Name: Rilevamento e quantificazione di nanotubi a effetto tunnel mediante immagini 3D Volume View (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 45 s
Description: Impara a rilevare e quantificare i nanotubi a effetto tunnel mediante immagini 3D Volume View. Questo metodo manuale consente di identificare strutture F-actin sospese tra cellule per studiare la comunicazione intercellulare in modelli di malattia.

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D.K.V e A.R ringraziano la Manipal Academy of Higher Education per la borsa di studio TMA Pai. Ringraziamo il Science and Engineering Research Board of India per SERB-SRG (#SRG/2021/001315), nonché l'Indian Council of Medical Research of India (#5/4-5/Ad-hoc/Neuro/216/2020-NCD-I) e il fondo intramurale della Manipal Academy of Higher Education, Manipal, India. Ringraziamo la struttura confocale del JNCASR (Jawaharlal Nehru Centre for Advanced Scientific Research, India) e B. Suma per la microscopia confocale in JNCASR.

NOTA: Le cellule SH-SY5Y coltivate in terreni DMEM/F-12 sono state differenziate con acido retinoico 10 μM per 7 giorni e trattate con oligomeri oAβ da 1 μM per 2 ore a 37 °C (5% CO2). Dopo il trattamento, le cellule sono state fissate con la soluzione fissativa di Karnovsky e doppiamente immunocolorate con anticorpo fosfo-PAK1 (Thr423)/PAK2 (Thr402) e falloidina legante la F-actina. Successivamente, sono state scattate immagini confocali z-stack utilizzando un microscopio a scansione laser confocale. I TNT sono stati quantificati mediante conteggio manuale e distinti da altri neuriti / protrusioni cellulari costruendo immagini di visualizzazione del volume 3D e identificando le strutture dalla loro caratteristica di librarsi tra due cellule senza toccare il substrato (Figura 1).
1. Coltura cellulare e differenziamento
<ol><li>Coltura delle cellule neuronali SH-SY5Y in terreni DMEM/F12 (Ham) 1:1 con il 10% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di miscela penicillina-streptomicina-neomicina (PSN). Seminare le cellule in un piatto di imaging da 35 mm con un pozzetto da 14 mm costituito da un coprislip #1.5 al centro del piatto attaccato al fondo. Seminare le cellule sulla piastra di imaging ad una concentrazione di 12.000 cellule / cm2 ed eseguire gli esperimenti al 60% -70% di confluenza.</li>
	<li>Differenziare parzialmente le cellule con acido retinoico (RA) 10 μM da una soluzione madre da 100 mM (5 mg di RA in 15 ml di dimetilsolfossido [DMSO]). Quindi, incubare le cellule per 7 giorni a 37 °C (5% CO 2) per la differenziazione con cambio di terreno ogni2 giorni. NOTA: Fare attenzione a mantenere la confluenza (60%-70%) delle cellule (sia cellule indifferenziate che parzialmente differenziate). La densità cellulare può influenzare la formazione di TNT tra le cellule.</li>
</ol>2. Preparazione di oligomeri di amiloide-β1-42 (oAβ) per il trattamento delle cellule neuronali
<ol><li>Sciogliere Aβ 1-42 (1 mg) in 200 μL di 1,1,1,3,3,3-esafluoro-2-propanolo e dividere la soluzione in 20 aliquote, ciascuna contenente 0,05 mg di peptidi. Liofilizzare e conservare le aliquote a -20 °C per un uso successivo.</li>
	<li>Preparare la soluzione madre (5 mM) dell'Aβ 1-42 liofilizzato in DMSO aggiungendo 2,2 μL di DMSO a 0,05 mg di peptide liofilizzato. Per sciogliere accuratamente i peptidi, vortice la soluzione e sonicare per 2 minuti in un sonicatore a bagnomaria.</li>
	<li>Diluire la soluzione madre ad una concentrazione di 100 μM in DMEM, pH 7,4, e vortice per convertire i peptidi in monomeri, seguita dall'incubazione a 4 °C per 24 ore per ottenere oligomeri di Aβ 1-42 (oAβ)12,21,22. </li>
	<li>Caratterizzare oAβ prima degli esperimenti come riportato in precedenza21,22 mediante microscopia elettronica a trasmissione.</li>
	<li>Trattare le cellule SH-SY5Y parzialmente differenziate con 1 μM oAβ. Rimuovere il mezzo prima dei trattamenti e aggiungere DMEM fresco privo di FBS. Dopo la modifica del terreno, aggiungere oAβ (100 μM) precedentemente preparato al mezzo fino ad una concentrazione finale di 1 μM. Incubare le cellule con 1 μM oAβ per 2 ore a 37 °C (5% CO2). Includere un controllo negativo sotto forma di cellule non trattate.</li>
</ol>3. Immunocolorazione di F-actina e PAK1 attivato per la caratterizzazione di TNT
<ol><li>Eseguire l'immunocolorazione differenziale utilizzando l'anticorpo fosfo-PAK1 (Thr423) / PAK2 (Thr402) e la fallotossina falloidina legante la F-actina.</li>
	<li>Lavare le cellule di controllo e trattate con oAβ con 1x soluzione salina tamponata fosfato (PBS) per 2 x 2 minuti prima della fissazione. Preparare la soluzione fissativa di Karnovsky utilizzando il fissativo in formalina al 2% e glutaraldeide al 2,5% disciolto in tampone fosfato 0,1 M, pH 7,2. Quindi, fissare le cellule nella parabola di imaging aggiungendo la soluzione fissativa di Karnovsky (quanto basta per coprire le cellule) per 45 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare le celle fisse 2 x 2 min utilizzando il tampone di incubazione. Preparare il tampone di incubazione (20x) sciogliendo 0,1 g di saponina in 5 mL di FBS e diluire a 1x aggiungendo 95 mL di 1x PBS.</li>
