Name: Modello di mal di schiena di topo indotto dallattivatore del plasminogeno di tipo urochinasi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 20 s
Description: Impara un metodo non invasivo per indurre dolore cronico alla schiena nei topi fino a 10 settimane usando iniezione intraligamentosa di attivatore del plasminogeno. Questa tecnica richiede minima formazione e supporta la ricerca sui meccanismi del dolore.

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Il finanziamento della sovvenzione è stato fornito da NIH HEAL UG3 NS123958. Le strutture abitative sono state ispezionate e accreditate dall'AAALAC. Gli animali sono stati ospitati nella struttura di stabulazione dell'Animal Resources Center (ARC) gestita dal personale del laboratorio e dal personale della Division of Laboratory and Animal Resources (DLAR). Le procedure per i test comportamentali sono metodi standard nel campo come approvato dall'American Pain Society e dall'International Association for the Study of Pain. Il metodo di eutanasia è coerente con le raccomandazioni del gruppo di esperti scientifici sull'eutanasia dell'American Veterinary Medical Association.

<ol><li>O'Sullivan, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Back+to+basics%3A+10+facts+every+person+should+know+about+back+pain%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Back to basics: 10 facts every person should know about back pain.</a> British Journal of Sports Medicine. 54 (12), 698-699 (2020).</li>
<li>Nauta, H. J., McIlwrath, S. L., Westlund, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Punctate+midline+myelotomy+reduces+pain+responses+in+a+rat+model+of+lumbar+spine+pain%3A+evidence+that+the+postsynaptic+dorsal+column+pathway+conveys+pain+from+the+axial+spine%5BTitle%5D)+AND+%22Cureus%22%5BJournal%5D)">Punctate midline myelotomy reduces pain responses in a rat model of lumbar spine pain: evidence that the postsynaptic dorsal column pathway conveys pain from the axial spine.</a> Cureus. 10 (3), 2371(2018).</li>
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<li>Kim, H., Hong, J. Y., Lee, J., Jeon, W. -J., Ha, I. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-1%CE%B2+promotes+disc+degeneration+and+inflammation+through+direct+injection+of+intervertebral+disc+in+a+rat+lumbar+disc+herniation+model%5BTitle%5D)+AND+%22The+Spine+Journal%22%5BJournal%5D)">IL-1β promotes disc degeneration and inflammation through direct injection of intervertebral disc in a rat lumbar disc herniation model.</a> The Spine Journal. 21 (6), 1031-1041 (2021).</li>
<li>Millecamps, M., Tajerian, M., Sage, E. H., Stone, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+signs+of+chronic+back+pain+in+the+SPARC-null+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Behavioral signs of chronic back pain in the SPARC-null mouse.</a> Spine. 36 (2), 95-102 (2011).</li>
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<li>Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+tactile+allodynia+in+the+rat+paw%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw.</a> Journal of Neuroscience Methods. 53 (1), 55-63 (1994).</li>
<li>Takao, K., Miyakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light%2Fdark+transition+test+for+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Light/dark transition test for mice.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (1), e104(2006).</li>
<li>Deuis, J. R., Dvorakova, L. S., Vetter, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+used+to+evaluate+pain+behaviors+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Methods used to evaluate pain behaviors in rodents.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 284(2017).</li>
<li>David, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis-dependent+and+-independent+effects+of+fluoxetine+in+an+animal+model+of+anxiety%2Fdepression%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis-dependent and -independent effects of fluoxetine in an animal model of anxiety/depression.</a> Neuron. 62 (4), 479-493 (2009).</li>
<li>Yalcin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time-dependent+history+of+mood+disorders+in+a+murine+model+of+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">A time-dependent history of mood disorders in a murine model of neuropathic pain.</a> Biological Psychiatry. 70 (10), 946-953 (2011).</li>
<li>Madathil, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-specific+overexpression+of+insulin-like+growth+factor-1+protects+hippocampal+neurons+and+reduces+behavioral+deficits+following+traumatic+brain+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-specific overexpression of insulin-like growth factor-1 protects hippocampal neurons and reduces behavioral deficits following traumatic brain injury in mice.</a> PloS One. 8 (6), e67204(2013).</li>
<li>Sugimoto, H., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-cost+protocol+of+footprint+analysis+and+hanging+box+test+for+mice+applied+the+chronic+restraint+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Low-cost protocol of footprint analysis and hanging box test for mice applied the chronic restraint stress.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e59027(2019).</li>
<li>Hassan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+chronic+low+back+pain+phenotypic+domains+and+characteristics+accounting+for+individual+variation%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Identifying chronic low back pain phenotypic domains and characteristics accounting for individual variation: a systematic review.</a> Pain. , (2023).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione. KNW riconosce la consulenza non retribuita con NeuroChronix, Bessor Pharma e USA Elixeria BioPharm, Inc.

