Name: Modello di donazione su animali di grandi dimensioni dopo morte circolatoria e perfusione regionale normothermica per la valutazione cardiaca (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-10T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Impara un modello suino di donazione dopo morte circolatoria con perfusione normotermica regionale toraco-addominale per la valutazione preclinica del trapianto cardiaco.

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Vorremmo ringraziare Melanie Borie, Caroline Landry, Henry Aceros e Ahmed Menaouar per il loro prezioso aiuto e supporto.

Il comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM) ha approvato tutti i protocolli sperimentali e gli animali sono stati trattati in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Per questo protocollo sono stati utilizzati suini maschi o femmine di 3-4 mesi di 3-4 mesi del peso di 50-60 kg. Le dimensioni degli animali possono variare in base agli obiettivi sperimentali dei ricercatori.
1. Preparazione animale e induzione anestetica
<ol><li>Premedicare l'animale usando un'iniezione intramuscolare di atropina (0,04 mg/kg), midazolam (0,3 mg/kg) e ketamina (20 mg/kg). Somministrare isoflurano ad una concentrazione corrente finale dell'1%-3% in 3 L/min O2, utilizzando una maschera facciale per l'induzione e il mantenimento dell'anestesia.</li>
	<li>Confermare un'anestesia adeguata testando un tono rilassato della mascella e l'assenza di dolore usando la risposta al pizzico della punta. Assicurarsi che l'animale sia posto in posizione di decubito dorsale e mantenuto in normotermia usando una coperta riscaldante.</li>
	<li>Dopo aver confermato l'adeguatezza anestetica, eseguire un'intubazione orotracheale utilizzando un tubo endotracheale di 6,5-8 mm come descritto al punto 10.</li>
	<li>Posizionare il monitor di saturazione dell'ossigeno sull'orecchio o sul labbro inferiore dell'animale per un monitoraggio continuo. Regolare la ventilazione a una pressione positiva di fine espirazione (PEEP) di 5 cm H 2 O, una pressione inspiratoria di picco (PIP) di 15 cm H 2 O, una frazione di ossigeno inspirato (FIO 2) di 0,5 e una frequenza respiratoria (RR) di 15 respirazioni / min che raggiunge un volume corrente (TV) di 6-8 ml / kg e una normale pressione parziale di O 2 e CO 2. Regolare l'RR per mantenere un livello di CO2 di fine marea di 35-45 mmHg.</li>
	<li>Ottenere un accesso endovenoso periferico attraverso la vena dell'orecchio utilizzando un catetere da 20 G. Iniziare un'infusione di mantenimento della normale soluzione salina (0,9% NaCl) e somministrare 2 g di solfato di magnesio (MgSO4) come bolo endovenoso per prevenire le aritmie.</li>
	<li>Preparare i siti chirurgici radendo adeguatamente e strofinando il torace e l'inguine. Disinfettare l'inguine e il collo con clorexidina e drappeggiare in modo appropriato fornendo accesso venoso e arterioso.</li>
	<li>Posizionare il cuscinetto dell'elettrodo di cauterizzazione sulla schiena dell'animale. Posizionare l'animale in posizione Trendelenburg per facilitare l'accesso venoso centrale.</li>
	<li>Individuare la vena giugulare destra utilizzando un'ecografia. Una volta individuato, utilizzando un ago, inserire la pelle con un angolo di 45 ° fino a quando non si vede il sangue e l'ago viene visto nella vena sull'ecografia.</li>
	<li>Posizionare il filo guida nell'ago e quindi inserire un introduttore di guaina venosa centrale percutanea 7 Fr sopra il filo guida.</li>
	<li>Rimuovere il filo guida mantenendo l'introduttore della guaina in posizione, quindi inserire un catetere Swans-Ganz per garantire misurazioni della gittata cardiaca e cateterismo cardiaco destro. NOTA: La vena giugulare sinistra può essere utilizzata al posto di quella destra. Se l'accesso non è possibile, inserire la guaina direttamente nella vena giugulare interna (sinistra o destra) dopo la sternotomia della linea mediana. In tal caso, assicurati di sezionare la vena.</li>
	<li>Utilizzando la stessa tecnica, inserire un catetere venoso centrale (ad esempio, doppio lume) nella vena giugulare sinistra.</li>
	<li>Inserire un altro introduttore della guaina venosa centrale percutanea 7 Fr nella vena femorale destra utilizzando la tecnica Seldinger come descritto nei punti 1.7. a 1.10., per l'introduzione di un catetere di conduttanza nel ventricolo destro (RV). Questo può essere fatto per via percutanea con eco-guida, o dopo sternotomia della linea mediana.</li>
	<li>Consentire un periodo di stabilità per 10 minuti dopo l'intubazione e la manipolazione, quindi misurare i parametri emodinamici e di funzione cardiaca al basale, comprese le pressioni polmonari e sistemiche, la gittata cardiaca, i loop pressione-volume RV e LV e l'ecocardiografia transtoracica.</li>
</ol>2. Stabilire l'accesso chirurgico
<ol><li>Utilizzando una penna per cauterizzazione, eseguire un'incisione della linea mediana dalla regione medio-cervicale allo xifoide. Successivamente, dividere il grasso sottocutaneo, strato per strato, lungo la linea mediana usando l'elettrocauterizzazione per raggiungere il peri-sterno.</li>
	<li>Tagliare intorno alla tacca sternale e usare un dito per ritrarre e spazzare i tessuti molli da sotto lo sterno. Aprire lo sterno con una sega ossea e assicurarsi che lo sterno sia completamente diviso facendo attenzione con la vena sotto la parte superiore dell'osso sternale. Cauterizzare lo sterno e/o applicare cera ossea per garantire un'adeguata emostasi.</li>