	<li>Dopo la fissazione, aggiungere il primo anticorpo contro phopho-PAK1 ad una diluizione di 1:250 nel tampone di incubazione e incubare per una notte a 4 °C in una camera umida buia.</li>
	<li>Il giorno successivo, dopo 24 ore di incubazione, lavare le cellule 2 x 2 min con il tampone di incubazione; quindi, aggiungere l'anticorpo secondario coniugato ad Alexa Fluor 488 (diluizione 1:1.000) e Phalloidin 555 (diluizione 1:1.000). Incubare le cellule nella camera umida buia per 1,5 ore a temperatura ambiente.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, lavare le cellule 2 x 2 minuti con tampone di incubazione. Colorare il nucleo aggiungendo 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) in una diluizione 1:2.000 e incubare per 5 minuti a 10 minuti a temperatura ambiente al buio.</li>
	<li>Preparare il mezzo di montaggio DABCO utilizzando 25 mg di DABCO in glicerolo al 90% e 10% 1x PBS. Per sciogliere correttamente, regolare il pH a 8,6 utilizzando il grado spettrofotometrico, diluire HCl (diluito 1:20 con acqua) e mantenere la soluzione su un bilanciere per la miscelazione.</li>
	<li>Come agente anti-sbiancamento, aggiungere il supporto di montaggio DABCO direttamente sulla piastra di imaging contenente il vetrino di copertura nella parte inferiore. Attendere almeno 1-2 ore e procedere direttamente all'esecuzione dell'imaging confocale. NOTA: Non sono necessari adesivi per fissare i vetrini.</li>
</ol>4. Immunocolorazione della tubulina F-actina e β-III per distinguere i TNT dai neuriti
<ol><li>Eseguire l'immunocolorazione differenziale con l'anticorpo della tubulina β-III e la fallotossina falloidina legante la F-actina.</li>
	<li>Lavare le cellule trattate con oAβ 2x con 1x PBS prima di aggiungere la soluzione fissativa di Karnovsky. Incubare le cellule per 45 minuti a temperatura ambiente e lavare le celle 2 x 2 minuti con tampone di incubazione.</li>
	<li>Dopo la fissazione, aggiungere l'anticorpo contro la tubulina β-III (TUBb3) ad una diluizione di 1:250 nel tampone di incubazione e incubare a 4 °C per una notte nella camera umida buia.</li>
	<li>Il giorno successivo, lavare le cellule con tampone di incubazione (2 x 2 min) e aggiungere l'anticorpo secondario coniugato ad Alexa Fluor 488 (diluizione 1:1.000) e Phalloidin 555 (diluizione 1:1.000) insieme allo stesso piatto. Quindi, incubare le cellule per 1,5 ore a temperatura ambiente nella camera umida buia.</li>
	<li>Lavare le celle 2 volte con tampone di incubazione e aggiungere DAPI a colorazione nucleare in una diluizione 1:2.000 per 5-10 minuti a temperatura ambiente al buio.</li>
	<li>Aggiungere l'agente anti-sbiancante DABCO nel mezzo di montaggio come menzionato sopra e attendere 2 ore prima di eseguire l'imaging.</li>
</ol>5. Imaging con microscopia confocale
<ol><li>Per identificare i TNT, acquisire immagini z-stack di cellule immunocolorate utilizzando un microscopio a scansione laser confocale. Scatta le immagini utilizzando l'obiettivo DIC dell'olio 40x/1.40 con set di filtri DAPI, isotiocianato di fluoresceina (FITC) e tetrametilrodamina (TRITC).</li>
	<li>Innanzitutto, selezionare i canali facendo clic sui laser richiesti in sequenza nelle finestre Traccia 1, Traccia 2 e Traccia 3 nel software confocale. Fare clic sull'opzione T-PMT sotto la finestra Traccia 1 per acquisire le immagini DIC (Differential Interference Contrast) con canali di fluorescenza. NOTA: le immagini DIC vengono acquisite da un rilevatore diverso etichettato come T-PMT.</li>
	<li>Selezionare la scheda di acquisizione del software, fare clic sulla scheda Z-stack e attendere che si apra una finestra. Quindi, fai clic su Live Scan per mettere a fuoco le celle nella parte inferiore del piatto. Selezionare l'immagine focalizzata come prima pila. Quindi, concentrati verso l'alto per vedere la parte più in alto della cella e selezionala come ultima pila. Interrompere la scansione in tempo reale e fare clic sul numero accanto alla scheda ottimale per correggere la dimensione del passo delle pile. La dimensione del passo determina il numero di sezioni e gli intervalli in base allo spessore delle celle. NOTA: la dimensione del passo verrà selezionata in base al campionamento di Nyquist per prendere abbastanza fette e garantire che non ci siano spazi vuoti tra le due pile. Il campionamento di Nyquist è determinato sulla base dell'obiettivo e delle lunghezze d'onda delle luci23.</li>
	<li>Acquisisci immagini sequenziali di tre canali DAPI, FTICC e TRITC con laser a 405 nm, 488 nm e 561 nm e acquisisci con un tempo di permanenza dei pixel di 1,02 μs. Cattura immagini nel canale DIC con canali di fluorescenza per osservare il confine cellulare.</li>
	<li>Cattura una pila di immagini con le dimensioni di x: 224,92 μm e y: 224,92 μm, con ogni pixel di dimensioni 220 nm2 e scala z di 415 nm.</li>
	<li>Scatta immagini catturando diversi z-stack (15-22 stack) dal basso verso l'alto delle celle. Acquisire almeno 10 immagini dal campo casuale del piatto di coltura per ottenere un totale di ~ 200-300 cellule.</li>
	<li>Analizza le immagini acquisite offline per identificare i TNT mediante l'analisi della vista del volume 3D</li>
</ol>6. Analisi di immagini confocali z-stack per identificare e quantificare TNT