Questo modello di mal di schiena cronico è semplice da indurre e l'ipersensibilità stabilita entro 1 settimana può durare fino a (e possibilmente oltre) 8 settimane. Ciò consente uno studio accurato dello stato di dolore cronico rispetto ad altri modelli acuti che durano solo una settimana o due. Mentre mostriamo il modello nei topi, il modello CBP indotto da uPA può essere stabilito anche nei ratti2. Un vantaggio del modello è che il decorso prolungato provoca lo sviluppo di comportamenti simili ...

La lombalgia è una delle cause più comuni di disabilità, con 1 persona su 5 che ne soffre in tutto il mondo. Nonostante questi sforzi, pochi modelli animali affidabili di mal di schiena sono comunemente utilizzati nella ricerca sugli animali nel campo del dolore, specialmente nei topi. I modelli precedenti hanno fatto uso quasi esclusivamente di ratti per l'induzione del mal di schiena cronico (CBP) come quelli indotti dall'iniezione di attivatore del plasminogeno urinario (uPA) nell'articolazione della faccetta lombare 2,3, dall'iniezione del fattore di crescita nervoso (NGF) nella muscolatura del tronco4, o dallo iodoacetato monosodico (MIA)5 o dall'interleuchina-1beta6 iniezione nel disco intravertebrale. Naturalmente, i ratti sono preferiti per questi modelli principalmente a causa delle loro dimensioni maggiori e della facilità di accesso per l'iniezione di agenti infiammatori.
Per essere chiari, esistono modelli murini di mal di schiena, come il modello murino SPARC-null di degenerazione del disco intervertebrale utilizzato permolti anni, ma questi sono più costosi e richiedono più tempo per essere stabiliti rispetto ai modelli basati sull'iniezione. Un recente studio sui topi ha stabilito un modello di mal di schiena combinando l'iniezione di NGF nei muscoli lombari con lo stress di contenzione cronica verticale8. Nel seguente protocollo, abbiamo adattato il modello CBP indotto da uPA dai ratti per i topi2. L'ipersensibilità si instaura entro 1 settimana e persiste fino a 6-8 settimane. Inoltre, abbiamo stabilito che i topi sviluppano comportamenti simili all'ansia e alla depressione. Data la prevalenza del mal di schiena e l'uso più comune dei topi nella ricerca sul dolore molecolare, questo modello durevole è prontamente stabilito per l'uso nello sviluppo di nuove strategie di trattamento per alleviare il mal di schiena.