	<li>Usando l'elettrocauterizzazione, sezionare e rimuovere il timo sollevandolo dal pericardio. Cauterizzare i vasi che forniscono il timo dall'aorta e la vena cava superiore (SVC) per prevenire il sanguinamento.</li>
	<li>Tagliare con cura il pericardio aperto con il cauterizzazione. Inserire le dita sotto il pericardio durante il taglio per evitare lesioni al cuore.</li>
	<li>Somministrare 300 unità/kg di eparina IV per ottenere un anticoagulante sistemico. Se il test è disponibile, assicurarsi che il tempo di coagulazione attivato (ACT) ˃ 300 s.</li>
</ol>3. Ritiro delle terapie di sostegno vitale e dichiarazione di morte
<ol><li>Somministrare un bolo di 3 mg/kg di propofol IV, quindi interrompere la ventilazione meccanica e scollegare il tubo endotracheale. NOTA: Questo passaggio corrisponde a "Ritiro del supporto vitale" per avviare la perfusione regionale Normothermica. Per le condizioni di eutanasia, fare riferimento alla sezione 8.</li>
	<li>Monitorare la pressione arteriosa e la saturazione periferica di O2 . Iniziare il tempo di ischemia calda funzionale quando la pressione sistolica &lt; 50 mmHg.</li>
	<li>Stabilire l'arresto circolatorio quando c'è asistolia (o fibrillazione ventricolare) e assenza di pulsatilità arteriosa. Avviare una fase di osservazione minima di 5 minuti dopo l'arresto circolatorio (periodo di stand-off) e successivamente dichiarare la morte dell'animale.</li>
</ol>4. Posizionamento della perfusione regionale normotermica toracoaddominale
<ol><li>Usando il cauterizzazione, sezionare attentamente lo spazio aortopolmonare. Ritrarre il tratto di deflusso del RV in modo inferiore, l'arteria polmonare a sinistra e l'aorta a destra per evitare lesioni dirette a quest'ultimo. Prendi un aiuto di assistenti se necessario durante questo passaggio.</li>
	<li>Sezionare e ligare i vasi sovra-aortici per evitare ed escludere la perfusione cerebrale. In alternativa, applicare un grande morsetto incrociato sui vasi.</li>
	<li>Inserire due cateteri da 18 G nelle carotidi bilateralmente distalmente all'occlusione per valutare il potenziale flusso sanguigno al cervello. Raccogliere e misurare il sangue durante l'esperimento e reinfonderlo tramite il circuito NRP.</li>
	<li>Utilizzando il metzenbaum e il forcipe ad angolo retto, sezionare delicatamente tra l'SVC e l'arteria innominata e tra l'IVC e il pericardio. Circondare SVC e IVC usando un nastro ombelicale o una semplice sutura di seta 0 e fissarli con un laccio emostatico.</li>
	<li>Usando una sutura 3-0, posizionare due suture concentriche sull'avventizia dell'aorta ascendente distale; Evitare suture a tutto spessore. Posizionare una sutura a corda di borsa sull'atrio destro (RA). Fissare tutti i punti di sutura con un laccio emostatico.</li>
	<li>Impostare e innescare il sistema NRP in base alle esigenze sperimentali e degli investigatori. Per questo protocollo, utilizzare un circuito ECMO con una pompa centrifuga, innescato con 2 L di soluzione cristallina contenente 500 mg di Solumedrol, 200 mL di bicarbonato di sodio (NaOH) all'8,4%, 300 unità / kg di eparina e 2 g di MgSO4. NOTA: La configurazione utilizzata qui è simile a quella utilizzata dai perfusionisti dell'istituzione presso la divisione di cardiochirurgia.</li>
	<li>Utilizzando una cannula arteriosa da 17 a 21 F, cannulare l'aorta, quindi stringere il laccio emostatico tenendo la sutura del cordone della borsa per fissare la cannula in posizione. NOTA: In alternativa, inserire una cannula ossigenatore a membrana extracorporea (ECMO) utilizzando la tecnica Seldinger per ridurre al minimo la perdita di sangue. Un altro metodo consiste nell'utilizzare una cannula arteriosa di bypass standard. La cannula aortica viene quindi collegata alla linea arteriosa del circuito NRP utilizzando un connettore 3/8-3/8; Garantire la completa deaerazione per evitare l'embolia aerea.</li>
	<li>Crea un'incisione di 5 mm al centro del cordone della borsa sul RA, quindi dilatala usando uno strumento ad angolo piccolo come un angolo retto o uno snap. Coprire l'incisione con un dito per evitare un eccessivo sanguinamento.</li>
	<li>Utilizzare una cannula venosa a doppio stadio per cannulare l'AR, quindi stringere le suture del cordone della borsa usando un laccio emostatico per fissare la cannula in posizione.</li>
	<li>Collegare le cannule alla linea venosa del circuito NRP utilizzando un connettore 1/2-3/8 e garantire la completa deaerazione per evitare una camera di equilibrio nel sistema.</li>
	<li>Assicurarsi che sia trascorso un minimo di 15 minuti tra la dichiarazione di morte e l'inizio della PNR per comprendere il tempo necessario nella preparazione della pratica clinica, nel drappeggio e nell'accesso al cuore.</li>
	<li>Iniziare la PNR 15 minuti dopo l'inizio del tempo di ischemia calda funzionale. Mantenere la normotermia durante tutta la procedura. Regolare progressivamente le portate per raggiungere un indice di perfusione di 2,5 L/min/m2. Riavviare la ventilazione meccanica con un FIO2 del 50% e un televisore di 6 ml/kg. Nota : modificare queste impostazioni in base alla progettazione sperimentale.</li>
	<li>Infondere continuamente 10 μg/kg/min di dopamina e 4 unità/min di vasopressina IV. Utilizzare epinefrina e noradrenalina durante la perfusione iniziale e quindi titolarle secondo necessità per aiutare nella regolazione della pressione mantenendo la pressione arteriosa superiore a 50 mmHg.</li>
