Name: In vitro Modello enteroide apical-out di enterocolite necrotizzante (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-08T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Scopri il primo modello apical-out di enterocolite necrotizzante in vitro per testare farmaci orali. Questo metodo innovativo consente l'accesso alla superficie apicale degli enteroidi, migliorando lo studio dell'infiammazione intestinale.

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Questo contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health. HC è supportato dalla sovvenzione P20GM134973 del National Institutes of Health. KB è supportato da una sovvenzione della Children's Hospital Foundation (CHF) e della Presbyterian Health Foundation (PHF). Ringraziamo il Laboratorio per la ricerca di biologia molecolare e citometria dell'OUHSC per l'uso della Core Facility, che ha fornito l'imaging confocale.

Tutte le procedure animali in questo studio sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del Centro di scienze della salute dell'Università dell'Oklahoma. Campioni di convenienza dell'intestino tenue da un primate pretermine non umano (NHP, 90% gestazione, babbuino olivastro, Papio anubis) sono stati ottenuti dopo l'eutanasia per uno studio separato (Protocollo #101523-16-039-I).
1. Istituzione del modello NEC-in-a-dish enteroide apical-out
<ol><li>Preparazione di trattamenti con mezzi e enteroidi NOTA: Una volta preparato seguendo la tecnica asettica standard, il supporto può essere conservato a 4 °C per un massimo di 1 settimana.<ol><li>Preparare terreni privi di antibiotici (AFM) mescolando 50 ml di terreno di crescita organoide umano con 50 ml di integratore di organoidi (vedere Tabella dei materiali). Preparare 5 mM di acido etilendiamminotetraacetico/1x soluzione salina tamponata con fosfato (EDTA/PBS) aggiungendo 100 μL di 0,5 M EDTA a 9.900 μL di PBS.</li>
		<li>Chill Dulbecco modificato eagle's medium/nutrient Ham's mixture F12 + 15 mM HEPES Buffer (DMEM/F12) a 2-8 °C.</li>
		<li>Preparare la soluzione madre di TNF-α sospendendo 100 μg di polvere di TNF-α in 1 mL di 1x PBS. Diluire ulteriormente lo stock di TNF-α a concentrazioni di 20 ng/mL e 50 ng/mL utilizzando AFM come solvente. Preparare la soluzione madre di LPS sospendendo 2 mg di LPS in 1 mL di 1x PBS. Diluire ulteriormente LPS stock a 100 μg/mL e 200 μg/mL utilizzando AFM come solvente.</li>
	</ol></li>
	<li>Invertire la polarità degli enteroidi 3D NOTA: La seguente procedura è destinata all'inversione di una singola piastra di coltura tissutale a fondo piatto a 24 pozzetti in due piastre di coltura tissutale a 24 pozzetti a bassissimo attacco. Le piastre di coltura tissutale devono essere riscaldate a 37 °C per almeno 30 minuti prima dell'uso. La derivazione di enteroidi 3D basolateral-out è stata ottenuta come descritto in precedenza da molti gruppi35,36, con lievi modifiche per i mezzi (dettagliato sopra). La procedura generale di derivazione enteroide non differisce da quella umana. In breve, il tessuto asportato viene lavato, tagliato in piccoli frammenti e incubato nel tampone di distruzione cellulare. La soluzione cellulare viene quindi eseguita attraverso un filtro cellulare da 70 μM, risultando in cripte placcate ad alta densità.<ol><li>Aspirare i mezzi da ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti di enteroidi basolaterali 3D stabiliti.</li>
		<li>Aggiungere 500 μL di EDTA/PBS ghiacciato da 5 mM a ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti e interrompere meccanicamente delicatamente l'estratto della membrana basale / cupola ECM pipettando su e giù con una pipetta p200 almeno 5x-6x.</li>
		<li>Trasferire il contenuto di quattro pozzetti in un tubo conico da 15 ml e aggiungere 8 ml di EDTA/PBS ghiacciato al tubo conico. Trasferire i restanti 20 pozzi nello stesso modo.</li>
		<li>Incubare tubi conici da 15 mL a 4 °C per 1 h su piattaforma rotante o agitatore a 330 giri/min. Dopo 1 ora di incubazione, centrifugare i tubi conici a 300 x g per 3 minuti a 4 °C. Rimuovere e scartare il surnatante da ogni tubo.</li>
		<li>Unire e lavare i pellet cellulari con 5 ml di DMEM/F12 e distribuire la sospensione cellulare in due tubi conici da 15 ml.</li>
		<li>Pellettare le celle centrifugando a 300 x g per 3 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante e aggiungere 12 ml di AFM a ciascun tubo, assicurandosi che i pellet cellulari siano risospesi.</li>
		<li>Pipettare 500 μL della sospensione enteroide in ciascun pozzetto di due piastre di attacco ultra-basse da 24 pozzetti.</li>
		<li>Incubare le piastre a 37 °C e 5% di CO 2 per2-5 giorni o fino a quando gli enteroidi non hanno invertito la polarità.</li>
		<li>Per verificare l'inversione enteroide, stabilire prima la colorazione immunofluorescente di conferma e il tempo medio di inversione (~ 3 giorni), quindi confermare l'inversione di polarità utilizzando una visualizzazione di base al microscopio ottico. Gli enteroidi apicali-out sono molto cellulari nell'aspetto, mentre gli enteroidi basolaterali sono spesso dominati dalla presenza di un grande lume centrale o gemmazione (vedi Figura supplementare 1). NOTA: una volta che la procedura è stata standardizzata, il tasso di conversione in apical-out supera in genere il 95%. L'uso di enteroidi apical-out è inteso come un esperimento terminale, anche se è teoricamente possibile far passare enteroidi apical-out in un piccolo numero di enteroidi basolaterali-out.</li>
