Acquisizione della conformazione cromosomica su scale di lunghezza
20 gennaio 2023
Hi-C 3.0 è un protocollo Hi-C migliorato che combina crosslinker di formaldeide e disuccinimidil glutarato con un cocktail di enzimi di restrizione DpnII e DdeI per aumentare il rapporto segnale-rumore e la risoluzione del rilevamento dell'interazione cromatina.
Questo protocollo rileva accuratamente le caratteristiche di ripiegamento cromosomico su scale di lunghezza multipla con un segnale di fondo basso. Ad esempio, le interazioni del promotore enhancer possono essere analizzate nel contesto dei compartimenti cromosomici. L'uso di endonucleasi di restrizione aggira l'ottimizzazione del livello di digestione del materiale in ingresso.
Non è richiesta alcuna selezione mediante isolamento del gel per catturare i prodotti di legatura. Il problema più comune è la perdita di cellule dopo la fissazione del DSG e la cattura di abbastanza DNA per produrre librerie di alta qualità. Per iniziare, aspirare il mezzo con una pipetta Pasteur accoppiata a una trappola a vuoto dalla piastra da 150 millimetri contenente 5 per 10 alla sesta cella.
Lavare le celle due volte con 10 millilitri di HBSS. Per reticolare le cellule, versare 23,125 millilitri della soluzione di formaldeide all'1% nella piastra da 15 centimetri. Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti, dondolando delicatamente la piastra a mano ogni due minuti.
Quindi, aggiungere 1,25 millilitri di glicina 2,5 molare e ruotare delicatamente la piastra per estinguere la reazione di reticolazione, prima di incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Continuare l'incubazione sul ghiaccio per 15 minuti per interrompere la reticolazione. Raschiare le celle dalla piastra con un raschietto cellulare o un poliziotto di gomma e trasferire la sospensione della cella in un tubo conico da 50 millilitri con una pipetta.
Centrifugare la sospensione a 1.000 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente e scartare il surnatante mediante aspirazione. Lavare il pellet una volta con 10 millilitri di soluzione salina tamponata fosfato di Dulbecco, o DPBS. Quindi, centrifugare di nuovo prima di procedere alla reticolazione DSG.
Per la reticolazione con DSG, risospendere le celle pellettate in 9,9 millilitri di DPBS. Quindi, aggiungere 100 microlitri di DSG da 300 millimolari. Mescolare il tubo per inversione e reticolare le celle a temperatura ambiente per 40 minuti su un rotatore.
Dopo la reticolazione, aggiungere 1,925 millilitri di glicina 2,5 molare, invertire per mescolare e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi, centrifugare le cellule a 2.000 volte G per 15 minuti e risospendere il pellet in un millilitro di albumina sierica bovina allo 0,05% DPBS prima di trasferirlo in un tubo da 1,7 millilitri. Centrifugare le cellule a 2.000 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius e scartare il surnatante.
Congelare il pellet in azoto liquido prima di procedere alla cattura della conferma cromosomica. Risospendere l'aliquota della cellula reticolata in un millilitro di tampone di lisi ghiacciato contenente 10 microlitri di cocktail inibitore della proteasi e trasferirlo in un omogeneizzatore Dounce per 15 minuti di incubazione su ghiaccio. Spostare lentamente il pestello A su e giù 30 volte per omogeneizzare le cellule e incubare per un minuto per consentire alle cellule di raffreddarsi prima di altri 30 colpi.
Dopo l'ultimo colpo, trasferire il lisato in un tubo da 1,7 millilitri. Centrifugare la sospensione lisata a 2.500 volte G per cinque minuti. Scartare il surnatante e scorrere o vortice per risospendere il pellet bagnato.
Rimuovere il più possibile il surnatante per ottenere una sostanza simile allo yogurt con grumi minimi. Risospendere il pellet in 500 microlitri di tampone di restrizione ghiacciato prima della centrifugazione. Dopo il secondo lavaggio, risospendere il pellet in 360 microlitri di tampone di restrizione mediante pipettaggio dopo aver aggiunto circa 340 microlitri al volume di trascinamento del pellet, a seconda delle dimensioni della cella.
Mettere da parte 18 microlitri di lisato per testare l'integrità della cromatina, o CI.To il lisato rimanente, aggiungere 38 microlitri di 1% di sodio dodecilsolfato al tubo hi-C per ottenere un volume totale di 380 microlitri e mescolare accuratamente mediante pipettaggio senza introdurre bolle. Incubare i campioni a 65 gradi Celsius senza agitare per 10 minuti per aprire la cromatina. Quindi, posizionare immediatamente il tubo sul ghiaccio.