<table><tbody><tr><td>Animali e materiali di consumo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% etanolo</td><td>Fonte</td><td></td><td></td>locale</tr><tr><td>BALB/c topi</td><td>Envigo</td><td></td><td>20-25 g</td></tr><tr><td>Batuffoli di cotone</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-090-702</td><td></td></tr><tr><td>Applicatori con punta in cotone</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-062-616</td><td></td></tr><tr><td>Inalante di isoflurano anestetico</td><td>MedVet</td><td>RXISO-250</td><td></td></tr><tr><td>Nastro adesivo</td><td>Fisher Scientific</td><td>NGFP7002</td><td></td></tr><tr><td>Guanti da esame in nitrile</td><td>Fisher</td> Scientific <td></td><td></td></tr><tr><td>Serbatoio di ossigeno</td><td>Fonte</td><td></td><td></td>locale</tr><tr><td>Telo chirurgico, Steri-Drape Utility Sheet, Prevenzione assorbente VWR</td><td></td><td>76246-788</td><td>tagliato in pezzi da 15 x 15 cm</td></tr><tr><td>Tubo Tygon da 3 mm diametro interno</td><td>Grainger</td><td>22XH87</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>#11 lame per bisturi in acciaio al carbonio</td><td>VWR</td><td>21909-612</td><td></td></tr><tr><td>Camera di induzione per anestesia...</td><td>Summit Medical Equipment Company</td><td>AS-01-0530-LG</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Unità</td><td></td><td></td>locale</tr><tr><td>Biologia Dumont #5 pinze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Sterilizzatore a perle di vetro Germinatore 500</td><td>VWR</td><td>102095-946</td><td></td></tr><tr><td>IITC Life Sciences Serie 8 Modello PE34 Misuratore di analgesia su piastra caldo/freddo</td><td>IITC</td><td>PE34</td><td></td></tr><tr><td>Integra Miltex cotone & pinze per medicazione&nbsp;</td><td>Safco Dental Supply</td><td>66-317</td><td></td></tr><tr><td>OPTIKA CL31 illuminatore LED a doppio braccio&nbsp;</td><td>New York Microscope Company</td><td>OPCL-31</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di test plantare con emettitore a infrarossi, ad esempio Apparecchio Hargreaves</td><td>Ugo Basile</td><td>37370-001 e 37370-002</td><td></td></tr><tr><td>Manico per bisturi n. 3</td><td>VWR</td><td>25607-947</td><td></td></tr><tr><td>Termoforo per piccoli animali&nbsp;</td><td>Valley Vet Supply</td><td>47375</td><td></td></tr><tr><td>Forbici a molla per studenti Vannas, lama dritta&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>Workstation portatile per anestesia per ricerca animale da tavolo " PAM"</td><td>Patterson Scientific</td><td>AS-01-0007</td><td></td></tr><tr><td>Filamenti di Von Frey</td><td>Ugo Basile</td><td>37450-275</td><td></td></tr></tbody></table>

modello di mal di schiena di topo indotto dall'attivatore del plasminogeno di tipo urochinasi

Urokinase-type Plasminogen Activator-induced Mouse Back Pain Model

Un modello di dolore lombare persistente può essere indotto nei topi con la semplice metodologia qui descritta. I metodi passo-passo per l'induzione semplice e rapida di un modello di mal di schiena persistente nei topi sono forniti qui utilizzando un'iniezione di attivatore del plasminogeno di tipo urochinasi (urochinasi), una serina proteasi presente nell'uomo e in altri animali. La metodologia per l'induzione del dolore lombare persistente nei topi prevede una semplice iniezione di urochinasi lungo la regione di inserzione legamentosa della colonna lombare. L'agente infiammatorio urochinasi attiva il plasminogeno in plasmina. In genere, il modello può essere indotto entro 10 minuti e l'ipersensibilità persiste per almeno 8 settimane.
L'ipersensibilità, i disturbi dell'andatura e altre misure standard simili all'ansia e alla depressione possono essere testate nel modello persistente. Il mal di schiena è il tipo di dolore più diffuso. Per migliorare la consapevolezza del mal di schiena, l'Associazione internazionale per lo studio del dolore (IASP) ha nominato il 2021 "Anno globale del mal di schiena" e il 2022 "Anno globale per tradurre la conoscenza del dolore in pratica". Un limite del progresso terapeutico delle terapie del dolore è la mancanza di modelli adatti per testare il dolore persistente e cronico. Le caratteristiche di questo modello sono adatte a testare potenziali terapie volte alla riduzione del mal di schiena e delle sue caratteristiche accessorie, contribuendo a far sì che IASP nominasse il 2022 come l'Anno Globale per la Traduzione della Conoscenza del Dolore nella Pratica.