	</ol></li>
	<li>Apical-out NEC-in-a-dish NOTA: Una volta che gli enteroidi hanno invertito la polarità, utilizzare rapidamente le colture negli esperimenti successivi, poiché la loro longevità nella conformazione apical-out non è stata confermata oltre i 3-4 giorni. Per il seguente modello NEC-in-a-dish, gli enteroidi sono stati trattati per 24 ore, quindi raccolti immediatamente dopo e conservati per esperimenti a valle.<ol><li>Una volta che gli enteroidi hanno invertito visivamente la polarità con almeno il 95% di efficienza, rimuovere le piastre dall'incubatore e raccogliere otto pozzetti di una piastra a 24 pozzetti in un tubo conico da 15 ml. Poiché gli enteroidi apical-out sono in sospensione, è sufficiente pipettare la soluzione enteroid/media. Centrifugare il tubo da 15 mL a 300 x g per 5 minuti a 4 °C.</li>
		<li>Una volta che le cellule sono pellettizzate, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 4 ml di AFM miscelato con il volume desiderato (10 μL qui per abbinare il massimo volume di trattamento aggiunto) di 1x PBS (controllo).</li>
		<li>Pipettare 500 μL di sospensione enteroide/PBS/AFM in otto pozzetti di una piastra di attacco ultra-bassa a 24 pozzetti e incubare la piastra a 37 °C e al 5% di CO2 per 24 ore.</li>
		<li>Ripetere i passaggi 1.3.1.-1.3.3. per i trattamenti con TNF-α (20 ng/mL e 50 ng/mL) e LPS (100 μg/mL e 200 μg/mL) alla normossia. Per tutti i trattamenti per l'ipossia, ripetere i passaggi 1.3.1.-1.3.3., ma porre la piastra in un'incubatrice separata a 37 °C, 5% CO 2 e 1% O2 per 24 ore. NOTA: Passo 1.3.4. può essere eseguita contemporaneamente ai passaggi 1.3.1.-1.3.3, ma, per chiarezza, la procedura di cui sopra è stata separata dal trattamento al fine di ridurre la complessità.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Colorazione immunofluorescente e microscopia confocale
<ol><li>Preparazione di soluzioni coloranti<ol><li>Preparare Triton X-100 allo 0,1% miscelando 7 μL di Triton X-100 in 1x PBS fino a un volume finale di 7 ml. Preparare PBST (PBS-Tween) aggiungendo 30 μL di Tween-20 a 1x PBS a un volume finale di 30 ml.</li>
		<li>Preparare il 10% di siero normale d'asina (NDS)/PBST aggiungendo 700 μL di NDS a 6,3 ml di PBST. Preparare NDS/PBST all'1% aggiungendo 70 μL di NDS al PBST per un volume finale di 7 ml. NOTA: Il siero d'asino è stato usato qui per correlare con l'ospite anticorpale secondario. Tuttavia, le specie di siero bloccante devono corrispondere alle specie di anticorpi secondari per bloccare correttamente il legame non specifico.</li>
	</ol></li>
	<li>Colorazione (Giorno 1)<ol><li>Trasferire il contenuto di quattro pozzetti di una piastra da 24 pozzetti in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Ripetere l'operazione per tutti i pozzetti/trattamenti desiderati, con ogni trattamento in una provetta separata. Centrifugare i tubi a 300 x g per 4 minuti a 4 °C. Una volta che gli enteroidi sono pellettati, rimuovere il surnatante.</li>
		<li>Risospendere i pellet cellulari in 300 μL di fissativo di formaldeide al 4% per 30 minuti a temperatura ambiente (RT). Dopo 30 minuti, centrifugare i tubi a 300 x g per 4 minuti a 4 °C, rimuovere il surnatante e lavare il pellet con 500 μL di sterile, RT 1x PBS.</li>
		<li>Centrifugare i tubi a 300 x g per 4 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante e aggiungere 500 μL di Triton X-100 allo 0,1%, quindi lasciare riposare per 1 ora a RT.</li>
		<li>Dopo 1 ora, centrifugare le provette a 300 x g per 4 minuti a 4 °C e rimuovere il surnatante. Lavare con 500 μL di 1x PBS e posizionare i tubi su un rotatore o agitatore a 200 rpm per 15 minuti a 2-8 °C. Ripeti questo per un totale di 4x.</li>
		<li>Centrifugare i tubi a 300 x g per 4 minuti a 4 °C e rimuovere il surnatante. Aggiungere 500 μL di NDS/PBST al 10% e incubare a RT per 45 minuti. Durante l'incubazione, preparare soluzioni di anticorpi primari combinando 20 μL di anticorpo anti-villina ricombinante, 10 μL di anticorpo E-caderina e 1970 μL di NDS/PBST all'1% per otto pozzetti di una piastra da 24 pozzetti.</li>
		<li>Dopo i 45 minuti di incubazione, centrifugare le provette a 300 x g per 4 minuti a 4 °C. Posizionare i tubi sul ghiaccio. Rimuovere il surnatante e sostituirlo con 250 μL di soluzione anticorpale primaria. Incubare le provette per una notte a 2-8 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Colorazione (Giorno 2)<ol><li>Centrifugare i tubi a 300 x g per 4 minuti a 4 °C e rimuovere il surnatante. Aggiungere 250-500 μL di PBST a ciascun tubo, a seconda delle dimensioni del pellet, e posizionare sul rotatore o agitatore a 200 giri / min per 1 ora a 2-8 °C. Ripetere il lavaggio PBST 4x.</li>
		<li>Preparare la soluzione anticorpale secondaria aggiungendo 52 μL di Cy3 asino anti-coniglio IgG (H + L) al 50% di glicerolo e 5,2 μL di 488 anticorpi secondari verde fluorescente anti-topo asino a 5142,8 μL di NDS / PBST all'1%.</li>