Dopo aver preparato la miscela di digestione con Triton X-100, aggiungere 107 microlitri di questa miscela al tubo hi-C per ottenere un volume totale di 487 microlitri e digerire la cromatina durante la notte a 37 gradi Celsius in un termomixer con agitazione a intervalli. Il giorno successivo, trasferire i campioni a 65 gradi Celsius per 20 minuti per disattivare l'attività endonucleasi rimanente. Dopo aver posizionato il campione sul ghiaccio, mettere da parte 10 microlitri di controllo della digestione, o DC, e conservarli a quattro gradi Celsius.
Rimuovere la condensa dal coperchio con una pipetta o ruotando. Quindi, aggiungere 58 microlitri di miscela di riempimento di biotina per ottenere un volume totale di 535 microlitri. Pipettare delicatamente senza formare bolle prima di incubare a 23 gradi Celsius per quattro ore in un termomiscelatore.
Dopo l'incubazione, aggiungere 665 microlitri di miscela di legatura, rendendo il volume del campione 1.200 microlitri. Mescolare il campione mediante pipettaggio e incubare a 16 gradi Celsius per quattro ore in un termomiscelatore. Quindi, aggiungere 50 microlitri di proteinasi-K in due frazioni alla provetta hi-C e incubare durante la notte a 65 gradi Celsius con agitazione a intervalli.
Per la purificazione del DNA, aggiungere etanolo ghiacciato al 100% e centrifugare i tubi a 18.000 volte G per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere completamente il surnatante dal lato non pellet e asciugare all'aria il campione per 10 minuti o fino a quando i pellet sono visibilmente asciutti. Una volta che i pellet sono asciutti, solubilizzarli in 450 microlitri di Tris a basso EDTA mediante pipettaggio o vortice.
Trasferire la sospensione solubilizzata in un'unità filtrante centrifuga da 0,5 millimetri, o CFU, con un limite di peso molecolare di tre kilodalton. Centrifugare il CFU alla massima velocità per 10 minuti ed eliminare il flusso passante. Dopo il secondo lavaggio, aggiungere 80 microlitri di Tris a basso contenuto di EDTA alla colonna.
Trasformare la colonna in un nuovo tubo di raccolta per due minuti di centrifugazione alla massima velocità. Infine, caricare i campioni su un gel di agarosio allo 0,8%. Il gel di agarosio con risultati di titolazione PCR ha dimostrato che la maggior parte delle librerie richiede da cinque a otto cicli di amplificazione finale della PCR.
La digestione cellulare della libreria finale di PCR amplificata, come osservato da frammenti più piccoli su un gel di agarosio, conferma la presenza di giunzioni di legatura corrette e serve come controllo di qualità prima del sequenziamento. Dopo il sequenziamento, i dati mappati hanno mostrato che la combinazione di DpnII e DdeI aumenta significativamente i contatti a corto raggio, aggiungendo DSG alla reticolazione convenzionale della formaldeide. Un segnale migliorato potrebbe anche essere osservato a lunghe e brevi distanze direttamente dalle matrici di interazione 2D.
I segnali compartimentali sono CRISPR a lunghe distanze e i punti formati dai loop della cromatina sono più prominenti a brevi distanze. Oltre alla formaldeide, il cross-linking con DSG diminuisce le legature casuali, migliorando la copertura relativa in cis. È importante non perdere cellule durante e dopo la reticolazione.
I pellet cellulari possono essere sciolti o invisibili e le cellule possono attaccarsi alle punte delle pipette in alcuni dei tamponi.
Panoramica
Hi-C 3.0 è un protocollo avanzato per il rilevamento delle interazioni della cromatina, con risoluzione e rapporto segnale-rumore migliorati. Utilizza crosslinker a base di formaldeide e glutarato di disuccinimidile, insieme a enzimi di restrizione specifici.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Analisi delle interazioni della cromatina
- Architettura genomica
- Biologia cellulare
Sfondo
- Le tecniche Hi-C sono essenziali per lo studio del ripiegamento cromosomico.
- Metodi migliorati potenziano il rilevamento delle interazioni promotore-enhancer.
- Gli enzimi di restrizione semplificano il processo di digestione.
- Le sfide includono la perdita cellulare durante la fissazione e il rendimento di DNA.
Scopo dello studio
- Per migliorare il rilevamento delle interazioni della cromatina.