</ol>5. Mantenimento della riperfusione e target per lo svezzamento
<ol><li>Riperfondere il cuore per 30 minuti prima di tentare di svezzare per NRP. Se lo svezzamento non ha successo, eseguire altri 15 minuti di riperfusione per supportare con NRP prima di tentare di svezzare nuovamente per un tempo di riperfusione massimo totale di 180 minuti.</li>
	<li>Procedere alla valutazione cardiaca dopo lo svezzamento riuscito. Se lo svezzamento non viene raggiunto dopo questo tempo, interrompere l'esperimento e segnalare il problema. NOTA: Questo dovrebbe essere adattato agli obiettivi di ciascun investigatore.</li>
	<li>Valutare i criteri di svezzamento dei PNR e assicurarsi che tutti i criteri siano soddisfatti come dettagliato nella Tabella 1.</li>
</ol>6. Valutazione del recupero cardiaco
<ol><li>Genera analisi del ciclo pressione-volume (PV) per misurare la contrattilità cardiaca. Il catetere di conduttanza consente misurazioni continue delle relazioni LV-PV.<ol><li>Ottieni registrazioni stazionarie per generare parametri dipendenti dal volume, lavoro di corsa e pressione sviluppata e occludi l'IVC con un nastro ombelicale per generare parametri indipendenti dal volume attraverso l'occlusione, vale a dire il lavoro di precarico reclutabile dell'ictus.</li>
	</ol></li>
	<li>Misurare la pressione venosa centrale, la pressione dell'arteria polmonare, la gittata cardiaca, la pressione RV e la pressione del cuneo capillare polmonare utilizzando il catetere Swans-Ganz introdotto all'inizio dell'esperimento.</li>
	<li>Analizzare la funzione cardiaca attraverso l'ecocardiografia utilizzando una sonda transesofagea standard e una sonda transtoracica posizionata direttamente sul cuore.</li>
	<li>Eseguire valutazioni metaboliche raccogliendo campioni di sangue arterioso e venoso per le analisi. Prelevare il sangue direttamente dal seno coronarico per valutare specificamente la funzione metabolica del cuore. Analizzare i gas del sangue e i livelli di lattato.</li>
	<li>Inoltre, raccogliere biopsie miocardiche dal camper e LV, se necessario. Ottenere campioni da altri organi trapiantabili di interesse (ad esempio, polmoni, fegato, reni), a seconda degli obiettivi dello sperimentatore.</li>
</ol>7. Rimozione della PNR e valutazione cardiaca
<ol><li>Quando i criteri di svezzamento sono soddisfatti, interrompere il PNR. Rimuovere la cannula dalla RA e stringere rapidamente la sutura del cordone della borsa per ridurre al minimo la perdita di sangue. Fissare la sutura con nodi e seguire la stessa procedura per rimuovere la cannula aortica.</li>
	<li>Valutare la funzione cardiaca ogni 30 minuti per 2 ore dopo l'interruzione della PNR come descritto nei passaggi 6.1. al punto 6.4.</li>
</ol>8. Terminazione dell'esperimento
<ol><li>Dopo 2 ore, posizionare un catetere cardioplegia da 16 G o 18 G nell'aorta ascendente. Collegare la cannula al circuito NRP.</li>
	<li>Successivamente, decomprimere le cavità cardiache destra incidendo l'IVC e le cavità sinistre incidendo l'atrio sinistro usando il cauterizzazione.</li>
	<li>Bloccare l'aorta ascendente dopo l'inserimento della cannula e somministrare 1,5 L di soluzione di cardioplegia Del Nido a 4 °C al cuore. Assicurarsi che la pressione di perfusione sia di 50 mmHg.</li>
	<li>Interrompere la ventilazione meccanica e posizionare la granita di ghiaccio (0,9% NaCl) nella cavità toracica dopo l'inizio della cardioplegia per il raffreddamento. Procedere con la cardiectomia in modo tradizionale una volta completata l'infusione di cardioplegia.</li>
	<li>Utilizzare il cuore raccolto per ottenere ampie biopsie miocardiche per la valutazione e la valutazione. Eseguire altre biopsie da altri organi (ad esempio, polmoni, fegato, reni) a seconda del disegno sperimentale e dell'obiettivo dei ricercatori NOTA: la Figura 1 fornisce un riepilogo dei passaggi del protocollo illustrati e la Tabella 1 fornisce la definizione dei parametri e dei criteri utilizzati in questo studio.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64009/64009fig01.jpg"> Figura 1: Riassunto schematico del protocollo sperimentale. Abbreviazioni: NRP = Normothermic Regional Perfusion. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64009/64009fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Definizione/Criteri</td>
		</tr><tr><td>Periodo di ischemia calda funzionale</td>
			<td>Periodo che inizia quando la pressione sistolica &lt; 50 mmHg e termina quando viene iniziato il NRP. In questo protocollo, questo periodo è di 15 minuti</td>
		</tr><tr><td>Arresto circolatorio</td>
			<td>Si stabilisce quando il cuore è in asistolia o in fibrillazione ventricolare</td>
		</tr><tr><td>Periodo di stand-off</td>
			<td>Periodo che inizia con l'arresto circolatorio e termina con la dichiarazione di morte. In questo protocollo, questo periodo è di 5 minuti</td>
		</tr><tr><td rowspan="6">Svezzamento di successo del PNR</td>
			<td>Uso minimo di inotropi e vasopressori</td>
		</tr><tr><td>CI &gt; 2,2 L/min/m2</td>
		</tr><tr><td>MAPPA &gt; 55 mmHg</td>
		</tr><tr><td>RAP &lt; 15 mmHg</td>
		</tr><tr><td>PCWP &lt; 15 mmHg</td>
		</tr><tr><td>Normale funzione LV e RV</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Definizione rappresentativa dei parametri e dei criteri utilizzati in questo protocollo. Abbreviazioni: CI = Indice cardiaco; MAP = pressione arteriosa media; NRP = Perfusione regionale normadremica; PCWP = Pressione del cuneo capillare polmonare; RAP = Pressione atriale destra.