		<li>Dopo l'ultimo lavaggio e centrifugazione PBST, rimuovere il surnatante dai tubi. Erogare 200 μL di soluzione anticorpale secondaria a ciascuna provetta e incubare al buio per una notte a 2-8 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Montaggio di enteroidi apicali-out colorati (Giorno 1)<ol><li>Portare il montante a base di glicerolo contenente colorante nucleare blu a RT in 1 ora.</li>
		<li>Centrifugare i tubi a 300 x g per 4 minuti a 4 °C. Rimuovere 100 μL del surnatante e risospendere le cellule nei restanti ~100 μL di surnatante. Trasferire la sospensione cellulare in provette da 0,5 ml.</li>
		<li>Centrifugare i tubi in una mini centrifuga per 20 s per pellettare le celle. Rimuovere il surnatante e risospendere i pellet cellulari in 100 μL di colorazione di acido nucleico rosso lontano. Incubare i tubi a RT per 10 minuti.</li>
		<li>Centrifugare i tubi in una mini centrifuga per 20 s per pellettare le celle. Rimuovere il surnatante e risospendere i pellet cellulari in 100 μL di 1x PBS. Ripetere per un secondo lavaggio.</li>
		<li>Centrifugare i tubi in una mini centrifuga per 20 s per pellettare le celle e rimuovere 70 μL del surnatante. Risospendere le celle nel volume rimanente di PBS e trasferire il contenuto in un coprivetrino etichettato (24 mm x 60 mm).</li>
		<li>Applicare 75 μL di montante direttamente sul campione e rimuovere eventuali bolle con una punta di pipetta. Lasciare che i coprivetrini si polimerizzino durante la notte (18-24 h) a RT al buio.</li>
	</ol></li>
	<li>Montaggio di enteroidi apicali-out colorati (Giorno 2)<ol><li>Dopo la polimerizzazione durante la notte, applicare uno strato sottile (~ 15 μL) di glicerolo sui vetrini. Montare il vetrino sul vetrino e premere delicatamente in posizione. Tocca per rimuovere eventuali bolle tra la copertina e la diapositiva.</li>
		<li>Lasciare che il coprislip si posizioni su RT al buio per un minimo di 2 ore, prima di scattare immagini con un ingrandimento 20x con un microscopio confocale. Per la visualizzazione microscopica degli enteroidi utilizzando vari metodi di acquisizione confocale, fare riferimento a Lallemant et al.37.</li>
	</ol></li>
	<li>Quantificazione immunofluorescente NOTA: questo metodo determina la fluorescenza totale corretta rimuovendo il segnale di fondo utilizzando il software ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).<ol><li>Aprire le immagini confocali in ImageJ e delineare l'area desiderata con lo strumento regione di interesse (ROI).</li>
		<li>Impostare i parametri definiti dall'utente passando a Analizza > Imposta misure. Selezionare Area > Densità integrata > Valore medio grigio nella scheda Impostazioni.</li>
		<li>Passare ad Analizza > misura. Apparirà una finestra pop-up contenente le misure. Copia e incolla queste misurazioni in un foglio di calcolo.</li>
		<li>Per sottrarre il segnale di sfondo, selezionare una piccola area non fluorescente dell'immagine. Passare ad Analizza > misura per quell'area . Apparirà una finestra pop-up contenente le misure. Copia e incolla l'output in un foglio di calcolo.</li>
		<li>Moltiplicare l'area della cella selezionata per la fluorescenza media delle letture di fondo e sottrarre la somma dalla densità integrata per calcolare la fluorescenza cellulare totale corretta (CTCF). Ripetere i passaggi precedenti per tutte le immagini di interesse, mantenendo i record in un foglio di calcolo o in un pacchetto software statistico (vedere Tabella dei materiali).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Vitalità cellulare NEC-in-a-dish apical-out
<ol><li>Trattamenti enteroidi<ol><li>Stabilire un modello NEC-in-a-dish apical-out per 24 ore, come nel passaggio 1.</li>
		<li>Saggio di vitalità cellulare reagente per la notte a 4 °C. Il giorno del test, portare il reagente a RT 30 minuti prima dell'uso. Capovolgere il reagente per miscelare.</li>
		<li>Prima di eseguire il test, rimuovere 100 μL di terreno da ciascun pozzetto, lasciando i restanti 400 μL. Aggiungere 400 μL di reagente di analisi di vitalità cellulare a ciascun pozzetto.</li>
		<li>Mescolare energicamente bene il contenuto su uno shaker a piastre a RT per 5 minuti a 200 giri / min per indurre la lisi cellulare. Dopo l'agitazione, incubare la piastra a RT per altri 25 minuti.</li>
		<li>Dopo 25 minuti di incubazione, mescolare il contenuto di un pozzetto tramite pipettaggio e trasferire 200 μL degli 800 μL in un singolo pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, opaca, in polistirene, con fondo chiaro. Ripetere l'operazione per i restanti 600 μL, creando quattro repliche tecniche per pozzetto. Trasferire il contenuto rimanente di ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti in una piastra a 96 pozzetti in questo modo.</li>
		<li>Utilizzando un lettore di piastre in grado di luminescenza, registrare i valori a 0,25 ms di integrazione e confrontare i valori relativi tra i trattamenti. In alternativa, confrontare la luminescenza del trattamento con uno standard di adenosina trifosfato (ATP).</li>
	</ol></li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare e non hanno conflitti di interesse.