<ol><li>Aprire le immagini confocali salvate in formato dati .czi nel software Fiji per l'analisi.</li>
	<li>Selezionare l'opzione Hyperstack per visualizzare ogni z-stack e canale dell'immagine. Cercare gli hyperstack degli z-stack e dei canali, che si aprono in un'unica finestra, come illustrato nella Figura 2. Scorri le barre di scorrimento del canale (indicato da frecce rosse e verdi) e z-stack (indicato da frecce blu) per selezionare lo stack esatto di un particolare canale di interesse. NOTA: Nelle celle fisse, poiché i TNT sospesi o i condotti della membrana rimangono sopra la superficie, le strutture non sono visibili nelle parti inferiori delle pile z. Tuttavia, nelle cellule fisse, i neuriti giacciono sulla superficie e sono rilevabili nelle parti inferiori delle z-stack (z = da 0 a 2). Vedere la Figura 2 per i passaggi di identificazione.</li>
	<li>Come mostrato nella Figura 2, selezionare prima il canale colorato di F-actina (indicato da frecce rosse) scorrendo la barra del canale. Quindi, scorri manualmente le pile z (indicate da frecce blu) per vedere ogni pila una per una. Identificare le strutture colorate con F-actina che sembrano collegare le cellule, sono visibili nelle parti inferiori delle pile z e sono vicine alla superficie della parabola di imaging (z = 2) come neuriti (indicate da frecce bianche). NOTA: La maggior parte dei neuriti sono facili da identificare in quanto appaiono come sporgenze estese (indicate da frecce rosa).</li>
	<li>Identificare i TNT, i condotti cellula-cellula F-actina-positivi, scorrendo le pile z verso l'alto (da z = 4 nella Figura 2; indicato da frecce gialle). Cerca i neuriti vicino alle parti inferiori delle pile di z verso la superficie e osserva che iniziano a scomparire con lo scorrimento delle pile di z verso l'alto (a z = 6 nella Figura 2; i neuriti non sono chiaramente visibili).</li>
	<li>Identificare i TNT fosfo-PAK1-positivi in modo simile ai TNT F-actina-positivi analizzando la natura sospesa dei condotti dagli z-stack. Poiché la colorazione fosfo-PAK1 è più debole della colorazione F-actina, cerca TNT colorati con phopho-PAK1 a z = 4 (debolmente visibile) e a z = 6 (prominente).</li>
	<li>Inoltre, osservare le immagini DIC per verificare che le strutture TNT colorate con F-actina e fosfo-PAK1 siano condotti di membrana tra le cellule (Figura 3). Inoltre, unire i canali F-actina (rosso) e fosfo-PAK1 (verde) per verificare che i TNT identificati siano strutture co-colorate con F-actina e fosfo-PAK1 (Figura 3).</li>
	<li>Per quantificare i TNT, contare manualmente i numeri totali di celle e i TNT identificati e rappresentare i numeri come percentuali.</li>
	<li>Per distinguere i TNT F-actina-positivi e i condotti sospesi positivi alla tubulina β-III (TUBb3), simili al TNT, dalle immagini z-stack, unire i canali F-actina (rosso) e TUBb3 (verde) (Figura 4). Quindi, analizza gli z-stack delle immagini unite.<ol><li>Cerca esclusivamente TNT colorati con F-actina che sono debolmente visibili a z = 3 e prominenti a z = 6 e z = 9 (frecce gialle). Allo stesso modo, identificare F-actina e tubulina β-III (TUBb3) doppiamente positivi, condotti sospesi simili a TNT a z = 6 e z = 9 (frecce ciano). Identificare altre sporgenze non sospese colorate con tubulina F-actina e β-III dalle parti inferiori delle pile z (frecce bianche).</li>
	</ol></li>
	<li>Misurare il diametro dei TNT utilizzando lo strumento linea nelle Figi. Verificare la scala di misurazione facendo clic su Analizza | Impostare Scala in modo che la "distanza in pixel" venga impostata automaticamente dalle immagini .czi. Misurare i diametri dei TNT sul piano xy. NOTA: la maggior parte dei diametri sono compresi tra 1 pixel e 4 pixel (cioè 220-880 nm); Ogni pixel è di 220 nm. Vedere la Figura 5 per un riepilogo del protocollo per l'analisi delle immagini confocali z-stack.</li>
</ol>7.3D ricostruzione di immagini z-stack per caratterizzare TNT
<ol><li>Utilizzare il plug-in del visualizzatore di volumi nelle Figi, che consente il reslicing 3D e la visualizzazione 3D abilitata alla soglia (Figura 6).</li>
	<li>Dividi le immagini z-stack in singoli canali. Quindi, ritagliate le immagini z-stack a canale singolo (canale F-actina) per utilizzare la vista di ricostruzione 3D per evidenziare uno o due TNT o neuriti alla volta. Abilita il plug-in di visualizzazione del volume per visualizzare le viste xy, yz e xz.</li>
	<li>Fissare un singolo TNT o neurite nel piano xy (le frecce bianche rappresentano i neuriti nella Figura 6A; le frecce gialle rappresentano i TNT nella Figura 6B) e contrassegnare le sezioni trasversali degli assi xz (rosso) e yz (verde). Osservare i neuriti nella parte inferiore del piano xz nei piani xz e yz (frecce bianche, Figura 6A) e i TNT nelle pile z superiori (frecce gialle, Figura 6B).</li>
	<li>Selezionare il singolo TNT o neurite per ricostruire la vista del volume 3D nel piano xz (Figura 6C, D). Nella ricostruzione 3D, osservare i neuriti nella parte inferiore del piano z (frecce bianche, Figura 6C) e i TNT che appaiono come strutture sospese che collegano due celle senza toccare il piano z inferiore (frecce gialle, Figura 6D).</li>
</ol>