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<li>Aceros, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celastrol-type+HSP90+modulators+allow+for+potent+cardioprotective+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Celastrol-type HSP90 modulators allow for potent cardioprotective effects.</a> Life Sciences. 227, 8-19 (2019).</li>
<li>Aceros, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-clinical+model+of+cardiac+donation+after+circulatory+death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Pre-clinical model of cardiac donation after circulatory death.</a> Journal of Visualized Experiments. (150), e59789(2019).</li>
<li>Der Sarkissian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celastrol+protects+ischaemic+myocardium+through+a+heat+shock+response+with+up-regulation+of+haeme+oxygenase-1%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Celastrol protects ischaemic myocardium through a heat shock response with up-regulation of haeme oxygenase-1.</a> British Journal of Pharmacology. 171 (23), 5265-5279 (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo manoscritto descrive una donazione di un modello di animali di grandi dimensioni dopo morte circolatoria (DCD) seguita da perfusione regionale normotermica toracoaddominale. In questo esperimento, il cuore viene riperfuso per un minimo di 30 minuti e un massimo di 3 ore prima di essere svezzato dal circuito ECMO. Il cuore funziona quindi da solo per 2 ore, il che consente una preziosa valutazione cardiaca a breve termine. Pertanto, il principale limite di questo protocollo è il follow-up a breve termine; Tuttavia,...