Il recente sviluppo di modelli enteroidi derivati da cripte epiteliali intestinali consente un tessuto in vitro più fisiologicamente rilevante in cui studiare la patogenesi dell'enterocolite necrotizzante. Nonostante includano tutti i principali tipi di cellule differenziate dell'epitelio intestinale, gli enteroidi 3D sono ancora soggetti a diverse limitazioni significative. Gli enteroidi convenzionali basolaterali-out sono sospesi in cupole di idrogel ECM 3D, la cui composizione e densità possono limitare la no...

L'enterocolite necrotizzante (NEC), una grave malattia infiammatoria dell'intestino tenue che si verifica fino al 10% dei neonati pretermine, è comunemente associata ad elevata morbilità e mortalità 1,2. I tassi di mortalità che si avvicinano al 50% nei neonati con peso alla nascita molto basso (<1500 g), che richiedono un intervento chirurgico, non sono rari3. Mentre l'esatta eziologia di NEC non è attualmente compresa, si ritiene che i fattori di rischio, come l'alimentazione artificiale, si aggravino con anomalie fisiologiche, come la disbiosi, un epitelio intestinale immaturo e una barriera intestinale disfunzionale, nello sviluppo della malattia 2,4. Nonostante gli sforzi significativi, nell'ultimo decennio si sono verificati pochi progressi nella prevenzione o nel trattamento del NEC5. È necessario un nuovo metodo in vitro per studiare la NEC e la disfunzione della barriera epiteliale intestinale associata per far progredire la comprensione della patogenesi della malattia, poiché i risultati dei modelli animali hanno, finora, tradotto male al lettodel paziente 6.
Un certo numero di modelli in vitro sono stati utilizzati per studiare i meccanismi in gioco durante NEC. La linea cellulare epiteliale intestinale umana, Caco-2, è tra i modelli in vitro più comunemente utilizzati di NEC 7,8. Le cellule Caco-2 emulano le caratteristiche morfologiche del bordo del pennello dell'intestino tenue, ma, come linea cellulare, non si differenziano nell'ampia varietà di tipi di cellule in vivo, comprese le cellule caliciformi che producono muco, richieste per un modello altamente traducibile. HT-29-MTX, cellule di adenocarcinoma del colon umano, includono un fenotipo misto di enterociti e cellule caliciformi, ma mancano ancora di tipi cellulari basati sulla cripta dell'epitelio intestinale9. IEC-6 e IEC-18 sono linee cellulari non trasformate con una morfologia immatura simile a una cripta ileale ma non derivano da tessuto umano, limitando la loro capacità traslazionale. Le linee cellulari intestinali FHs 74-Int e H4 derivano dal tessuto fetale umano e non formano giunzioni strette o monostrati polarizzati10,11, e quindi sono immature rispetto anche ai neonati più prematuri suscettibili alla NEC. Tipicamente, i modelli in vitro NEC utilizzano trattamenti lipopolisaccaridici (LPS) per indurre il recettore toll-like 4 (TLR4), un recettore importante che avvia l'infiammazione intestinale in NEC12. Il danno mediato attraverso il trattamento con specie reattive dell'ossigeno (ROS), tipicamente attraverso il perossido di idrogeno, è spesso usato per indurre danni ossidativi simili a NEC e apoptosi13,14. Come principale motore dell'infiammazione intestinale, il fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α), un componente a valle della segnalazione infiammatoria TLR4, è anche comunemente utilizzato in questi modelli in vitro per imitare la patogenesi in vivo 15.
Gli organoidi, generati da cellule staminali pluripotenti inducibili (iPSC), sono cresciuti in popolarità come modello in vitro dell'intestino grazie alla loro capacità di ricapitolare la complessa architettura in vivo e la composizione del tipo cellulare del tessuto da cui derivano16,17. Un sistema in vitro correlato, gli enteroidi, sono organoidi derivati da cripte intestinali resecate che sono più facilmente stabiliti e mantenuti rispetto agli organoidi derivati da iPSC. Gli enteroidi sono tipicamente coltivati in una matrice extracellulare tridimensionale (3D) (ECM) con accesso sperimentale limitato alla superficie cellulare basolaterale. Metodi, come la microiniezione18,19, sono stati sviluppati per superare questa barriera alla superficie apicale, ma l'accumulo di detriti cellulari e muco all'interno del lume rende la microiniezione sia tecnicamente difficile che incoerente. Poiché le piattaforme di microiniezione robotizzata personalizzate non sono ampiamente accessibili20, la variabilità da laboratorio a laboratorio nelle capacità tecniche e nella tecnica generale diventano variabili significative da superare con i protocolli di microiniezione. Monostrati bidimensionali (2D) derivati da enteroidi 3D dissociati, che comprendono ancora tutti i principali tipi di cellule dell'epitelio intestinale, consentono l'accesso alla superficie apicale ma sono stati tradizionalmente difficili da mantenere senza uno strato di alimentazione di miofibroblasti mesenchimali21. Mentre i supporti permeabili alla coltura cellulare possono essere utilizzati per accedere sia al lato apicale che basolaterale dei monostrati enteroidi senza l'uso di miofibroblasti sottostanti, questi inserti richiedono l'escissione e il montaggio della membrana prima dell'uso con modalità quali la microscopia confocale, risultando in un processo tecnicamente più impegnativo e difficile quando si utilizzano metodi di microscopia tradizionali22. NEC è stato modellato in vitro utilizzando enteroidi 3D tradizionali 23,24,25 e supporti permeabili 26,27, e l'infiammazione intestinale è stata recentemente replicata con modelli gut-on-a-chip 28,29. Mentre i modelli gut-on-a-chip che incorporano la microfluidica sono, di gran lunga, i modelli più avanzati e traducibili, questa tecnologia è costosa, complessa e inaccessibile alla maggior parte dei ricercatori30.
I recenti progressi nelle tecniche enteroidi apicali-out hanno permesso un accesso più facile alla superficie apicale degli enteroidi 3D senza rischiare di danneggiare l'integrità strutturale dell'epitelio in vitro 31,32,33. Gli enteroidi apicali-out condividono la composizione del tipo di cellula e la funzione barriera dell'epitelio intestinale in vivo, ma, a differenza dei tipici enteroidi 3D, le superfici apicali di queste cellule sono rivolte verso il terreno di coltura, consentendo studi più fisiologicamente rilevanti sull'assorbimento dei nutrienti, l'infezione microbica e la secrezione luminale31. Un ulteriore vantaggio degli enteroidi apical-out è la capacità di distribuire omogeneamente agenti sperimentali agli enteroidi. Non è richiesta una variazione dei volumi di trattamento in base alle dimensioni degli enteroidi, come avviene con la microiniezione, e la capacità di mantenere questi enteroidi nella coltura in sospensione annulla qualsiasi interferenza ECM sulla diffusione dell'agente sperimentale32.
L'enterocolite necrotizzante è una malattia multifattoriale che coinvolge più tipi di cellule epiteliali intestinali e una varietà di fattori ambientali e fisiopatologici34. La variegata composizione cellulare degli enteroidi intestinali è un netto miglioramento rispetto alle monocolture nella modellazione di una malattia complessa come la NEC. È interessante notare che, mentre una singola esposizione infiammatoria è spesso sufficiente per indurre danni in monocolture in vitro , gli enteroidi, come con i modelli murini23, sembrano richiedere un minimo di due componenti infiammatori per indurre danni simili a NEC6. Qui, presentiamo un modello apical-out NEC-in-a-dish, utilizzando enteroidi apical-out in combinazione con ipossia (un'importante caratteristica clinica di NEC6) e LPS o TNF-α, come modello in vitro migliorato e più fisiologicamente rilevante per studiare le risposte epiteliali all'infiammazione simile a NEC e, potenzialmente, identificare bersagli terapeutici. Descriviamo un protocollo per invertire la polarità degli enteroidi 3D dell'intestino tenue, nonché un protocollo di colorazione immunofluorescente per identificare la rottura della barriera epiteliale e le alterazioni dell'espressione proteica giunzionale. Infine, dimostriamo ulteriormente un semplice saggio di vitalità enteroide per determinare l'impatto del nostro modello NEC-in-a-dish a doppio colpo.