Test comportamentali nocicettivi e analisi dei dati Misure evocate L'ipersensibilità sul cuscinetto plantare si sviluppa entro un giorno dall'iniezione di urochinasi. Entro 1 settimana, la soglia di sospensione è significativamente diminuita e persiste fino all'eutanasia; questo è dimostrato fino alla settimana postchirurgica 4 (Figura 4A). La latenza di astinenza della zampa viene analizzata utilizzando il metodo di von Frey up-down9...

I metodi per l'induzione semplice e rapida di un modello di mal di schiena nei topi sono forniti qui utilizzando un'iniezione intralegamentosa di attivatore del plasminogeno urinario.

Modello di mal di schiena di topo indotto dall'attivatore del plasminogeno di tipo urochinasi

A model of persisting lower back pain can be induced in mice with the simple methodology described herein. Step-by-step methods for simple, rapid ...

Questo protocollo delinea un metodo non invasivo per indurre mal di schiena cronico nei topi per un massimo di 10 settimane, che può essere eseguito in modo rapido e affidabile con un allenamento minimo. L'aspetto più difficile di questa tecnica è riconoscere come ci si sente a iniettare il legamento rispetto all'iniezione di muscoli. La sensazione di resistenza al contatto indica l'iniezione del legamento.L'assenza di resistenza significa che l'ago potrebbe trovarsi nel muscolo o nella cavità addominale. Per iniziare, prendi una superficie piana sterile per posizionare il mouse. Quindi, posizionare una stazione di recupero del termoforo accanto alla configurazione dell'ambulatorio per trasferire immediatamente i topi dopo l'iniezione.Quindi, preparare l'urochinasi e una siringa di Hamilton. Prelevare la soluzione in anticipo per ridurre al minimo il tempo che il topo trascorre sotto anestesia. Dopo aver anestetizzato il topo, utilizzare due dita per localizzare i segmenti spinali lombari in L2 e L3 sotto la gabbia toracica e verificare il sito di iniezione.Posizionare la punta della siringa Hamilton vicino al dorso. Posizionare la siringa con un angolo di circa 45 gradi nel legamento immediatamente adiacente all'osso. Inserire la punta dell'ago delicatamente, ma con fermezza, nel legamento e iniettare lentamente fino a quando tutti e cinque i microlitri sono stati iniettati.Rimuovere l'ago delicatamente e lentamente. Quindi, posizionare il mouse nella stazione di recupero del calore fino a quando non si riattiva e diventa mobile. Controllare i topi per un'ora dopo l'intervento chirurgico per assicurarsi che tutte le normali funzioni motorie continuino.Dopo l'intervento chirurgico, controllare il peso e il sito di iniezione dei topi ogni giorno per una settimana per prevenire eventuali infezioni o complicazioni. Prima del test, spostare ogni animale in un cubicolo separato sul tavolo di prova con un piano di prova. Quindi, stimola il cuscinetto del piede con il filamento Von Frey 3.61 che suscita quattro grammi di forza.Un ritiro del piede da tre a cinque stimoli è considerato una risposta positiva. Ora, applica il filamento successivo più debole della serie fino a quando l'animale non smette di rispondere alla stimolazione meccanica. Usa il filamento più alto fino a quando non viene suscitata una risposta, quindi torna al filamento inferiore.Utilizzando un algoritmo di adattamento della curva, calcola la soglia di ritiro meccanico, che è la quantità minima di forza necessaria per ottenere una risposta il 50% delle volte. Per eseguire il test di Hargreaves, posizionare i topi in cubicoli su una superficie di vetro riscaldata dal basso da un emettitore a infrarossi. Misura il tempo che intercorre tra l'applicazione di uno stimolo di luce infrarossa sulla zampa posteriore del topo e il ritiro come latenza del piede.Per il test della piastra fredda, posizionare i topi sull'apparecchio della piastra fredda raffreddato a meno nove gradi Celsius. Registrare il tempo impiegato dal mouse per sollevare il piede dopo essere stato posizionato sull'apparecchio come latenza per ritirare il piede. Per eseguire il test