1,5 millilitri per semplici provette di colorazione per PE etichettato come tubo C, colorazione marcatore di superficie etichettata come tubo D e controlli secondari solo anticorpali etichettati come tubo E.Aggiungere separatamente l'anticorpo primario del recettore associato agli osteoclasti e dei campioni di vescicole extracellulari ossee, nonché i campioni di anticorpi CD-18 e vescicole extracellulari plasmatiche al tubo B e al tubo D, separatamente, incubazione per un'ora a quattro gradi Celsius. Centrifugare i tubi e scartare il surnatante come dimostrato in precedenza e risospendere il pellet con 500 microlitri di PBS. Di nuovo, centrifugare per 30 minuti a 16, 800 G e quattro gradi Celsius per rimuovere gli anticorpi primari extra.Dopo aver scartato il surnatante risospendere i pellet con 50 microlitri di PBS, seguiti dall'aggiunta di anticorpi secondari coniugati FITC rispettivamente nel tubo E.Incubare tutti i tubi per un'ora a quattro gradi Celsius al buio. Diluire una goccia di 0,2, 0,5 e una sospensione di perline di dimensioni micrometriche rispettivamente in un millilitro di PBS. Quindi eseguire ogni dimensione di perline per assicurarsi del gate scelto per le vescicole extracellulari e impostare la soglia del citometro a flusso per cercare le perle e la popolazione di vescicole extracellulari utilizzando un opportuno scatter interno in avanti.Impostare la condizione terminale come calcolo di 100.000 particelle colorate di membrana e analizzare il campione tramite un citometro a flusso come descritto nel manoscritto. Risospendere i pellet in 50 microlitri di tampone di lisi RIPA e incubare per 30 minuti su ghiaccio. Per quantificare le concentrazioni proteiche di tutti i campioni nella micropiastra a 96 pozzetti mediante il test della proteina BCA, diluire i due milligrammi per millilitri di BSA con lo 0,9% di soluzione salina normale in 0,5 milligrammi per millilitri.A 0,5 milligrammi per millilitro di BSA e 0,9% di soluzione salina normale in tre pozzetti duplicati con determinati volumi. Quindi far cadere due microlitri dei campioni e aggiungere 18 microlitri di soluzione salina normale in tre pozzetti duplicati separatamente. Dopo aver preparato una soluzione di lavoro mescolando il reagente BCA A con il reagente B, aggiungere 200 microlitri della soluzione di lavoro a ciascun pozzetto e agitare delicatamente per 30 secondi.Quindi incubare la micropiastra a 96 pozzetti per 20-25 minuti a 37 gradi Celsius e misurare la densità ottica a 596 nanometri con lo spettrofotometro. Successivamente, esportare i dati, disegnare una curva standard e calcolare la concentrazione proteica dei campioni. Secondo i risultati, diluire i campioni a un microgrammo per microlitro con lo 0,9% di soluzione salina normale e cinque volte la concentrazione del tampone di carico SDS-PAGE e sigillare ermeticamente i tubi con pellicola e riscaldare per cinque minuti a 100 gradi Celsius.Caricare i campioni nella scala proteica in una concentrazione gradiente dal quattro al 20% del gel tris di HEPy. Eseguire il gel nel tampone corrente a 80 volt fino a quando le proteine formano una linea. Quindi passare a 120 volt per un'ora fino a quando il colorante di carico è sul fondo del gel.Trasferire il gel sulla membrana di fluoruro di polivinilidene preincubata in alcool metilico per 20 secondi utilizzando un sistema di trasferimento a umido per trasferire per un'ora a 200 milliampere. Preparare il tampone bloccante al 5% BSA aggiungendo 2,5 grammi di BSA e 50 millilitri di TBST in una provetta da centrifuga da 50 millilitri. Bloccare le membrane in questo tampone per due ore a temperatura ambiente con agitazione.Incubare le membrane con anticorpi primari specifici diluiti con TBST in concentrazione adeguata durante la notte a quattro gradi Celsius. Lavare le membrane nel tampone di lavaggio quattro volte e incubare le membrane con anticorpi secondari adatti per un'ora a temperatura ambiente con agitazione. Dopo aver lavato le membrane nel tampone di lavaggio quattro volte, visualizzare le membrane utilizzando il kit di chemiluminescenza in un sistema di imaging del gel.La microscopia elettronica a trasmissione e l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle hanno rivelato che le caratteristiche morfologiche tipiche delle vescicole extracellulari erano rotonde e a forma di coppa con un diametro compreso tra 500 e 300 nanometri. L'analisi della citometria a flusso mostra le percentuali di specifici marcatori di membrana espressi sulle vescicole extracellulari che implica la loro origine dalle cellule madri. L'analisi Western blot mostra l'espressione di PGD e PKM2 rispettivamente come rappresentante del contenuto proteico e delle vescicole extracellulari plasmatiche e delle vescicole extracellulari ossee, indicando lo stato metabolico.L'espressione negativa di Golgin-84 nelle vescicole extracellulari è stata rilevata con la presenza di mitofilina, alfa-actinina-4, flottilina-1, caveolina-1 e beta-actina, insieme al marcatore delle vescicole CD9, mentre l'espressione di CD81 è bassa o assente con una mancanza di APO-A-1 nelle vescicole extracellulari plasmatiche. Ricercatori, quindi tenendo presente che il passaggio 2.2, la preparazione e la digestione dei campioni di tessuto dovrebbero essere fatte a sufficienza. Altrimenti, il numero di vescicole extracellulari estratte dai tessuti è limitato.Il marcatore marcato colorazione fluorescente delle vescicole extracellulari può essere iniettato nella bocca per trattare la fase che si collega alla funzione potenziale.

isolation-analysis-traceable-functionalized-extracellular-vesicles

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Le vescicole extracellulari presenti nel sangue sono state suggerite come nuovi biomarcatori per varie malattie. Qui, presentiamo un protocollo per l'isolamento di microvescicole derivate da grandi membrane plasmatiche da campioni di sangue periferico e la loro successiva analisi mediante citometria a flusso convenzionale e Western Blotting.