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Fisher Scientific</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga da 1,5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Provetta conica da 15 mL</td><td>VWR</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo Saggio di vitalità cellulare 3D</td><td>Promega</td><td>G9681</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Attacco ultra-basso Micropiastre a 24 pozzetti</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-602</td><td></td></tr><tr><td>Vetro di copertura 24 mm x 60 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>102460</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secondario altamente adsorbito anti-topo d'asino (H+L), Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Scientific</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo IgG anti-coniglio d'asino, Cy3 coniugato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AP182C</td><td></td></tr><tr><td>Miscela di prosciutto Medium/Nutrient Eagle's modificata di Dulbecco F-12 (DMEM-F12) con tampone HEPES da 15 mM</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>36254</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo E-caderina (7H12)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-19051</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di formaldeide 4%, tamponata, pH 6,9</td><td>Millipore Sigma</td><td>1004960700</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Fiji</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>IntestiCult Terreno di crescita degli organoidi (umano)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>06010</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale Leica SP8</td> Leica <td>Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisaccaridi da Escherichia coli O111:B4, purificati mediante cromatografia con filtrazione su gel</td><td>Millipore Sigma</td><td>L3012-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>Siero d'asino normale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>566460</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon trattato con delta, micropiastra a fondo piatto</td><td>Thermo Scientific</td><td>136101</td><td></td></tr><tr><td>PBS (soluzione salina tamponata con fosfato), 1x [-] calcio, magnesio, pH 7.4</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Glass Antifade Mountant con NucBlue</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36983</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo ricombinante anti-villina [SP145]</td><td>Abcam</td><td>ab130751</td><td></td></tr><tr><td>TNF umano ricombinante-&alfa; proteina 100 &micro; g</td><td>Bio-Techne</td><td>210-TA-100/CF</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax iD3 Lettore multimodale di micropiastre</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermo Forma Serie II Incubatore tri-gas con camicia d'acqua, 184L</td><td>Fisher Scientific</td><td>3140</td><td></td></tr><tr><td>TO-PRO-3 Ioduro (642/661)</td><td>Thermo Scientific</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Provette, 0,5 mL, tappo piatto</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB0350</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro modello enteroide apical-out di enterocolite necrotizzante