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<li>Pontes, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+elastic+properties+of+tunneling+nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Structure and elastic properties of tunneling nanotubes.</a> European Biophysics Journal. 37 (2), 121-129 (2008).</li>
<li>Haimovich, G., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+mRNA+transfer+between+mammalian+cells+in+coculture+by+single-molecule+fluorescent+in+situ+hybridization+%28smFISH%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detection of mRNA transfer between mammalian cells in coculture by single-molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH).</a> Methods in Molecular Biology. 2038, 109-129 (2019).</li>
<li>Janardhan, K. S., Jensen, H., Clayton, N. P., Herbert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+in+investigative+and+toxicologic+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry in investigative and toxicologic pathology.</a> Toxicologic Pathology. 46 (5), 488-510 (2018).</li>
<li>Qin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+combination+of+paraformaldehyde+and+glutaraldehyde+is+a+potential+fixative+for+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">The combination of paraformaldehyde and glutaraldehyde is a potential fixative for mitochondria.</a> Biomolecules. 11 (5), 711(2021).</li>
<li>Graham, R. C., Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histochemical+demonstration+of+monoamine+oxidase+activity+by+coupled+peroxidatic+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">The histochemical demonstration of monoamine oxidase activity by coupled peroxidatic oxidation.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 13 (7), 604-605 (1965).</li>
</ol>