Oltre 300.000 individui muoiono in Nord America ogni anno per insufficienza cardiaca (HF); Il trapianto cardiaco rimane l'unica opzione di trattamento per alcuni di questi pazienti con malattia allo stadio terminale1. Storicamente, la fonte esclusiva per il trapianto di cuore erano i cuori dei donatori ottenuti dopo la determinazione neurologica della morte (NDD), ma anche allora, solo circa il 40% era adeguato per il trapianto2. Tra il 15% e il 20% dei pazienti muore in attesa di una donazione di cuore, con la carenza di cuori donatori che è uno dei motivi che crea una discrepanza tra i cuori disponibili e i cuori necessari2. Al fine di aumentare il pool di donatori di organi, una considerazione importante è l'uso di cuori donati dopo la morte circolatoria (DCD)3. C'è riluttanza a usare cuori DCD perché questi organi sono invariabilmente sottoposti a un periodo di ischemia non protetta (calda) dopo la cessazione della circolazione sanguigna e possono sostenere danni irreversibili. Sebbene esistano rapporti per il successo del trapianto di cuore DCD con eccellenti risultati precoci4,5, è necessario sviluppare un metodo di valutazione convalidato per determinare se questi cuori sono utilizzabili e per prevedere potenzialmente le loro prestazioni post-trapianto 6,7. Per limitare i periodi ischemici dei cuori DCD e monitorarli continuamente durante lo stoccaggio e il trasporto, sono stati sviluppati sistemi di perfusione cardiaca ex situ 8. Tuttavia, questa tecnologia si basa su macchine complesse con apparecchiature di perfusione e ha un costo iniziale elevato senza alcuna garanzia che l'organo acquistato sia adatto al trapianto. Un nuovo protocollo per il trapianto di cuore DCD basato sulla perfusione regionale normotermica (NRP) è stato proposto da Messer et al3. Questa tecnica comporta il ripristino della perfusione miocardica mentre il cuore è ancora nel donatore ed esclude la circolazione cerebrale. Consente una valutazione funzionale in situ prima dell'appalto3.
Quando si utilizzano modelli di animali di grandi dimensioni, il cuore suino è una delle piattaforme preferite per eseguire ricerche cardiochirurgiche considerando la sua somiglianza anatomica con il cuore umano. Tuttavia, alcuni fattori importanti nei cuori suini dovrebbero essere considerati quando si utilizza questo modello. Ad esempio, il tessuto cardiaco suino è molto fragile e friabile ed è soggetto a lacrime, specialmente nell'arteria polmonare e nell'atrio destro9. Un altro fattore importante da considerare è che il cuore suino è molto sensibile all'ischemia e incline alle aritmie, motivo per cui gli antiaritmici dovrebbero essere somministrati di routine a ogni animale prima dell'esperimento; Tuttavia, è ancora considerato un modello appropriato per lo studio dell'ischemia acuta nel trapianto di cuore9.
Questo manoscritto descrive un modello di donazione di animali di grandi dimensioni (suini) dopo morte circolatoria seguita da perfusione regionale normotermica toracoaddominale che simula da vicino lo scenario clinico nel trapianto di cuore e ha il potenziale per facilitare nuovi studi terapeutici e strategie per la ricerca traslazionale.