In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

L'enterocolite necrotizzante (NEC) è una malattia devastante che colpisce i neonati pretermine, caratterizzata da infiammazione intestinale e necrosi. Gli enteroidi sono recentemente emersi come un sistema promettente per modellare le patologie gastrointestinali. Tuttavia, i metodi attualmente utilizzati per la manipolazione enteroide non hanno accesso alla superficie apicale dell'epitelio (tridimensionale [3D]) o richiedono molto tempo e risorse (monostrati bidimensionali [2D]). Questi metodi spesso richiedono passaggi aggiuntivi, come la microiniezione, affinché il modello diventi fisiologicamente traducibile. Qui, descriviamo un protocollo fisiologicamente rilevante e poco costoso per studiare NEC in vitro invertendo la polarità enteroide, con conseguente superficie apicale rivolta verso l'esterno (apical-out). Viene inoltre fornito un protocollo di colorazione immunofluorescente per esaminare l'integrità della barriera enteroide e l'espressione proteica giunzionale in seguito all'esposizione al fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α) o al lipopolisaccaride (LPS) in condizioni normossiche o ipossiche. Viene inoltre valutata la vitalità di enteroidi 3D apical-out esposti a LPS normossici o ipossici o TNF-α per 24 ore. Gli enteroidi esposti a LPS o TNF-α, in combinazione con ipossia, hanno mostrato un'interruzione dell'architettura epiteliale, una perdita di espressione della proteina di giunzione aderente e una riduzione della vitalità cellulare. Questo protocollo descrive un nuovo modello apical-out NEC-in-a-dish che presenta una piattaforma fisiologicamente rilevante ed economica per identificare potenziali bersagli epiteliali per le terapie NEC e studiare la risposta intestinale pretermine alle terapie.

L'uso di enteroidi per modellare l'infiammazione intestinale, anche nel contesto dell'enterocolite necrotizzante, è ora comune. Tuttavia, la maggior parte dei metodi attualmente utilizzati non hanno accesso alla superficie apicale degli enteroidi, negando la rilevanza fisiologica dei composti destinati all'eventuale uso come terapie orali, o sono tecnicamente difficili e richiedono tempo, come con i monostrati derivati dagli enteroidi. Per aumentare l'utilità degli attuali modelli enteroidi in vitro di NEC, abbi...

Questo protocollo descrive un modello di enterocolite necrotizzante apicale (NEC) in un piatto che utilizza enteroidi intestinali piccoli con polarità invertita, consentendo l'accesso alla superficie apicale. Forniamo un protocollo di colorazione immunofluorescente per rilevare l'interruzione epiteliale correlata al NEC e un metodo per determinare la vitalità degli enteroidi apicali-out sottoposti al protocollo NEC-in-a-dish.

In vitro Modello enteroide apical-out di enterocolite necrotizzante

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease affecting preterm infants, characterized by intestinal inflammation and necrosis. Enteroids have ...