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da rivelare.

Diversi ricercatori negli ultimi 2 decenni hanno cercato di capire e caratterizzare la struttura dei TNT18. La mancanza di marcatori specifici ostacola il progresso e vi è una crescente domanda di un metodo conveniente e standardizzato che possa essere utilizzato per identificare, caratterizzare e quantificare i TNT. I TNT sono definiti come condotti di membrana a base di F-actina che si librano tra due cellule. Gli studi hanno dimostrato che i neuriti in via di sviluppo β-tubulina-positivi, vicin...

I nanotubi a effetto tunnel (TNT) sono condotti di membrana basati su F-actina, principalmente aperti e svolgono un ruolo vitale nel trasferimento intercellulare di carichi e organelli1. La caratteristica unica dei TNT è che collegano le cellule vicine senza alcun contatto con il substrato; Sono lunghi oltre 10-300 μm e i loro diametri variano tra 50 nm e 1 μm 2,3. I TNT sono strutture transitorie e la loro durata dura da pochi minuti a diverse ore. I TNT sono stati dimostrati per la prima volta nelle cellule neuronali PC121; Successivamente, numerosi studi hanno dimostrato la loro esistenza in diversi tipi di cellule in vitro e in vivo 4,5. Diversi studi hanno rivelato il significato patologico dei TNT in vari modelli di malattia, come le malattie neurodegenerative, il cancro e le infezioni virali 6,7,8.
Le eterogeneità strutturali dei TNT sono state dimostrate da diversi studi in vari sistemi cellulari9. Le differenze si basano sulla composizione del citoscheletro, sul meccanismo di formazione e sui tipi di carico trasferiti10. In primo luogo, la continuità di membrana aperta, F-actina-positiva che si libra tra due cellule vicine e trasferisce organelli è considerata costituita da TNT11. Tuttavia, la mancanza di chiarezza o diversità osservata nella formazione dei TNT aumenta la difficoltà nello sviluppo di marcatori specifici per TNT. Pertanto, è difficile identificare le strutture TNT con metodi di rilevamento convenzionali e distinguere i nanotubi di membrana in termini di sporgenze aperte e chiuse12. Tuttavia, la caratteristica dei TNT di librarsi come sporgenze della membrana F-actina tra due cellule è relativamente più facile e più fattibile da identificare utilizzando le tecniche di imaging convenzionali. Altre protrusioni cellulari basate sull'actina come la filopodia e la filopodia dorsale non possono librarsi tra due cellule distanti, in particolare quando le cellule sono fisse. Da notare, i neuriti in via di sviluppo chiusi, accoppiati elettricamente, sono spesso definiti strutture simili a TNT13.
È noto che la F-actina svolge un ruolo importante nella formazione del TNT e diversi studi hanno dimostrato che l'inibitore della F-actina citocalasina D inibisce la formazione di TNT14,15. Al contrario, gli inibitori dei microtubuli non hanno alcun effetto sulla formazione di TNT16. Gli ultimi 2 decenni hanno visto diversi rapporti sul ruolo significativo che i TNT svolgono nella diffusione della patologia e della resistenza e terapia tumorale17. Pertanto, c'è una domanda infinita di tecniche migliori per la caratterizzazione del TNT.
La mancanza di marcatori specifici di TNT e la diversità nella morfologia e nella composizione citoscheletrica rendono difficile lo sviluppo di un metodo unico di caratterizzazione. Alcuni studi hanno utilizzato tecniche di rilevamento automatico delle immagini e quantificazione del TNT18,19. Tuttavia, ci sono diversi vantaggi dell'attuale metodo di analisi manuale del volume 3D rispetto all'analisi automatica delle immagini per il rilevamento e la quantificazione dei TNT. Spesso, gli occhi umani addestrati possono individuare queste nanostrutture sospese più facilmente di un metodo di rilevamento automatico delle immagini. Inoltre, i metodi di rilevamento automatico potrebbero essere difficili da implementare nei laboratori privi di esperienza algoritmica. Il presente metodo potrebbe essere ampiamente adottato dai ricercatori grazie alla sua precisione e riproducibilità.
In uno studio recente, abbiamo dimostrato che oAβ promuove la biogenesi del TNT nelle cellule neuronali attraverso un meccanismo di endocitosi mediato da PAK1, actina-dipendente,12. I TNT indotti da oAβ esprimono anche PAK1 attivato (o fosfo-PAK1). Abbiamo sviluppato un metodo di ricostruzione dell'immagine con vista del volume 3D per distinguere i TNT immunocolorati da oAβ, F-actina e fosfo-PAK1. I neuriti in via di sviluppo positivi alla tubulina β-III assomigliano spesso a strutture sospese simili a TNT20. Quindi, abbiamo ulteriormente distinto i TNT a base di F-actina dai neuriti positivi alla tubulina β-III e da altre sporgenze simili al TNT. Le immagini 3D della vista del volume sono state utilizzate per identificare i TNT sulla base delle loro caratteristiche di librarsi sopra il substrato e rimanere connessi tra due celle vicine. Questo articolo descrive l'identificazione e il rilevamento di condotti a membrana contenenti actina o TNT utilizzando immagini confocali z-stack e, infine, la quantificazione manuale delle strutture identificate da immagini di ricostruzione della vista del volume 3D. Il metodo presentato non è in grado di distinguere i TNT propri aperti dalle strutture simili al TNT chiuse; questo metodo aiuta a identificare i TNT in coltura cellulare 2D in vitro su un substrato piatto. Tuttavia, il metodo è facile da implementare e riprodurre e può essere ampiamente utilizzato per la quantificazione precisa dei soli TNT a base di actina e per distinguerli dai neuriti e dalle strutture simili al TNT positivo alla β-tubulina.