<table><tbody><tr><td>Amiodarone</td><td></td><td></td><td>Come disponibile nell'istituto</td></tr><tr><td>Angiocath 20G</td><td>BD</td><td>381704</td><td></td></tr><tr><td>Atropina 0,4 mg/mL</td><td></td><td></td><td>Come disponibile nell'istituto</td></tr><tr><td>Pompa centrifuga Biomedicus</td><td>Soluzione per</td> cardioplegia Medtronic <td></td><td></td></tr><tr><td>(Del Nido)</td><td>realizzata internamente</td><td></td><td>Un'altra soluzione può essere utilizzata a discrezione del ricercatore</td></tr><tr><td>Matita per cauterizzazione</td><td>Covidien</td><td>E2515H</td><td></td></tr><tr><td>Catetere venoso centrale a doppio lume</td><td>Cook Medical</td><td>C-UDLM-501J-LSC</td><td></td></tr><tr><td>Introduttore per guaina venosa centrale 7 Fr</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Catetere <td></td><td></td><td></td><td>a conduttanza</td></tr><tr><td>CPB confezione</td><td>Medtronic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DLP Cannula per radice aortica</td><td>Medtronic</td><td>12218</td><td></td></tr><tr><td>Cannula venosa a doppio stadio DLP (29 o 37 F)</td><td>Medtronic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dobutamina</td><td></td><td></td><td>Disponibile nell'istituto</td></tr><tr><td>Opamina</td><td></td><td></td><td>Disponibile nell'istituto</td></tr><tr><td>Elettrodo Polihesive</td><td>Covidien</td><td>E7507</td><td></td></tr><tr><td>Cannula arteriosa EOPA (17 o 21 F)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Epinefrina</td><td></td><td></td><td>Come disponibile nell'istituto</td></tr><tr>Maschera <td></td><td></td><td>facciale O2</td><td>Come disponibile nell'istituto</td></tr><tr><td>Guanti, nitrile, medio</td><td>Fischer</td><td>27-058-52</td><td></td></tr><tr><td>Eparina 1000 UI/mL</td><td></td><td></td><td>Come disponibile nell'istituto</td></tr><tr><td>Isofurano</td><td></td><td></td> inalato <td>Fornito dalla struttura per animali dell'istituto</td></tr><tr><td>Catetere Jelco 16 o 18 G</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketamina iniettabile Flaconcino da 50 ml (100 mg/mL)</td><td>Health Canada</td><td>È richiesta l'approvazione di Health Canada</td><td></td></tr><tr><td>Lidocaina/Xilocaina 1%</td><td></td><td></td><td>Come disponibile nell'istituto</td></tr><tr><td>Solfato di magnesio 5 g/10 mL</td><td></td><td></td><td>Come disponibile nell'istituto</td></tr><tr><td>Midazolam inj. Flaconcino da 10 ml (5 mg/mL)</td><td>Health Canada</td><td></td><td>È richiesta l'approvazione di Health Canada</td></tr><tr><td>MPS Quest delivery confezione monouso</td><td>Quest Medical</td><td>5001102-AS</td><td></td></tr><tr><td>Noradrenalina</td><td></td><td></td><td>Disponibile nell'istituto</td></tr><tr><td>Soluzione salina normale (NaCl 0,9%) Sacca da 1 litro</td><td>Baxter</td><td>JB1324</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette 1 mL</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-405</td><td></td></tr><tr><td>Propofol 1 mg/mL</td><td></td><td></td><td>Disponibile nell'istituto</td></tr><tr><td>Rocuronio</td><td></td><td></td><td>Come disponibile nell'istituto</td></tr><tr><td>Set Admin Prim NF PB W/ Valvola di controllo</td><td>Smith Medical</td><td>21-0442-25</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio (NaOH) 8,4%</td><td></td><td></td><td>Come disponibile nell'istituto</td></tr><tr><td>Sofsil 0 rivestito di cera</td><td>Covidien</td><td>S316</td><td></td></tr><tr><td>Solumedrol 500 mg/5 mL</td><td></td><td></td><td>Come disponibile nell'istituto</td></tr><tr><td>Punta di aspirazione</td><td>Covidien</td><td>8888501023</td><td></td></tr><tr><td>Tubo di aspirazione 1/4'' x 120''</td><td>Med-Rx</td><td>70-8120</td><td></td></tr><tr><td>Sutura 3.0 Prolene Blu M</td><td>SH Ethicon</td><td>8523H</td><td></td></tr><tr><td>Sutura 5.0 Prolene BB</td><td>Ethicon</td><td>8580H</td><td></td></tr><tr><td>Sutura Prolene Blum 4-0 SH 36</td><td>Ethicon</td><td>8521H</td><td></td></tr><tr><td>Sutura BB 4.0 Prolene</td><td>Ethicon</td><td>8881H</td><td></td></tr><tr><td>Tubo tracheale, 6,5 mm</td><td>Mallinckrodt</td><td>86449</td><td></td></tr><tr><td>Vasopressina</td><td></td><td></td><td>Come disponibile nell'istituto</td></tr></tbody></table>