- Per fornire un metodo affidabile per l'analisi dei compartimenti cromosomici.
- Per ottimizzare il protocollo Hi-C al fine di ottenere risultati migliori.
Metodi Utilizzati
- Fissazione delle cellule mediante formaldeide e DSG.
- Cross-linking e lisi delle cellule.
- Digestione della cromatina con enzimi di restrizione.
- Amplificazione PCR e sequenziamento dei prodotti di ligazione.
Risultati principali
- Rilevamento riuscito di interazioni della cromatina su diverse scale.
- Segnale di fondo ridotto ottenuto durante l'analisi.
- Librerie di alta qualità prodotte per il sequenziamento.
- Convalida dei giunti di ligazione tramite risultati della PCR.
Conclusioni
- Hi-C 3.0 migliora in modo significativo gli studi sulle interazioni della cromatina.
- Il protocollo riduce al minimo i problemi comuni legati alla perdita cellulare.
- Fornisce un quadro solido per la futura ricerca genomica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
Hi-C 3.0 consente la mappatura ad alta risoluzione dell'architettura della cromatina, supportando la riduzione del rischio meccanicistica e la validazione degli obiettivi nella fase iniziale della scoperta. Il suo migliorato incrocio e digestione aumentano la fiducia predittiva nell'interpretazione delle caratteristiche del ripiegamento del genoma rilevanti per la regolazione genica. Questa capacità rafforza le decisioni di portafoglio nel punto di intersezione tra modulazione epigenomica e verifica delle ipotesi terapeutiche.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette un'analisi precisa dei loop e dei compartimenti della cromatina per la validazione funzionale delle target.
- Supporta la riduzione del rischio meccanicistico quantificando le interazioni tra promotore-enhancer e tra elementi regolatori.
- Migliora la capacità predittiva nel collegare la struttura tridimensionale del genoma al controllo dell'espressione genica.
Sviluppo di screening e saggi
- Permette la preparazione di librerie di interazioni della cromatina validate per analisi successive.
- Fornisce letture quantitative e riproducibili della prossimità tra loci su diverse scale di lunghezza.
- Standardizza le condizioni del saggio evitando l'isolamento su gel e ottimizzando la digestione con enzimi di restrizione duali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i dati sulla conformazione della cromatina ai paesaggi regolatori rilevanti per le malattie, favorendo l'esplorazione traslazionale di biomarcatori.
- Permette una continuità dalla scoperta alla validazione preclinica, mappando le caratteristiche del ripiegamento del genoma in modelli pertinenti.
- Supporta un avanzamento basato sulla valutazione del rischio, chiarificando la base strutturale della regolazione genica in contesti patologici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Hi-C 3.0 si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica fornendo dati robusti sulle interazioni della cromatina per la verifica delle ipotesi e la priorizzazione degli obiettivi.
- Biologia della Scoperta: Quantifica i contatti cromatinici 3D per chiarire le vie regolatorie e ridurre i rischi associati ai meccanismi biologici.
- Screening: Produce librerie di alta qualità e riproducibili per l’analisi comparativa degli stati della cromatina.
- Analisi: Genera matrici quantitative di interazioni e segnali di compartimentazione per il confronto tra condizioni sperimentali.
- Ricerca Translazionale: Mappa le caratteristiche della cromatina rilevanti per i modelli di malattia e l’allineamento dei biomarcatori.
- Riutilizzo Aziendale: Stabilisce un protocollo standardizzato adattabile a diversi tipi cellulari e sistemi sperimentali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità nella regolazione genica mediata dalla cromatina.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la scalabilità attraverso l'incrocio e la digestione standardizzati.
- Valore strategico: Informa le decisioni di avanzamento o interruzione collegando l'architettura della cromatina a risultati funzionali.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione corretta rispetto al rischio di bersagli epigenomici e vie regolatorie.
Considerazioni relative all'implementazione
- Richiede competenze specifiche in biologia della cromatina e nei flussi di lavoro di sequenziamento ad alto rendimento.
- Richiede l'accesso a infrastrutture avanzate di sequenziamento e bioinformatica per l'analisi dei dati.
- Necessita di una manipolazione accurata per minimizzare la perdita cellulare durante l'incrocio e l'isolamento del DNA.
- La standardizzazione tra i gruppi di lavoro è fondamentale per la riproducibilità e il confronto dei dati.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per diversi tipi cellulari o campioni con quantità ridotta di materiale, come indicato nelle note del protocollo.