Questo protocollo descrive il primo modello apical-out in-a-dish ed è un miglioramento critico rispetto ai modelli enteroidi basali laterali out-a-dish quando si stabilisce la modellazione in vitro di potenziali terapie destinate alla somministrazione orale. Questo metodo consente l'accesso alla superficie apicale degli enteroidi. I composti possono essere aggiunti ai terreni cellulari e i composti vengono assorbiti apicamente come sarebbero in vivo.I ricercatori interessati a stabilire un sistema in vitro di infiammazione intestinale per testare potenziali terapie orali possono trovare questa tecnica particolarmente utile. I tessuti provenienti da età e specie diverse possono richiedere un'ulteriore standardizzazione. Quindi i pazienti mentre stabiliscono i tempi di inversione di polarità possono essere necessari.Per invertire la polarità degli enteroidi 3D, aspirare i mezzi da ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti di enteroidi basolaterali 3D stabiliti. Aggiungere 500 microlitri di cinque millimolari ghiacciati, EDTA o PBS a ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti e interrompere delicatamente meccanicamente l'estratto della membrana basale o la cupola della matrice extracellulare pipettando su e giù da cinque a sei volte con una pipetta P 200. Trasferire il contenuto di quattro pozzetti in un tubo cronico da 15 millilitri.Quindi aggiungere otto millilitri di PBS EDTA ghiacciato al tubo. Trasferire i restanti 20 pozzi nello stesso modo. Incubare i tubi a quattro gradi Celsius per un'ora su una piattaforma rotante o agitatore a 330 RPM.Dopo l'incubazione centrifugare le provette ed eliminare il surnatante da ciascuna provetta. Unire e lavare il pellet con cinque millilitri di DMEM F12. Quindi centrifugare la sospensione delle cellule e rimuovere il surnatante prima di aggiungere 12 millilitri di mezzo privo di antibiotici al tubo assicurandosi che i pellet cellulari siano risospesi.Pippet 500 microlitri della sospensione enteroide in ciascun pozzetto di una piastra di attacco ultra-bassa a 24 pozzetti. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per due o cinque giorni o fino a quando gli enteroidi non hanno invertito la polarità. Il primo giorno di astensione, trasferire il contenuto di quattro pozzetti di una piastra da 24 pozzetti in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri.Ripetere l'operazione per tutti i pozzetti desiderati con ogni trattamento in un tubo separato. Centrifugare i tubi e risospendere il pellet in 300 microlitri di fissativo aldeidico al 4% a temperatura ambiente. Dopo 30 minuti lavare il pellet con 500 microlitri di PBS.Aggiungere 500 microlitri di 0,1% Triton X 100 ai tubi. Incubare i tubi per un'ora a temperatura ambiente. Quindi, posizionare i tubi su un rotatore o agitatore a 200 RPM per 15 minuti da due a otto gradi Celsius.Dopo l'ultima incubazione, aggiungere 500 microlitri di NDS al 10% in PBS T e incubare a temperatura ambiente per 45 minuti. Durante l'incubazione, preparare la soluzione anticorpale primaria. Il giorno successivo aggiungere da 250 a 500 microlitri di PBS T ai tubi a seconda delle dimensioni del pellet e posizionarli sul rotatore o sull'agitatore a 200 giri / min per un'ora da due a otto gradi Celsius.Aggiungere 200 microlitri della soluzione anticorpale secondaria e incubare i tubi da due a otto gradi Celsius al buio. Il giorno successivo, procedere al montaggio di enteroidi apicali colorati ruotando i tubi e rimuovendo 100 microlitri di surnatante. Risospendere le cellule nei restanti 100 microlitri di surnatante e trasferire la sospensione cellulare in provette da 500 microlitri.Centrifugare i tubi in una mini centrifuga per 20 secondi. Rimuovere il surnatante e risospendere i pellet in 100 microlitri di colorazione di acido nucleico rosso a temperatura ambiente. Dopo 20 minuti di incubazione, centrifugare le cellule e risospendere il pellet in 100 microlitri di PBS.Dopo il secondo lavaggio e centrifugazione rimuovere 70 microlitri di surnatante e risospendere il pellet nel volume rimanente di PBS. Quindi trasferire la sospensione cellulare su un vetrino di copertura etichettato 24 per 60 millimetri. Applicare 75 microlitri di montante direttamente sul campione e rimuovere eventuali bolle con una punta di pipetta.Dopo la polimerizzazione durante la notte al buio, applicare un sottile strato di glicerolo sui vetrini del coperchio, quindi montare le scivolate di copertura sul vetrino e premerlo delicatamente in posizione. Tocca per rimuovere eventuali bolle tra la vetrina e la diapositiva. Lasciare che il vetrino del coperchio si fissi a temperatura ambiente al buio per due ore prima di visualizzare gli enteroidi a 20 volte l'ingrandimento con un microscopio confocale.Per i trattamenti enteroidi, stabilire un'enterocolite necrotizzante apicale in un modello piatto per 24 ore come descritto nel manoscritto testuale. Prima di eseguire il test, rimuovere 100 microlitri di mezzi da ciascun pozzetto lasciando i restanti 400 microlitri. Aggiungere 400 microlitri di reagente per il saggio di vitalità cellulare a ciascun pozzetto.Mescolare vigorosamente il contenuto su uno shaker a piastre per cinque minuti a 200 RPM per indurre la lisi cellulare. Quindi, trasferire 200 microlitri in un singolo pozzetto di una piastra a fondo chiaro 96. Ripetere per i restanti 600 microlitri creando quattro repliche tecniche per pozzetto.Utilizzando un lettore di piastre in grado di luminescenza, registrare i valori a 0,25 millisecondi di integrazione e confrontare i valori relativi tra i trattamenti. La colorazione rappresentativa dell'immunofluorescenza del controllo ha confermato la localizzazione apicale dei nuclei verso il lume e l'individuazione di cattivi sul bordo esterno dell'epitelio. Rispetto al controllo, l'esposizione al polisaccaride lipo, alla necrosi tumorale alfa o all'ipossia da sola non ha indotto cambiamenti evidenti nella morfologia delle cellule grossolane E-caderina o localizzazione del cattivo o intensità fluorescente.Il trattamento con lipopolisaccaride o necrosi tumorale alfa in combinazione con ipossia ha interrotto l'architettura epiteliale e ha dimostrato una significativa perdita di aderenza della giunzione e dell'espressione proteica del bordo del pennello rivelata dalla perdita dell'udito ECA e dalla colorazione del cattivo. La vitalità delle cellule apicali è stata determinata in condizioni normossiche o ipossiche. In condizioni normossiche rispetto al controllo lipo polisaccaride o necrosi tumorale alfa non ha influenzato significativamente la vitalità cellulare degli enteroidi.Tuttavia, riduzioni significative della vitalità sono state osservate nel polisaccaride lipo o necrosi tumorale alfa in combinazione con ipossia rispetto alla sola ipossia. Stabilendo un modello apicale in-a-dish. Ricordarsi di mantenere l'EDTA nella sospensione cellulare ghiacciata.Ciò migliorerà l'inversione di polarità e assicurerà che tutta l'ECM sia correttamente liquefatta e rimossa. Altre applicazioni a valle come QPCR, RNA-seq, western blotting o valutazioni funzionali della permeabilità della barriera possono essere eseguite ulteriormente per caratterizzare la risposta alla segnalazione infiammatoria nell'ipossia.