modello di donazione su animali di grandi dimensioni dopo morte circolatoria e perfusione regionale normothermica per la valutazione cardiaca

Large-Animal Model of Donation after Circulatory Death and Normothermic Regional Perfusion for Cardiac Assessment

L'aumento della domanda di trapianto cardiaco nel corso degli anni ha alimentato l'interesse per la donazione dopo la morte circolatoria (DCD) per espandere il pool di donatori di organi. Tuttavia, il processo DCD è associato al rischio di lesioni tissutali cardiache a causa dell'inevitabile periodo di ischemia calda. La perfusione regionale normemica (NRP) consente una valutazione degli organi in situ , consentendo l'approvvigionamento di cuori determinati per essere vitali. Qui, descriviamo un modello clinicamente rilevante di DCD su grandi animali seguito da NRP. La morte circolatoria si stabilisce nei suini anestetizzati interrompendo la ventilazione meccanica. Dopo un periodo di ischemia calda prestabilito, viene utilizzato un ossigenatore extracorporeo a membrana (ECMO) per un periodo NRP della durata di almeno 30 minuti. Durante questo periodo di riperfusione, il modello consente la raccolta di varie biopsie miocardiche e campioni di sangue per la valutazione cardiaca iniziale. Una volta svezzato il NRP, è possibile eseguire valutazioni biochimiche, emodinamiche ed ecocardiografiche della funzione cardiaca e del metabolismo prima dell'approvvigionamento di organi. Questo protocollo simula da vicino lo scenario clinico precedentemente descritto per DCD e NRP nel trapianto di cuore e ha il potenziale per facilitare studi volti a ridurre il danno da ischemia-riperfusione e migliorare la conservazione e il recupero funzionale cardiaco.

Questo modello preclinico è stato utilizzato con successo nel nostro istituto per molteplici esperimenti. In primo luogo, abbiamo dimostrato che i cuori DCD, inizialmente riperfusi con NRP, hanno dimostrato un recupero funzionale simile dopo il trapianto rispetto alla donazione convenzionale di cuore battente conservata con celle frigorifere. Inoltre, abbiamo utilizzato questo protocollo per dimostrare che la valutazione funzionale cardiaca dopo NRP era predittiva del recupero post-trapianto. Infine, abbiamo anche studia...

Il protocollo descrive un modello di donazione di animali di grandi dimensioni (suini) dopo morte circolatoria, seguito da perfusione regionale normotermica toracoaddominale che simula da vicino lo scenario clinico nel trapianto di cuore e ha il potenziale per facilitare studi e strategie terapeutiche.

Modello di donazione su animali di grandi dimensioni dopo morte circolatoria e perfusione regionale normothermica per la valutazione cardiaca

The increase in demand for cardiac transplantation throughout the years has fueled interest in donation after circulatory death (DCD) to expand the organ ...