dell'ansia, posizionare ogni animale nella scatola del test di preferenza del luogo con un passaggio tra due camere.Una camera dell'apparecchio dovrebbe essere molto illuminata, mentre il lato opposto dovrebbe rimanere buio. Utilizzando un computer, monitora i tempi di occupazione e le transizioni di luce e buio dell'animale durante un test di 10 minuti. Successivamente, posiziona i roditori modello o gli animali ingenui sul labirinto zero o usa il test di preferenza del luogo chiaro o scuro a due camere.Valuta il tempo trascorso nelle aree chiuse e aperte del labirinto utilizzando un cronometro. Per il test di depressione del saccarosio, spruzzare una soluzione di saccarosio dal 10 al 30% sul codice dorsale e valutare la frequenza, la durata e la latenza della toelettatura per 10 minuti. Per eseguire nuovi test sugli oggetti, acclimatare i topi individualmente a una gabbia di plastica trasparente con una parte superiore aperta per un'ora.Aggiungi due mini figure giocattolo identiche agli angoli opposti della gabbia per cinque minuti. Acclimatare gli animali il giorno del test per un'ora e posizionare le due mini figure identiche nelle stesse posizioni della gabbia per cinque minuti prima di riportarle nella gabbia di casa. Quindi, sostituisci una delle figure originali con un oggetto nuovo nettamente diverso.Dopo quattro ore, riporta i topi nella gabbia di prova e registra il tempo trascorso ad esplorare gli oggetti. Per la valutazione della funzione motoria, costruisci un tunnel da un tubo di carta assorbente tagliato longitudinalmente su un bordo. Stendere il tunnel aperto su un foglio di carta per stampante pulito.Tieni i topi delicatamente finché non si calmano. Applica inchiostro di china non tossico sulle zampe di un topo mettendole in un calamaio, in un tampone per timbri o usando un batuffolo di cotone. Rilascia i topi all'ingresso del tunnel.Lascia che corrano attraverso il tunnel e catturali alla fine. Segna le impronte delle zampe in base alla lunghezza del passo, alla larghezza del passo e all'estensione delle dita dei piedi. I test di ipersensibilità meccanica e termica hanno dimostrato che i topi con mal di schiena cronico avevano una sensibilità meccanica, al caldo e al freddo significativamente aumentata rispetto ai controlli naïve.L'analisi dell'ansia ha mostrato che il tempo totale trascorso nella camera luminosa della scatola chiara e scura e il numero di eventi di allevamento erano significativamente più bassi nei topi con mal di schiena cronico, indicando ansia. Durante il Sucrose Splash Test, i topi con mal di schiena cronico hanno mostrato un tempo di toelettatura inferiore e il numero di toelettatura. Tuttavia, la quantità di tempo prima dell'inizio della toelettatura è stata significativamente aumentata.La lunghezza del passo tra i topi con mal di schiena cronico e i topi ingenui era significativamente diversa. La cosa più importante da ricordare quando si tenta questa procedura è che si mira ai legamenti intorno alla colonna vertebrale, non al muscolo. Il modello del mal di schiena cronico fornisce uno strumento affidabile per valutare una varietà di nuove ricerche, farmacologiche e altre potenziali terapie.

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Per sviluppare nuovi interventi terapeutici per la prevenzione e la gestione del mal di schiena, sono necessari modelli animali per esaminare i meccanismi e l'efficacia di queste terapie da una prospettiva traslazionale. Il presente protocollo descrive il test BMS, un metodo standardizzato per valutare la sensibilità meccanica posteriore nel ratto.

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Impara un metodo non invasivo per indurre dolore cronico alla schiena nei topi fino a 10 settimane usando iniezione intraligamentosa di attivatore del plasminogeno. Questa tecnica richiede minima formazione e supporta la ricerca sui meccanismi del dolore.

Modello di mal di schiena di topo indotto dall'attivatore del plasminogeno di tipo urochinasi

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