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Questo video dimostra lo sviluppo della malattia da enterocolite necrotizzante in un modello enteroide neonatale di derivazione umana indotto dal trattamento con lipopolisaccaridi. Questo modello aiuta a studiare la fisiopatologia intestinale.

Induzione dell'enterocolite necrotizzante in un modello enteroide epiteliale umano

Enteroids stanno emergendo come un modello di romanzo nello studio della malattia umana. Il protocollo descrive come simulare un modello enteroid di enterocolite necrotizzante umano mediante trattamento di lipopolisaccaride (LPS) di enteroids generato dal tessuto neonatale. Enteroids raccolti dimostrano cambiamenti infiammatori simili a quelli osservati nella enterocolite necrotizzante umana.

Un nuovo modello Enteroid epiteliali umane di enterocolite necrotizzantesi

L'enterocolite necrotizzante (NEC) è la malattia gastrointestinale (GI) più grave che si verifica spesso nei neonati prematuri, in particolare nei neonati con peso alla nascita molto basso, con alta mortalità e patogenesi poco chiara. La causa del NEC può essere correlata ad anomalie del sistema immunitario infiammatorio. Un modello animale NEC è uno strumento indispensabile per la ricerca immunitaria sulla malattia NEC. I modelli animali NEC di solito usano topi neonatali C57BL / 6J; I topi...

Un modello murino BALB/c neonatale di enterocolite necrotizzante

Questo protocollo descrive un metodo per stabilire ed eseguire un test di ferita da graffio su monostrati bidimensionali (2D) derivati da enteroidi tridimensionali (3D) isolati da ileo di primati non umani.

Effetto dell'acido ialuronico 35 kDa su un modello in vitro di danno intestinale pretermine e guarigione mediante monostrati di derivazione enteroide

Questo protocollo descrive in dettaglio la creazione di enteroidi, un modello intestinale tridimensionale, dal tessuto intestinale fetale. L'imaging immunofluorescente dei biomarcatori epiteliali è stato utilizzato per la caratterizzazione del modello. L'esposizione apicale dei lipopolisaccaridi, un'endotossina batterica, utilizzando la tecnica della microiniezione ha indotto la permeabilità epiteliale in modo dose-dipendente misurata dalla fuoriuscita di destrano fluorescente.

Test della permeabilità epiteliale negli enteroidi derivati dal tessuto fetale

Il presente protocollo delinea un metodo che utilizza il giallo lucifero in un modello enteroide apical-out per determinare la permeabilità intestinale. Questo metodo può essere utilizzato per determinare la permeabilità paracellulare negli enteroidi che modellano le malattie infiammatorie intestinali come l'enterocolite necrotizzante.

Determinazione della permeabilità intestinale utilizzando Lucifer Yellow in un modello enteroide apical-out

Escherichia coli provoca sepsi nei neonati che ingeriscono i batteri intorno al momento della nascita. Il processo coinvolto nella capacità di E. coli di viaggiare dal tratto enterico al flusso sanguigno è poco compreso. Questo modello in vitro valuta la capacità dei ceppi di E. coli di viaggiare attraverso le cellule epiteliali intestinali.

Valutazione della transcitosi intestinale degli isolati neonatali di batteriemia di Escherichia coli

Questo protocollo descrive un modello in vitro di enterocolite necrotizzante (NEC), che può essere utilizzato per studi meccanicistici sulla patogenesi della malattia. È dotato di un chip microfluidico seminato con enteroidi intestinali derivati dall'intestino neonatale umano, dalle cellule endoteliali e dal microbioma intestinale di un neonato con NEC grave.

Modello microfluidico di enterocolite necrotizzante che incorpora enteroidi intestinali neonatali umani e un microbioma disbiotico

Questo protocollo delinea un modello murino neonatale di enterocolite necrotizzante (NEC) e il successivo isolamento delle cellule immunitarie della lamina propria dall'intestino tenue murino neonatale.

Un modello murino neonatale di enterocolite necrotizzante e isolamento della lamina propria per la profilazione delle cellule immunitarie

Trapianto di cellule staminali in un In vitro Simulato ischemia / riperfusione Modello

Scopri il primo modello apical-out di enterocolite necrotizzante in vitro per testare farmaci orali. Questo metodo innovativo consente l'accesso alla superficie apicale degli enteroidi, migliorando lo studio dell'infiammazione intestinale.

In vitro Modello enteroide apical-out di enterocolite necrotizzante

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