<table><tbody><tr><td>Piatto da 35 mm con pozzetto da 14 mm realizzato con vetrino coprioggetto #1.5</td><td>Cellvis</td><td>D35-14-1.5-N</td><td>Piatto di imaging utilizzato per seminare le cellule per esperimenti di colorazione</td></tr><tr><td>A&beta; (1-42) 1 mg</td><td>AnaSpec</td><td>#64129</td><td>Oligomeri di beta amiloide per trattare le cellule</td></tr><tr><td>Farina Alexa 488 IgG anti-coniglio di capra (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11070</td><td>Anticorpo secondario per fosfo-PAK1</td></tr><tr><td>Cabina di sicurezza biologica</td><td>Thermo Scientific (MSC Advantage)</td><td>51025411</td><td>Fornisce condizioni asetiche durante la coltura cellulare</td></tr><tr><td>CO2 Incubatore</td><td>Thermo Electron Corporation (Heraeus Hera Cell 240)</td><td>51026556</td><td>Per la crescita di cellule a temperatura corporea o vicino alla temperatura corporea</td></tr><tr><td>Microscopio a scansione laser confocale</td><td>ZEISS (Carl Zeiss)</td><td>LSM 880</td><td>In grado di generare immagini tridimensionali di campioni di grandi dimensioni a super-risoluzione</td></tr><tr><td>DABCO [1,4-Diazobiciclo-(2,2,2) ottano]</td><td>Merck</td><td>8034560100</td><td>Reagente anti-sbiancamento</td></tr><tr><td>DAPI (4&prime;,6-diamidino-2-fenilidolo)</td><td>Sigma</td><td>D9542-1MG</td><td>Coloratore Neuclear</td></tr><tr><td>DMEM media</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td>Utilizzato per la preparazione di 100uM di A&beta; (1-42)</td></tr><tr><td>&nbsp; DMEM/F12 (miscela 1:1 di DMEM e Ham' s F12)</td><td>Gibco</td><td>12500062</td><td>Terreni di coltura per SH-SY5Y</td></tr><tr><td>DMSO (dimetilsolfuro) Grado di coltura cellulare</td><td>Cryopur</td><td>CP-100</td><td>Grado di coltura cellulare utilizzato come agente di dissoluzione per l'acido retinoico</td></tr><tr><td>DMSO (dimetilsolfuro) Grado molecolare</td><td>Himedia</td><td>MB058</td><td>Utilizzato come uno degli agenti di dissoluzione per l'A&beta liofilizzato; (1-42)</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Gibco</td><td>16000044</td><td>&nbsp; Integratore principale per terreni di coltura (origine USA)</td></tr><tr><td>Fissativo in formalina (tamponato neutro 10%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT5014-120ML</td><td>Componente nella soluzione fissativa di Karnovsky</td></tr><tr><td>Glutaraldeide (Grado I, 25% in H2O)</td><td>Sigma</td><td>G5882</td><td>Componente nella soluzione fissativa di Karnovsky</td></tr><tr><td>Soluzione HFIP (1,1,1,3,3-esafluoro-2-propanolo )</td><td>TCI</td><td>H024</td><td>Utilizzato per sciogliere A&beta; (1-42) 1 mg</td></tr><tr><td>Software di elaborazione/analisi delle immagini: FIJI (ImageJ)</td><td>National Institute of Health (NIH)</td><td></td><td>Utilizzato per elaborare/analizzare le immagini e per differenziare i TNT dai neuriti utilizzando il suo plug-in denominato "visualizzatore di volume".</td></tr><tr><td>Liofilizzante</td><td>Cristo, Alfa</td><td>2,4 LDplus</td><td>0,05 mg aliquote di A&beta; (1-42) può essere memorizzato in -20 &deg; C solo dopo liofilizzazione</td></tr><tr><td>Miscela Penicillina-Streptomicina-Neomicina</td><td>Thermo fisher Scientific</td><td>15640055</td><td>Miscela di antibiotici</td></tr><tr><td>Falloidina-iFlor 555</td><td>Abcam</td><td>ab176756</td><td>Colorante legante F-actina</td></tr><tr><td>Fosfo-PAK1 (Thr423) /PAK2 (Thr402) [Coniglio]</td><td>CST</td><td>#2601</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>primario Anticorpo policlonale contro la tubulina beta 3 (TUBb3)</td><td>Clone</td> <td>della nuvolaPAE711Hu01</td><td>Anticorpo primario</td></tr><tr><td>Acido retinoico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625-50MG</td><td>Reagente differenziante</td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Merck</td><td>8047-15-2</td><td>Detergente utilizzato nel tampone di incubazione nell'immunocolorazione Sonicatore</td></tr> a <tr><td>bagno d'acqua (Quart, valvola di scarico Riscaldatore)</td><td>Pulitore ad ultrasuoni</td><td>3.0 L/3.2</td><td>Sonicatore utilizzato per sciogliere A&beta; (1-42) brodo, dopo l'aggiunta di DMSO durante la preparazione di 100 &micro; M A&beta; (1-42)</td></tr><tr><td>Software di microscopia ZEN</td><td>ZEISS (Carl Zeiss)</td><td></td><td>Software di imaging per l'acquisizione di immagini di microscopia confocale con automazione intelligente</td></tr></tbody></table>

rilevamento e quantificazione di nanotubi a effetto tunnel mediante immagini 3d volume view

Detection and Quantification of Tunneling Nanotubes Using 3D Volume View Images

Recenti scoperte hanno rivelato che le cellule eseguono un trasferimento intercellulare diretto, a lungo raggio, tramite condotti su nanometria, membrana di actina, vale a dire "nanotubi tunneling" (TNT). I TNT sono definiti come estensioni di membrana a doppio strato lipidico aperte che mediano la continuità tra cellule vicine di diametro compreso tra 50 nm e 1 μm. I TNT sono stati dimostrati inizialmente nelle cellule neuronali, ma studi successivi hanno rivelato l'esistenza di TNT in diversi tipi di cellule e malattie, come malattie neurodegenerative, infezioni virali e cancro. Diversi studi hanno fatto riferimento a nanostrutture di membrana chiuse e accoppiate elettricamente tra cellule vicine come TNT o strutture simili al TNT.
La spiegazione dell'ultrastruttura in termini di continuità della membrana all'endpoint è tecnicamente impegnativa. Inoltre, gli studi sulla comunicazione cellula-cellula sono impegnativi in termini di caratterizzazione dei TNT utilizzando metodi convenzionali a causa della mancanza di marcatori specifici. I TNT sono principalmente definiti come protrusioni di membrana aperte a base di F-actina. Tuttavia, una delle principali limitazioni è che la F-actina è presente in tutti i tipi di protrusioni, rendendo difficile differenziare i TNT da altre protrusioni. Una delle caratteristiche notevoli dei TNT a base di F-actina è che queste strutture si librano tra due cellule senza toccare il substrato. Pertanto, TNT distinti colorati con F-actina possono essere convenientemente distinti da altre sporgenze come filopodi e neuriti in base al loro librarsi tra le cellule.
Abbiamo recentemente dimostrato che l'internalizzazione dell'amiloide-β oligomerica1-42 (oAβ) attraverso l'endocitosi actina-dipendente stimola la chinasi-1 attivata da p21 attivata (PAK1), che media la formazione di TNT contenenti F-actina coespressi con fosfo-PAK1 tra cellule neuronali SH-SY5Y. Questo protocollo delinea un metodo di analisi del volume 3D per identificare e caratterizzare i TNT dalle immagini z-stack catturate di protrusioni di membrana immunocolorate con F-actina e fosfo-PAK1 in cellule neuronali trattate con oAβ. Inoltre, i TNT si distinguono dallo sviluppo di neuriti e escrescenze neuronali basate su condotti di membrana con tubazione tubulinica F-actina e β-III.