Questo protocollo descrive un ampio modello animale di donazione dopo morte circolatoria seguita da perfusione regionale normotermica toracoaddominale che imita precisamente il trapianto di cuore clinico. Questo potrebbe essere usato per valutare potenziali strategie nella ricerca traslazionale. Il vantaggio principale di questo protocollo è che fornisce un modello preclinico adatto per il trapianto cardiaco date le somiglianze anatomiche e chirurgiche tecniche tra il suino di cinghiale e il cuore umano.Inizia usando una penna cauteria per eseguire un'incisione della linea mediana su un animale anestetizzato dalla regione cervicale centrale allo xifoide. Quindi, dividere il grasso sottocutaneo, strato per strato, lungo la linea mediana usando l'elettrocauterizzazione per raggiungere il peristerno. Dopo aver tagliato intorno alla tacca sternale, utilizzare un dito per ritrarre e spazzare i tessuti molli da sotto lo sterno.Aprire lo sterno con una sega ossea, assicurandosi che lo sterno sia completamente diviso, facendo attenzione alla vena sotto la parte superiore dell'osso sternale. Quindi, cauterizzare lo sterno o applicare cera ossea per garantire un'emostasi adeguata. Successivamente, usando l'elettrocauterizzazione, sezionare e rimuovere il timo sollevandolo dal pericardio e cauterizzare i vasi che forniscono il timo dall'aorta e dalla vena cava superiore per prevenire il sanguinamento.Tagliare con cura il pericardio aperto con cauterizzazione. Durante il taglio, inserire le dita sotto il pericardio per evitare lesioni al cuore. Quindi, somministrare 300 unità per chilogrammo di eparina per via endovenosa per ottenere un'anticoagulazione sistemica.Se il test è disponibile, assicurarsi che il tempo di coagulazione attivato sia superiore a 300 secondi. Somministrare un bolo di tre milligrammi per chilogrammo di propofol per via endovenosa. Quindi, interrompere la ventilazione meccanica e scollegare il tubo endotracheale.Monitorare la pressione arteriosa e la saturazione di ossigeno periferico. Quando la pressione sistolica è inferiore a 50 millimetri di mercurio, iniziare il tempo di ischemia calda funzionale. Stabilire l'arresto circolatorio quando c'è asistolia e assenza di pulsatilità arteriosa.Dopo il ritiro delle terapie di sostegno vitale e la conferma della morte, ritrarre il tratto di deflusso del ventricolo destro inferiormente, l'arteria polmonare a sinistra e l'aorta a destra. Quindi, sezionare attentamente lo spazio polmonare dell'aorta usando la cauterizzazione. Applicare un grande morsetto trasversale sui vasi sopraaortici per evitare ed escludere la perfusione cerebrale.Successivamente, usando la pinza di Metzenbaum e ad angolo retto, sezionare delicatamente tra la vena cava superiore e l'arteria innominata e tra la vena cava inferiore e il pericardio. E cerchiare la vena cava superiore e inferiore usando un nastro ombelicale o una semplice sutura di seta zero e fissarli con un laccio emostatico. Utilizzando una sutura 3-0, posizionare due suture concentriche sull'avventizia dell'aorta ascendente distale, evitando suture a tutto spessore.Quindi, posizionare una sutura a corda di borsa sull'atrio destro prima di fissare tutte le suture con un laccio emostatico. Successivamente, impostare e innescare il sistema di perfusione regionale normotermica. Quindi, cannulare l'aorta usando una cannula arteriosa francese da 17 a 21 e fissarla in posizione stringendo il laccio emostatico, tenendo la sutura del cordone della borsa.Crea un'incisione di cinque millimetri al centro della corda della borsa sull'atrio destro e dilatala usando un piccolo strumento angolato, come un angolo retto o uno scatto. Coprire l'incisione con un dito per evitare un eccessivo sanguinamento. Quindi, utilizzare una cannula venosa a doppio stadio per incannulare l'atrio destro.Quindi, fissare la cannula stringendo le suture del cordone della borsa usando un laccio emostatico. Collegare le cannule alla linea venosa del circuito di perfusione regionale normotermica utilizzando un connettore da mezzo a tre oltre otto pollici, garantendo una completa de-aerazione per evitare una camera di equilibrio nel sistema. Garantire che siano trascorsi almeno 15 minuti tra la dichiarazione di morte e l'inizio della perfusione regionale normotermica per comprendere il tempo necessario nella preparazione della pratica clinica, nel drappeggio e nell'accesso al cuore.15 minuti dopo l'inizio del tempo di ischemia calda funzionale, avviare la perfusione regionale normotermica e regolare progressivamente le portate per raggiungere un indice di perfusione di 2,5 litri al minuto per metro quadrato. Riavviare la ventilazione meccanica con una frazione del 50% di ossigeno inspirato e sei millilitri per chilogrammo di volume corrente. Quando i criteri di svezzamento sono soddisfatti, interrompere la perfusione regionale normotermica.Rimuovere la cannula dall'atrio destro e stringere rapidamente la sutura del cordone della borsa per ridurre al minimo la perdita di sangue. Fissare la sutura con i nodi. Quindi seguire la stessa procedura per rimuovere la cannula aortica.Analizzare la funzione cardiaca attraverso l'ecocardiografia utilizzando una sonda transesofagea standard e una sonda transtoracica posizionata direttamente sul cuore. Risultati rappresentativi della funzione cardiaca hanno dimostrato un significativo declino della funzione cardiaca dopo la donazione dopo la morte circolatoria. Tuttavia, questi organi hanno dimostrato un recupero funzionale simile dopo il trapianto rispetto ai cuori trapiantati convenzionalmente.Le misurazioni dell'ossimetria cerebrale durante la perfusione regionale normotermica con i vasi sopraaortici bloccati hanno confermato l'assenza di un'adeguata perfusione cerebrale, mentre le misurazioni della compliance polmonare durante la perfusione regionale normotermica e dopo lo svezzamento dal supporto non hanno mostrato alcun cambiamento significativo rispetto al basale. Lo sviluppo di questa tecnica ha introdotto l'importanza di valutare la trapiantabilità di altri organi come i polmoni, i reni e il fegato nel contesto della donazione dopo morte circolatoria e perfusione regionale normotermica.

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Modello di donazione su animali di grandi dimensioni dopo morte circolatoria e perfusione regionale normothermica per la valutazione cardiaca (Video) | JoVE Journal

Modello di donazione su animali di grandi dimensioni dopo morte circolatoria e perfusione regionale normothermica per la valutazione cardiaca

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