Isolamento e caratterizzazione di microvescicole da sangue periferico

Questo è un protocollo per isolare le vesciche extracellulari del tessuto (EV) dal fegato. Il protocollo descrive un processo in due fasi che coinvolge la perfusione di collagenasi seguito da ultracentrifugazione differenziale per isolare gli EV del tessuto epatico.

Isolamento dei Tessuti Vescicoli Extracellulari dal Fegato

In questo protocollo, descriviamo il flusso di lavoro completo per rapido isolamento delle vescicole extracellulari da sangue umano intero e la caratterizzazione di marcatori specifici di analisi di fluorescenza-basata nanoparticle tracking. I risultati presentati mostrano un elevato livello di riproducibilità e possono essere regolati per i surnatanti di coltura cellulare.

Rapida caratterizzazione basata sulla fluorescenza delle singole vescicole extracellulari nel sangue umano con analisi Nanoparticle tracking

Qui, forniamo un protocollo dettagliato per isolare piccole vescicole extracellulari (SVE) dai tessuti interi, compresi i campioni di cervello e del tumore. Questo metodo offre una tecnica riproducibile per estrarre SVE da tessuto solido per ulteriori analisi a valle.

Estrazione delle vescicole extracellulari dal tessuto intero

La presente relazione evidenzia i requisiti cronologici per l'isolamento delle vesciche extracellulari (EV) da microglia o macrofagi di sangue. Gli EV derivati dalla microglia sono stati valutati come regolatori dell'escrescenza di neurite, mentre gli EV derivati dai macrofaci di sangue sono stati studiati nel controllo dell'invasione delle cellule glioma C6 nei saggi in vitro. L'obiettivo è comprendere meglio queste funzioni EV come mediatori immunitari in microambienti specifici.

Caratterizzazione delle vescicoli extracellulari derivati dalle cellule immunitarie e studio dell'impatto funzionale sull'ambiente cellulare

Il protocollo qui dimostra che le vescicole extracellulari possono essere adeguatamente separate dai terreni di coltura cellulare condizionati utilizzando la cromatografia ad esclusione dimensionale.

Cromatografia ad esclusione dimensionale per separare le vescicole extracellulari dai terreni di coltura cellulare condizionati

L'ultima generazione di strumenti di caratterizzazione dei veicoli elettrici è in grado di eseguire l'analisi di singoli veicoli elettrici su più parametri contemporaneamente. La citometria a nano-flusso misura tutte le particelle biologiche più grandi di 45 nm senza etichettatura e identifica le caratteristiche specifiche delle sottopopolazioni mediante una varietà di tecniche di etichettatura fluorescente.

Caratterizzazione di proteine transmembrana di vescicole extracellulari singole mediante citometria a nano-flusso

Il presente protocollo fornisce descrizioni dettagliate per l'isolamento efficiente delle vescicole extracellulari urinarie utilizzando microsfere magnetiche funzionalizzate. Inoltre, comprende analisi successive, tra cui western blotting, proteomica e fosfoproteomica.

Isolamento chimico basato sull'affinità di vescicole extracellulari da biofluidi per analisi proteomiche e fosfoproteomiche

Questo articolo descrive una metodologia per l'isolamento, la caratterizzazione e la quantificazione di vescicole extracellulari (EV) derivate dal plasma umano e presenta un flusso di lavoro per l'analisi label-free del proteoma EV utilizzando cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS).

Isolamento, caratterizzazione e analisi proteomica di vescicole extracellulari derivate dal plasma per la scoperta di biomarcatori cardiovascolari

Qui, dimostriamo il metodo di caratterizzazione delle vescicole extracellulari (EV) raccolte da fluidi biologici, come lacrime e saliva, di soggetti umani. Lo scanner utilizzato in questo metodo è in grado di rilevare il fenotipo, le dimensioni e il conteggio totale delle particelle delle vescicole extracellulari a partire da 1 μL del campione.

Caratterizzazione delle vescicole extracellulari da fluidi biologici

Questo protocollo descrive l'isolamento di piccole vescicole extracellulari da muscoli scheletrici murini e midollo osseo tramite digestione enzimatica e cromatografia a esclusione di dimensioni, consentendo il recupero riproducibile di frazioni arricchite da vescicole da tessuti strutturalmente complessi e a basso rendimento per l'analisi molecolare a valle.

Isolamento di piccole vescicole extracellulari da muscolo scheletrico murino e midollo osseo tramite cromatografia a esclusione di dimensioni

Scopri un protocollo per isolare vescicole extracellulari da sangue e tessuti solidi con alta resa e bassa contaminazione. Questo metodo consente l'analisi degli antigeni di superficie e del contenuto proteico per studi fisiologici e patologici.

Isolamento e analisi di vescicole extracellulari tracciabili e funzionalizzate dal plasma e dai tessuti solidi

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