Qui, identifichiamo e caratterizziamo i TNT indotti da oAβ nelle cellule neuronali SH-SY5Y costruendo viste del volume 3D da immagini confocali z-stack (Figura 1). Le cellule sono state doppiamente immunocolorate con F-actina e fosfo-PAK1. Sono state analizzate immagini z-stack confocali di cellule immunocolorate per identificare i TNT (Figura 2). Inoltre, le immagini DIC sono state analizzate per verificare che le strutture TNT colorate con F-actina e fosfo-PAK...

I nanotubi a effetto tunnel (TNT) sono principalmente nanotubi di membrana F-actina aperti che collegano le cellule vicine, facilitando la comunicazione intercellulare. La caratteristica notevole che distingue i TNT da altre protrusioni cellulari è la natura sospesa dei nanotubi tra le cellule. Qui, caratterizziamo i TNT costruendo una vista del volume 3D di immagini z-stack confocali.

Rilevamento e quantificazione di nanotubi a effetto tunnel mediante immagini 3D Volume View

Recent discoveries have revealed that cells perform direct, long-range, intercellular transfer via nano-scale, actin-membrane conduits, namely ...

La mancanza di marcatori specifici per i nanotubi a effetto tunnel limita i progressi nel campo e vi è una crescente domanda di un metodo per identificare, caratterizzare e quantificare i nanotubi a effetto tunnel. I metodi di rilevamento automatico sono difficili da implementare senza l'esperienza per sviluppare un algoritmo e / o modificare l'algoritmo esistente, ma il nostro metodo manuale è facile da implementare con maggiore precisione. Il trasferimento intercellulare a lungo raggio tramite nanotubi a tunnel è implementato in diversi modi in vari modelli di malattia, tra cui la patologia neurodegenerativa, la diffusione virale e il cancro.Pertanto, gli studi sui nanotubi a effetto tunnel per comprendere il loro ruolo nella patogenesi sono importanti. È possibile che i nanotubi a effetto tunnel possano rompersi durante il processo di colorazione. Evitare l'uso di vetrine di copertura e il montaggio sulle diapositive, utilizzando invece piastre di imaging con fondo in vetro.Il protocollo di fissazione modificato aiuta a mantenere intatti i nanotubi tunneling. A dimostrare la procedura sarà Deepak KV, dottorando del laboratorio di Sangeeta NAF. Per iniziare, lavare il controllo e le cellule oligomeriche trattate con A-beta due volte con PBS per due minuti prima della fissazione.Preparare la soluzione fissativa di Karnovsky utilizzando il fissativo al 2% di formalina e il 2,5% di glutaraldeide disciolti in tampone fosfato molare 0,1 di pH 7,2. Quindi fissare le cellule nel piatto di imaging aggiungendo la soluzione fissativa di Karnovsky per 45 minuti a temperatura ambiente. Preparare il tampone di incubazione sciogliendo 0,1 grammi di saponina in cinque millilitri di FBS e diluito aggiungendo 95 millilitri di PBS.Quindi lavare le celle fisse due volte utilizzando il tampone di incubazione per due minuti. Dopo la fissazione, aggiungere il primo anticorpo contro il fosfo-PAK1, aggiungere una diluizione da uno a 250 nel tampone di incubazione e incubare per una notte a quattro gradi Celsius in una camera buia e umida. Il giorno successivo, dopo 24 ore di incubazione, lavare le cellule due volte con il tampone di incubazione per due minuti.Quindi aggiungere anticorpi secondari coniugati ad Alexa Fluor 488 e Phalloidin 555. Incubare le cellule nella camera buia e umida per 1,5 ore a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, lavare le cellule due volte con tampone di incubazione per due minuti.Colorare il nucleo aggiungendo DAPI in una diluizione da uno a 2000 e incubare per cinque a 10 minuti a temperatura ambiente al buio. Preparare il mezzo di montaggio DABCO utilizzando 25 milligrammi di DABCO in glicerolo al 90% e PBS al 10%. Per sciogliere correttamente, regolare il pH a 8,6 utilizzando acido cloridrico diluito di grado spettrofotometrico e mantenere la soluzione su un bilanciere per la miscelazione.Come agente anti-sbiancamento, aggiungere il supporto di montaggio DABCO direttamente sulla piastra di imaging contenente il vetrino di copertura nella parte inferiore. Attendere almeno una o due ore e procedere direttamente all'esecuzione dell'imaging confocale. Per identificare i nanotubi tunneling, acquisire immagini Z-stack di cellule immunocolorate utilizzando un microscopio a scansione laser confocale selezionando prima i canali e facendo clic sui laser richiesti in sequenza nelle finestre traccia uno, traccia due e traccia tre nel software confocale.Fare clic sull'opzione TPMT sotto la finestra traccia uno per acquisire le immagini di contrasto di interferenza differenziale con i canali di fluorescenza. Selezionare la scheda Acquisizione del software, fare clic sulla scheda Z-stack e attendere che si apra una finestra. Quindi fare clic su Live Scan per mettere a fuoco le celle nella parte inferiore del piatto.Selezionare l'immagine attiva come prima pila, quindi mettere a fuoco verso l'alto per visualizzare la parte più in alto della cella e selezionarla come ultima pila. Interrompere la scansione in tempo reale e fare clic sul numero accanto alla scheda Ottimale per correggere la dimensione del passo delle