Un semplice protocollo di analisi dei pozzi per visualizzare e quantificare il riassorbimento osteoclastico in vitro

Il nostro protocollo descrive un metodo semplice e affidabile per un test di riassorbimento osteoclastico. L'uso di piastre di coltura cellulare rivestite di fosfato di calcio può essere facilmente preparato e visualizzato utilizzando i materiali disponibili in laboratorio. A differenza delle fette opache di ossa o dentine, il rivestimento in fosfato di calcio consente la visualizzazione di pozzi di riassorbimento e cellule allo stesso tempo.

In questo protocollo, utilizziamo PBMC per la differenziazione degli osteoclasti. Tuttavia, può anche essere applicato ad altri tipi di cellule come i monociti derivati dal midollo osseo o le cellule Raw 264.7. Per prima cosa prendi una piastra di coltura cellulare a fondo piatto da 96 pozzi e pipetta 300 microlitri di soluzione di fosfato di calcio precedentemente preparata in ciascun pozzetto.

Quindi, coprire la piastra con il coperchio e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per tre giorni. Dopo tre giorni, aspirare la soluzione di precalcificazione dalle piastre di coltura cellulare pre-calcificate a 96 pozzetti e aggiungere 300 microlitri di soluzione di fosfato di calcio a ciascun pozzetto. Coprire le piastre con un coperchio e incubare a 37 gradi Celsius per un giorno.

Quindi capovolgere la piastra per versare la soluzione e lavare accuratamente la piastra tre volte con acqua deionizzata. Asciugare immediatamente la piastra utilizzando un asciugacapelli o anidride carbonica compressa o azoto gassoso per mantenere una superficie uniforme. Ora, irradiare la piastra rivestita su un banco pulito con raggi ultravioletti per un'ora.

Utilizzare immediatamente la piastra rivestita o sigillare la piastra con Parafilm e conservarla a temperatura ambiente. Diluire 15 millilitri di sangue fresco con un volume uguale di PBS e mescolarli invertendo o pipettando più volte. Quindi prendere 15 millilitri di soluzione di gradiente di densità in un tubo conico da 50 millilitri, inclinare il tubo e stratificare accuratamente 30 millilitri di campione di sangue diluito sulla soluzione di gradiente di densità da 15 millilitri.

Successivamente, centrifugare il tubo in un rotore a benna oscillante senza interruzione a 810 volte G per 20 minuti a 20 gradi Celsius. Quindi aspirare lo strato superiore lasciando indisturbato lo strato di cellule mononucleate all'interfaccia. Trasferire con attenzione lo strato cellulare mononucleare in un nuovo tubo conico da 50 millilitri.

Riempire il tubo con PBS, mescolare e centrifugare a 300 volte G per 10 minuti a 20 gradi Celsius. Sospendere nuovamente i PBMC in un alfa-MEM completo contenente 20 nanogrammi per millilitro fattore stimolante la colonia di macrofagi e seminare 2,5 volte 10 fino alla quinta cellula per centimetro quadrato PBMC in un pallone. Incubare le piastre rivestite di fosfato di calcio con 50 microlitri di siero bovino fetale a 37 gradi Celsius per un'ora.

Quindi, lavare il pallone due volte con PBS per staccare i precursori dell'osteoclasti da cellule morte o non aderenti, quindi aggiungere quattro millilitri di tripsina per pallone da 75 centimetri quadrati. Dopo 30 minuti, interrompere la digestione aggiungendo quattro millilitri di alfa-MEM completo, quindi staccare accuratamente le cellule usando un raschietto cellulare. Trasferire le celle in un tubo da 50 millilitri e contare il numero totale di celle utilizzando una camera di conteggio.

Centrifugare il tubo a 350 volte G per sette minuti per pellettizzare le celle e risuscimare il pellet e completare alfa MEM contenente M-CSF e RANKL per ottenere una volta 10 alle sei celle per millilitro. Aspirare il siero bovino fetale dalla piastra rivestita di fosfato di calcio e pipettare 200 microlitri di sospensione cellulare per pozzetto. Dopo l'incubazione, lavare le cellule due volte con PBS.

Fissare le cellule con il 4% di paraformaldeide per 10 minuti e lavare di nuovo con PBS. Per la colorazione, aggiungere un tampone di permeabilizzazione alle cellule fisse e incubarle per cinque minuti. Per colorare i filamenti di actina, incubare le cellule con 100 microlitri di Alexa Fluor 546 soluzione di falloidina marcata in PBS per 30 minuti, quindi aspirare la soluzione colorante e macchiare i nuclei usando 100 microlitri di Hoechst per 10 minuti.

Rivestimento in fosfato di calcio colorato con 100 microlitri di calceina micromolare e PBS per 10 minuti. Dopo aver lavato tre volte con PBS, cattura le immagini. Per la colorazione von Kossa del rivestimento in fosfato di calcio aggiungere 50 microlitri di nitrato d'argento al 5% e acqua deionizzata a ciascun pozzo e incubare la piastra sotto radiazione ultravioletta per un'ora fino a quando il rivestimento sul fondo dei pozzetti è diventato marrone.

Il rivestimento di fosfato di calcio nella parte inferiore delle piastre del pozzo 96 sembrava essere uniforme e ben aderente. Dopo nove giorni di coltura in M-CSF e RANKL sulle piastre rivestite di fosfato di calcio, i precursori degli osteoclasti hanno formato pozzi di riassorbimento e grandi osteoclasti. Gli osteoclasti multinucleati situati nelle fosse esprimevano alti livelli di TRAP.

Gli osteoclasti maturi hanno mostrato la presenza di tre o più nuclei e l'anello di actina distinto. Il rivestimento verde di fosfato di calcio ha mostrato la presenza di pozzi di riassorbimento nero. Le immagini di fluorescenza dell'area della fossa sono state misurate utilizzando lo strumento di soglia dell'immagine J.Il numero e le dimensioni degli osteoclasti sono stati calcolati utilizzando il ROI manager e lo strumento di selezione dei poligoni dell'immagine I precursori di J.Osteoclasts cresciuti in assenza di RANKL non potevano formare pozzi di riassorbimento, tuttavia M-CSF e RANKL hanno facilitato la formazione di fosse osteoclastogeniche.

E l'area della fossa è stata quantificata utilizzando l'immagine J.Asciugare immediatamente la piastra rivestita con flusso d'aria aiuta a creare un rivestimento uniforme di fosfato di calcio. Altrimenti è incline a formare un rivestimento più spesso nel mezzo del pozzo.