pile che determina il numero di sezioni e gli intervalli in base allo spessore delle celle. Acquisisci immagini sequenziali di tre canali DAPI, FITC e TRITC con laser a 405 nanometri, 488 nanometri e 561 nanometri e acquisisci con un tempo di permanenza dei pixel di 1,02 microsecondi.Cattura immagini nel canale DIC con canali di fluorescenza per osservare il confine cellulare. Apri le immagini confocali salvate in formato dati czi nel software Fiji per l'analisi. Selezionare l'opzione Hyperstack per visualizzare ogni Z-stack e canale dell'immagine.Scorri il canale e le barre di scorrimento Z-stack per selezionare lo stack esatto di un particolare canale di interesse. Quindi selezionare prima il canale colorato di F-actina scorrendo la barra dei canali e scorrere manualmente le pile Z per vedere ciascuna pila una per una. Identificare le strutture colorate con F-actina che sembrano collegare le cellule che sono visibili nelle parti inferiori delle pile Z e sono vicine alla superficie della parabola di imaging con Z uguale a due come neuriti.Identificare i nanotubi tunneling, i condotti F-actina positiva da cella a cellula facendo scorrere le pile Z verso l'alto da Z uguale a quattro. Cerca i neuriti vicino alle parti inferiori delle pile Z verso la superficie e osserva che iniziano a scomparire con lo scorrimento delle pile Z verso l'alto a Z uguale a sei. Identificare i nanotubi tunneling positivi al fosfo-PAK1 in modo simile ai nanotubi tunneling positivi F-actina analizzando la natura sospesa dei condotti dalle pile Z.Poiché la colorazione fosfo-PAK1 è più debole della colorazione F-actina, cercare nanotubi tunneling colorati con fosfo-PAK1 a Z uguale a quattro e a Z uguale a sei. Inoltre, osservare le immagini DIC per verificare che le strutture dei nanotubi tunneling colorati con F-actina e fosfo-PAK1 siano condotti di membrana tra le cellule. Inoltre, unire i canali F-actina e fosfo-PAK1 per verificare che i nanotubi tunneling identificati siano strutture co-colorate con F-actina e fosfo-PAK1.Per quantificare i nanotubi tunneling, contare manualmente il numero totale di celle e i nanotubi a effetto tunnel identificati e rappresentare i numeri in percentuale. Per distinguere i nanotubi tunneling positivi per la tubulina F-actina e beta III come condotti sospesi dalle immagini Z-stack, unire i canali della tubulina F-actina e beta III, quindi analizzare gli stack Z delle immagini unite. Cerca esclusivamente nanotubi a tunnel colorati con F-actina che sono debolmente visibili a Z uguale a tre e prominenti a Z uguale a sei e Z uguale a nove.Allo stesso modo, identificare F-actina e tubulina beta III. nanotubi a effetto tunnel a doppio positivo come condotti sospesi a Z uguale a sei e Z uguale a nove. Identificare altre sporgenze non sospese colorate con tubulina F-actina e beta III dalle parti inferiori delle pile Z.Misurare il diametro dei nanotubi a effetto tunnel utilizzando lo strumento Linea nelle Figi. Verificare la scala di misura facendo clic su Analizza e quindi impostare la scala in modo che la distanza in pixel venga impostata automaticamente dalle immagini czi. Misurare i diametri dei nanotubi tunneling sul piano XY.Utilizzando il plug-in Volume Viewer nelle Fiji che consente il re-slicing 3D e la visualizzazione 3D abilitata alla soglia, suddividere le immagini Z-stack in singoli canali. Quindi ritaglia le immagini Z-stack a canale singolo per utilizzare la vista di ricostruzione 3D per evidenziare uno o due nanotubi o neuriti tunneling alla volta. Appuntare un singolo nanotubo o neurite tunneling nel piano XY e contrassegnare le sezioni trasversali di accesso XZ e YZ.Osservate i neuriti nella parte inferiore del piano XZ, nei piani XZ e YZ, e i nanotubi tunneling nelle pile Z superiori. Selezionare i singoli nanotubi o neuriti a effetto tunnel per ricostruire la vista del volume 3D nel piano XZ. Nella ricostruzione 3D, osserva i neuriti sul fondo del piano Z e i nanotubi a tunnel che appaiono come strutture sospese che collegano due cellule senza toccare il piano Z inferiore.Sono state analizzate immagini confocali Z-stack di cellule immunocolorate con F-actina e fosfo-PAK1 per identificare nanotubi tunneling. Inoltre, le immagini DIC sono state analizzate per verificare che le strutture di nanotubi a tunnel colorati con F-actina e fosfo-PAK1 fossero condotti di membrana tra le cellule. Le cellule sono state doppiamente immunocolorate con tubulina F-actina e beta III e i nanotubi tunneling F-actina e i condotti a doppia membrana positiva a membrana F-actina e beta III simili a nanotubi tunneling sono stati distinti dai soli nanotubi tunneling F-actina positivi.I nanotubi tunneling co-espressi con fosfo-PAK1 e F-actina sono stati distinti dalle protrusioni cellulari di altri neuriti costruendo immagini di visualizzazione del volume 3D basate sulla loro caratteristica di librarsi tra due cellule senza toccare il substrato. L'uso del giusto agente fissativo è importante in quanto la fissazione imperfetta del campione può portare a una rapida degradazione proteolitica delle proteine bersaglio e ad una riduzione dell'immunoreattività specifica.

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